miRNAs與破骨細(xì)胞分化相關(guān)的骨代謝疾病,人體解剖學(xué)論文

miRNAs與破骨細(xì)胞分化相關(guān)的骨代謝疾病,人體解剖學(xué)論文miRNAs是長度約22個(gè)核苷酸的小型、單鏈、非編碼核糖核酸，是最重要的基因調(diào)節(jié)因子之一[1].據(jù)最新21.0版miRBase數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì)，從第1個(gè)miRNAlin-4[2]于1993年發(fā)現(xiàn)至今，已發(fā)現(xiàn)的miRNAs達(dá)28645條，幾乎分布于所有的真核生物和部分病毒中，華而不實(shí)人類有4552條。固然編碼miRNAs的基因只占人類基因組數(shù)量的1%,但可調(diào)控超過1/3的蛋白編碼基因[3].miRNAs除可通過與靶基因mRNA的3UTR或5UTR端的特異序列結(jié)合外，可以在蛋白翻譯的延伸和終止階段與多核糖體一起介導(dǎo)mRNA翻譯的抑制效應(yīng)[4],實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控。甚至在應(yīng)激環(huán)境下，miRNAs能提高基因的表示出[5].miRNAs與靶基因組成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化與凋亡，介入個(gè)體發(fā)育、機(jī)體代謝等經(jīng)過，控制細(xì)胞及個(gè)體的重要生命活動(dòng)。miRNAs與破骨細(xì)胞分化miRNAs在骨代謝方面的研究當(dāng)前主要集中于調(diào)控成骨細(xì)胞分化，但最新研究表示清楚miRNAs還介入調(diào)控破骨細(xì)胞的分化和活性。破骨細(xì)胞是由造血干細(xì)胞的單核-巨噬細(xì)胞前體分化而成的唯一具有骨吸收活性的多核細(xì)胞，在骨微環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮著舉足輕重的作用。轉(zhuǎn)錄因子在破骨細(xì)胞分化經(jīng)過中扮演著不可或缺的角色，而miRNAs的靶分子大多是在生長發(fā)育或細(xì)胞分化中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子mRNA.Sugatani等[6]在破骨前體細(xì)胞中利用siRNA干擾miRNAs合成的重要因子DGCR8〔digeorgesyn-dromecriticalregiongene8〕、Dicer、Ago2〔argo-naute2〕,miR-223生成明顯減少，顯著降低破骨細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表示出并阻遏破骨細(xì)胞構(gòu)成，進(jìn)而抑制骨吸收。在最新的一項(xiàng)研究中，Sugatani等[7]發(fā)現(xiàn)DGCR8敲除的破骨細(xì)胞特征性標(biāo)記物和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子均遭到抑制，而在CD11b+-cre/DicerKO小鼠中，成骨細(xì)胞數(shù)量和活性并未受影響，但因破骨細(xì)胞數(shù)量和活性的下降，導(dǎo)致骨硬化病的發(fā)生，再次證明介入miRNAs合成的DGCR8對(duì)破骨細(xì)胞分化的重要性。Mizoguchi等[8]發(fā)現(xiàn)cathepsinK-cre/DicerKO小鼠體內(nèi)和體外構(gòu)成的破骨細(xì)胞數(shù)量及活性下降，骨組織RT-PCR顯示TRAP〔tartrate-re-sistantacidphosphatase〕、NFATc1〔nuclearfactorofactivatedTcells1〕、Ephrinb2遭到不同程度的抑制；BMMs〔bonemarrow-derivedmacrophages/mon-ocytes〕經(jīng)RANKL〔receptoractivatorofnuclearfac-torkappa-Bligand〕誘導(dǎo)24h后，DicerKO組miR-155顯著下降。研究結(jié)果證明這些因子在miRNAs的生物合成中發(fā)揮著重要作用，進(jìn)而影響破骨細(xì)胞的分化。Sugatani等[9]2007年發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞中miR-223表示出低于破骨前體細(xì)胞，且pre-miR-223過表示出能夠完全抑制RAW264.7向破骨細(xì)胞分化。另一項(xiàng)研究卻發(fā)現(xiàn)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染反義miR-223的RAW264.7顯著抑制向破骨細(xì)胞分化[6],提示miR-223對(duì)破骨細(xì)胞分化有雙向調(diào)節(jié)作用，其作用方式可能與其在細(xì)胞的表示出水平有關(guān)。進(jìn)一步研究證明了一個(gè)正反應(yīng)通路PU.1/miR-223/NFI-A/M-CSFR:即M-CSF〔macrophagecolonystimulatingfactor〕誘導(dǎo)的PU.1上調(diào)miR-223,miR-223靶向負(fù)調(diào)控NFI-A〔nuclearfactorI-A〕,NFI-A下調(diào)引起M-CSFR〔macrophagecolony-stimulatingfactorreceptor〕表示出增加，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。Li等[10]在觀察抑制miR-223活性以治療CIA〔collagen-inducedar-thritis〕小鼠有效性的研究中發(fā)現(xiàn)，慢轉(zhuǎn)miR-223靶序列可有效抑制miR-223活性，進(jìn)而上調(diào)NFI-A表示出，阻遏M-CSFR表示出，降低破骨細(xì)胞數(shù)量，增加骨密度，改善類風(fēng)濕異常感覺和狀態(tài)。Mann等[11]研究了miR-155在RAW264.7細(xì)胞向巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化中的作用。向巨噬細(xì)胞分化時(shí)miR-155表示出顯著上調(diào)，向破骨細(xì)胞分化時(shí)miR-155表示出明顯下調(diào)。在RAW264.7中過表示出miR-155,可顯著抑制TRAP+破骨細(xì)胞數(shù)量和骨吸收活性，并可影響破骨細(xì)胞早期的融合，證實(shí)miR-155在調(diào)控破骨細(xì)胞分化中發(fā)揮著重要作用。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，過表示出miR-155可抑制GPNMB、MITF〔microphthalmia-associatedtranscriptionfac-tor〕、PU.1等表示出；而通過干涉使MITF過表示出則可修復(fù)GPNMB的mRNA表示出，熒光素酶活性報(bào)告支持miR-155與MITF的3UTR配對(duì)。此項(xiàng)研究證明了miR-155能夠通過下調(diào)MITF和PU.1而抑制GPNMB和TRAP表示出，進(jìn)而阻遏破骨細(xì)胞分化及骨吸收活性，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分化。Zhang等[12]在研究干擾素抑制破骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，干擾素可誘導(dǎo)miR-155上調(diào)，而miR-155可靶向抑制MITF和SOCS1〔suppressorofcytokinesigna-ling1〕表示出以抑制破骨細(xì)胞分化。以上研究都表示清楚miR-155在破骨細(xì)胞分化經(jīng)過中的重要作用。Sugatani等[13]在研究RANKL誘導(dǎo)BMMs向破骨細(xì)胞分化的miRNA表示出譜時(shí)，發(fā)現(xiàn)有33個(gè)miRNAs下調(diào)，38個(gè)miRNAs上調(diào)，miR-21是兩個(gè)顯著上調(diào)的miRNAs之一。c-Fos和PU.1能夠誘導(dǎo)miR-21生成，通過ChIP〔chromatinimmunoprecipi-tation〕證實(shí)c-Fos可與miR-21啟動(dòng)子結(jié)合。正常表示出miR-21的細(xì)胞中PDCD4〔programmedcelldeath4〕沒有蛋白表示出，卻有mRNA表示出，而在慢轉(zhuǎn)反義miR-21的細(xì)胞中具有PDCD4蛋白表示出，提示miR-21能夠通過轉(zhuǎn)錄后負(fù)向調(diào)節(jié)靶基因PD-CD4的表示出。以上研究結(jié)果揭示了調(diào)控骨髓源性單核巨噬細(xì)胞系向破骨細(xì)胞分化中c-Fos/miR-21/PDCD4這一正反應(yīng)通路。Mizoguchi等[14]通過對(duì)RANKL和未經(jīng)RANKL誘導(dǎo)的BMMs行miRNA陣列分析，miR-31在RANKL誘導(dǎo)24h后顯著上調(diào)，提示miR-31可能介入破骨細(xì)胞的分化。當(dāng)使用miR-31拮抗劑時(shí)，Phal-loidin染色顯示actin環(huán)遭到損壞呈簇狀小環(huán)，而利用RhoA抑制劑能夠修復(fù)miR-31拮抗劑對(duì)actin環(huán)的損傷，顯示RhoA為miR-31靶基因。在分析TNF-〔tumornecrosisfactoralpha〕對(duì)破骨細(xì)胞分化影響時(shí)，Kagiya等[15]通過對(duì)TNF和RANKL共處理和單獨(dú)RANKL處理RAW264.7細(xì)胞行miRNA陣列比擬顯示，新發(fā)現(xiàn)一個(gè)miR-378在破骨細(xì)胞分化經(jīng)過中上調(diào)，共處理組以miR-21、miR-29b、miR-146a、miR-155和miR-210上調(diào)最為顯著。Lee等[16]采用qRT-PCR研究發(fā)現(xiàn)miR-124表示出可隨BMMs經(jīng)RANKL誘導(dǎo)時(shí)間的延長而降低，TargetScan顯示人和小鼠NFATc1的3UTR可與miR-124完全匹配，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染pre-miR-124能夠明顯抑制NFATc1蛋白表示出，而過表示出NFATc1能夠修復(fù)miR-124對(duì)破骨細(xì)胞的阻遏作用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，miR-124還可能通過上調(diào)DC-STAMP影響細(xì)胞融合，下調(diào)RhoA和Rac1可抑制破骨前體細(xì)胞的增殖和遷移能力。Guo等[17]發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞分化經(jīng)過中miR-125a表示出逐步降低，過表示出miR-125a能夠抑制破骨細(xì)胞分化，而抑制miR-125a表示出則促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。靶基因軟件預(yù)測(cè)顯示TRAF6〔TNFreceptor-associat-edfactor6〕的3UTR可與miR-125a不完全匹配，經(jīng)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-125a靶基由于TRAF6.EMSA和ChIP顯示NFATc1可與miR-125a的啟動(dòng)子結(jié)合抑制其生成，過表示出NFATc1能夠抑制miR-125a生成，而沉默NFATc1表示出則增加miR-125a生成。以上結(jié)果闡述了一個(gè)TRAF6/NFATc1/miR-125a生物反應(yīng)經(jīng)過，即：RANKL與破骨細(xì)胞質(zhì)膜上的RANK〔receptoractivatorofnuclearfactorkappa-B〕結(jié)合誘導(dǎo)TRAF6表示出，TRAF6引發(fā)上調(diào)的NFATc1阻遏miR-125a生成，而miR-125a則在轉(zhuǎn)錄后水平抑制TRAF6的蛋白表示出。miRNAs與破骨細(xì)胞分化相關(guān)的骨代謝疾病研究證明miRNAs介入破骨細(xì)胞分化的調(diào)控，而破骨細(xì)胞分化狀態(tài)的異常是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨腫瘤構(gòu)成和腫瘤骨轉(zhuǎn)移等骨代謝疾病發(fā)生的重要病因機(jī)制。Ou等[18]利用深度測(cè)序和iTRAQ蛋白組學(xué)分析了CLCN7〔AG〕突變骨質(zhì)疏松患者的外周血單核細(xì)胞，顯示差異表示出的miRNAs有123種，蛋白質(zhì)有173種，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-320a與ARF1〔ADPribosylationfactor1〕有逐一對(duì)應(yīng)關(guān)系，293T細(xì)胞進(jìn)一步證實(shí)了miR-320a可反向調(diào)控ARF1.Wang等[19]在脛骨平臺(tái)骨折預(yù)后影響因素的研究中發(fā)現(xiàn)，阻遏miR-9和miR-181a能夠促進(jìn)破骨前體細(xì)胞RAW264.7的遷移能力和破骨細(xì)胞的存活率。Sugatani等[20]發(fā)現(xiàn)雌激素可抑制miR-21生成，造成上調(diào)的FasL〔fasligand〕與Fas結(jié)合，介導(dǎo)破骨細(xì)胞的凋亡。而絕經(jīng)后雌激素匱乏可引起miR-21過表示出致破骨細(xì)胞凋亡減少、骨吸收過度活潑踴躍。Wang等[21]研究發(fā)現(xiàn)低BMD的絕經(jīng)后婦女PBMCs〔peripheralbloodmononuclearcells〕中miR-133a表示出上調(diào)，提示人外周血單核細(xì)胞中miR-133a可促進(jìn)其向破骨細(xì)胞分化，可能是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的一個(gè)重要機(jī)制。Cao等[22]近期對(duì)于白種人的類似研究中也發(fā)現(xiàn)，低BMD的絕經(jīng)后婦女miR-422a表示出明顯上調(diào)，提示了miR-422a作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松生物標(biāo)志物的可能性。除此之外，Chen等[23]應(yīng)用miR-NA芯片和qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者CD14+PBMCs中miRNAs表示出譜的差異，華而不實(shí)以miR-503表示出下調(diào)最為明顯，骨量正常的絕經(jīng)后女性CD14+PBMCs可表示出miR-503,降低NFATc1mRNA以抑制破骨細(xì)胞分化；而抑制miR-503表示出則可明顯上調(diào)NFATc1mRNA表示出、促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示：正常小鼠中抑制miR-503表示出可導(dǎo)致骨吸收加強(qiáng)、骨量下降、骨微構(gòu)造毀壞；而在去卵巢小鼠中恢復(fù)miR-503表示出可導(dǎo)致骨密度增加、骨微構(gòu)造改善。RNA22預(yù)測(cè)并經(jīng)熒光素酶報(bào)告基因顯示miR-503可與RANK的3UTR不完全匹配，抑制RANK的翻譯。Nakasa等[24]在研究PBMCs中miRNA的表示出水平與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨毀壞關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染ds-miR146a可抑制c-Jun、PU.1、NFATc1的表示出，降低TRAP〔+〕破骨細(xì)胞數(shù)量和骨吸收面積。免疫熒光顯示轉(zhuǎn)染ds-miR146a組TRAF6熒光基本湮滅，提示miR146a可通過調(diào)節(jié)TRAF6表示出來阻遏破骨細(xì)胞分化。Pauley等[25]比擬了正常人與類風(fēng)濕患者PBMCsmiRNAs表示出情況，發(fā)如今類風(fēng)濕患者PBMCs中miR146a、miR-155、miR-132和miR-16高表示出，提示這些miRNAs可能通過介導(dǎo)破骨細(xì)胞分化能力影響類風(fēng)濕骨毀壞的進(jìn)展。除此之外，研究證明，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者PBMCs的miR-148a表示出上調(diào)。Cheng等[26]應(yīng)用miRNA微陣列及qRT-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)CD14+PBMCs經(jīng)M-CSF和RANKL誘導(dǎo)14d后，在向破骨細(xì)胞分化中有27個(gè)miRNAs表示出發(fā)生變化，華而不實(shí)以miR-148a表示出上調(diào)最顯著且隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長而增加。靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)并經(jīng)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，MAFB〔V-mafmusculoaponeuroticfibrosarcomaoncogenehomologB〕為miR-148a的靶基因，miR-148a與MAFB的3UTR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制MAFB翻譯，間接促進(jìn)NFATc1表示出，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表示清楚，靜脈注射anti-miR-148a能夠抑制骨吸收、增加骨量。在研究破骨細(xì)胞與原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥以及腫瘤骨轉(zhuǎn)移的關(guān)系時(shí)，Krzeszinski等[27]發(fā)現(xiàn)過表示出miR-34a的小鼠表現(xiàn)為低骨吸收和高骨量狀態(tài)，對(duì)于去卵巢以及乳腺癌/皮膚癌骨轉(zhuǎn)移的骨質(zhì)疏松動(dòng)物給予miR-34a納米顆粒治療后后可使模型動(dòng)物的骨質(zhì)疏松異常感覺和狀態(tài)有效緩解，研究表示清楚Tgif2〔transforminggrowthfactor--inducedfactor2〕為miR-34a的直接靶基因，miR-34a作為抑制破骨細(xì)胞分化的強(qiáng)有力因子，有望成為防治骨質(zhì)疏松相關(guān)疾病的潛在靶點(diǎn)。為了討論腫瘤骨轉(zhuǎn)移溶骨性毀壞的機(jī)制，Ell等[28]采用共培養(yǎng)方式方法發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞可有效激活RAW264.7向破骨細(xì)胞分化，行miRNA表示出譜顯示RAW264.7的miR-33a、miR-133a、miR-141、miR-190、miR-219表達(dá)下調(diào)。若在RAW264.7中過表示出上述miRNAs,則NFATc1、cathepsinK蛋白表示出下降，破骨細(xì)胞數(shù)與骨吸收面積均遭到不同程度抑制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，過表示出上述miRNAs可導(dǎo)致骨體積、骨小梁厚度和破骨細(xì)胞數(shù)的下降。在研究多