高中生物競(jìng)賽：蛋白組學(xué) 第二章 第二節(jié)蛋白質(zhì)的電泳分離技術(shù)課件

1第二章:蛋白質(zhì)的電泳分離技術(shù)蛋白組學(xué)課程之第二節(jié)實(shí)驗(yàn)儀器部分2實(shí)驗(yàn)儀器－電泳設(shè)備IPGphorTMisoelectricfocusingsystemHoeferSE600(standardvertical)EPS601PowerSupply3IPG膠的材料是Immobilines，為擁有CH2=CH-CO-NH-R結(jié)構(gòu)的8種丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基團(tuán)，它們構(gòu)成了分布在pH3~10不同值的緩沖體系。實(shí)驗(yàn)儀器－膠條槽、干膠條4實(shí)驗(yàn)儀器-其它設(shè)備紫外分光光度計(jì)離心機(jī)脫色搖床5蛋白質(zhì)一向電泳試劑提取液：含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中（終體積為5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。平衡緩沖液：1.5MTris-Cl6.7ml(pH8.8)，尿素72.07g，87％的甘油69ml，SDS4g，溴酚藍(lán)少許。溶漲液：尿素12g，CHAPS0.5g，溴酚藍(lán)少許溶于無(wú)菌水中，總體積為25ml。使用之前再加入IPG緩沖液0.5ul/100ul，DTT1.5ul/100ul。實(shí)驗(yàn)試劑6蛋白質(zhì)二向電泳試劑

丙烯酰胺單體儲(chǔ)液：丙烯酰胺60g，甲叉雙丙烯酰胺1.6g，溶于無(wú)菌水中，總體積200ml

分離膠緩沖液：Trisbase181.5g，溶于750ml無(wú)菌水中，調(diào)PH8.8，總體積1000ml10％SDS：5gSDS溶于無(wú)菌水中，總體積50ml10％過(guò)硫酸銨：0.1g溶于無(wú)菌水中，總體積1mlSDS電泳緩沖液：Tris-base15.1g，甘氨酸72.1g，SDS5g，溶于無(wú)菌水中，總體積5000ml

封膠溶液：SDS電泳緩沖液100ml，瓊脂糖0.5g，溴酚藍(lán)少許實(shí)驗(yàn)試劑7蛋白質(zhì)定量（Bradford方法）試劑

Bradford儲(chǔ)存液：100ml95％乙醇；200ml88％磷酸；350mgServaG藍(lán)，室溫下長(zhǎng)期保持穩(wěn)定。

Bradford工作液：425ml雙蒸水；15ml95％乙醇；30ml88％磷酸；30mlBradford儲(chǔ)存液濾紙過(guò)濾，棕色瓶中室溫保存，可保存數(shù)周，但在使用前需要過(guò)濾。

1mg/ml牛血清蛋白（BSA）實(shí)驗(yàn)試劑8蛋白質(zhì)樣品制備蛋白質(zhì)定量（Bradford法）蛋白質(zhì)分離獲得感興趣蛋白質(zhì)組分雙向電泳實(shí)驗(yàn)流程樣品的制備一向等電聚焦一向等電聚焦到二向電泳的平衡SDS電泳凝膠的染色凝膠的圖像處理分析9（1）取植物材料放入預(yù)冷研缽后，加入液氮，充分研磨至粉末狀。（2）于1.5mL離心管中加入3倍體積的提取緩沖液，將粉末加入到離心管中，混勻后在-20℃的條件下過(guò)夜。（3）4℃，40000g，離心1hr，棄上清。(4）使沉淀重懸浮于等體積的預(yù)冷丙酮（含0.07%的β-巰基乙醇）中，4℃，40000g，離心1hr（可重復(fù)一次）。（5）真空干燥沉淀。（6）將沉淀用最小體積的裂解液充分溶解，其間可漩渦振蕩助溶。（7）15℃，40000g，離心1hr，上清即為獲得的蛋白質(zhì)樣品，可分裝放入-80℃?zhèn)溆?，臨時(shí)保存可在4℃。（8）Brandford法蛋白定量。實(shí)驗(yàn)步驟－蛋白質(zhì)樣品制備101．上樣：一般采取加樣品溶漲法，取大約30-60μg的蛋白與溶脹液混合，總體積為250μL。蛋白與溶脹液混合物加入膠條槽從酸性端去掉膠條的保護(hù)膜放置膠條：膠條酸性端（尖端）朝膠條槽陽(yáng)極（尖端）方向放入膠條槽，慢慢下壓，最后放下膠條堿性端（平端），使溶液浸濕整個(gè)膠條，避免生成氣泡。在膠條上覆蓋適量的覆蓋油，蓋上蓋子。將膠條槽平放于IPGphor儀器上，與水平方向垂直，如是多個(gè)膠條槽注意相互平行實(shí)驗(yàn)步驟－一向等電聚焦112．第一向等電聚焦設(shè)置IPGphor儀器的運(yùn)行參數(shù)。工作溫度20℃，每膠條最大電流50μA，以下為電壓設(shè)定情況：電壓（V）升壓模式電泳時(shí)間30Step-n-hold12hr200Step-n-hold1hr500Step-n-hold1hr1000Step-n-hold1hr8000Gradient3hr3．一向到二向膠條的平衡將膠條放入10mL平衡緩沖液Ⅰ中（含1%DTT）封口，在搖床上振蕩15min。將膠條取出放入10mL平衡緩沖液Ⅱ中（含2.5%碘乙酰胺）封口，在搖床上振蕩15min。去離子水潤(rùn)洗膠條一秒鐘，將膠條的邊緣置于濾紙上幾min，以去除多余的液體。實(shí)驗(yàn)步驟一向等電聚焦1213144．二向電泳（SDS）（1）灌膠模具的安裝：按儀器說(shuō)明書(shū)裝好灌膠模具。（2）凝膠濃度確定：根據(jù)預(yù)分離蛋白質(zhì)分子量范圍確定需配置的凝膠濃度，主要指分離膠濃度（表4-3-1）。一般實(shí)驗(yàn)中多采用濃度10％或12.5%的分離膠及濃度為5％的濃縮膠，制膠參照下表。表分離膠和濃縮膠的配制藥品濃度10％12.5%5％單體儲(chǔ)液13.3mL16.7mL1.064mL分離膠緩沖液10mL10mL－濃縮膠緩沖液－－2mL10×SDS0.4mL0.4mL0.4mL無(wú)菌水16.1mL12.8mL4.8mL10％過(guò)硫酸銨200μL200μL80μLTEMED13.3μL13.3μL40μL實(shí)驗(yàn)步驟－二向SDS1516（3）灌注分離膠：按配比配制分離膠，配制完成后即可加入到制作好的制膠模具中，該過(guò)程需均勻注入，防止產(chǎn)生氣泡，同時(shí)動(dòng)作要迅速。灌注一定量的分離膠后迅速注入水覆蓋在凝膠溶液上層，將“三明治”充滿(mǎn)。（4）分離膠凝結(jié)后會(huì)形成清晰的膠平面，此時(shí)可參照濃縮膠配方配制濃縮膠。（5）灌注濃縮膠：倒掉覆蓋液，注入濃縮膠。（6）放入平衡好的膠條，并用瓊脂糖封頂。實(shí)驗(yàn)步驟－二向SDS17（7）將固定制膠模具與底座的凸輪取下，用其將上層電泳槽與凝膠模具連接。按照順序依次固定好電泳設(shè)備。（8）將灌注好的制膠模具放入到盛有1SDS電泳液的電泳槽中，然后在制膠模具內(nèi)注入1SDS電泳液，上槽電泳液為新配制的，約需1L，下槽電泳液可為回收的電泳緩沖液，一般需4L。（9）電泳：可選擇恒壓或恒流方式，通常SDS-PAGE電泳條件為濃縮膠部分為100V，50mA，約30min，分離膠部分為250V，50mA大約需要3hr，電泳溫度為15℃。（10）凝膠的檢測(cè)：當(dāng)溴酚藍(lán)染料遷移到膠的底部邊緣即可結(jié)束電泳，取下膠放入染色盒中進(jìn)行染色。實(shí)驗(yàn)步驟－二向SDS18固定：25ml冰醋酸，100ml甲醇，125ml去離子水，60min。敏化：75ml甲醇，0.5g硫代硫酸鈉（使用之前加入），

17g醋酸鈉，165ml去離子水，30min。清洗：250ml去離子水清洗3次每次5min。銀染：0.625g硝酸銀，250去離子水，（使用之前配制）

20min。顯色：6.25g碳酸鈉，100ul的甲醛（使用之前加入），250ml

去離子水。終止：5%的醋酸。（整個(gè)操作在搖床上進(jìn)行）掃描分析。實(shí)驗(yàn)步驟－凝膠染色（硝酸銀染色）1920凝膠圖像的掃描圖像加工斑點(diǎn)檢測(cè)和定量凝膠配比數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)呈遞和解釋2-DE數(shù)據(jù)庫(kù)的建立分析軟件：ImageMaster2Dplatinumversion5.0實(shí)驗(yàn)步驟－凝膠的圖像分析21導(dǎo)入凝膠圖像22凝膠圖像選點(diǎn)23設(shè)置