(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件

*光譜分析法：利用各種化學(xué)物質(zhì)所具有的發(fā)射、吸收或散射光譜系的特征來(lái)確定物質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量的方法。第二章光譜分析法的應(yīng)用吸收光譜分析發(fā)射光譜分析散射光譜分析光譜分析可見(jiàn)分光光度法紫外分光光度法紅外分光光度法原子吸收光譜法熒光分析法火焰光度法比濁法√√√√*光譜分析法：利用各種化學(xué)物質(zhì)所具有的發(fā)射、吸收或散射光譜系1光是電磁波，其能量（輻射能）可以用波長(zhǎng)來(lái)表示第二章光譜分析法的應(yīng)用光是電磁波，其能量（輻射能）可以用波長(zhǎng)來(lái)表示第二章光譜分析2物質(zhì)吸收可見(jiàn)光和紫外光則引起價(jià)電子躍遷物質(zhì)吸收紅外光則引起分子振動(dòng)紫外光譜又稱(chēng)為電子光譜，紅外光譜又稱(chēng)為分子振動(dòng)光譜*分子吸收光譜：當(dāng)光通過(guò)固體、液體或氣體的透明層時(shí)，分子可以選擇性地吸收一定波長(zhǎng)的光，透過(guò)的光譜中就不出現(xiàn)這些波長(zhǎng)的光，這種光譜稱(chēng)為吸收光譜。紫外-可見(jiàn)分光光度法第一節(jié)可見(jiàn)—紫外分光光度法的應(yīng)用物質(zhì)吸收可見(jiàn)光和紫外光則引起價(jià)電子躍遷紫外-可見(jiàn)分光光度法第3吸收光譜的吸收強(qiáng)度在實(shí)驗(yàn)上可用朗伯-比爾（Lambert-Beer）定律來(lái)描述。這條定律是吸收光的基本定律，也是吸收光譜測(cè)量的理論基礎(chǔ)。當(dāng)一束單色光通過(guò)溶液時(shí)，由于溶液吸收了一部分光能，光的強(qiáng)度就要降低，溶液的濃度越大，液層的厚度越大，吸收的光能越多，光強(qiáng)度減弱也越顯著，可用下式來(lái)表示：第二章光譜分析法的應(yīng)用紫外-可見(jiàn)分光光度法吸收光譜的吸收強(qiáng)度在實(shí)驗(yàn)上可用朗伯-比爾（Lambe4吸收度與溶液的濃度及液層的厚度成正比；*吸收系數(shù)（Absorptivity）：?jiǎn)挝粷舛取挝灰簩雍穸鹊奈斩取Ｗ贤?可見(jiàn)分光光度法吸收度與溶液的濃度及液層的厚度成正比；紫外-可見(jiàn)分光光度法5摩爾吸收系數(shù)：指1升溶液中含有1摩爾溶質(zhì)，液層厚度為lcm時(shí)，在指定波長(zhǎng)和一定條件（溶劑、pH、溫度）下的吸收度，用ε表示，單位是克分子-1厘米-1。百分吸收系數(shù)：指100m1溶液中含有1g溶質(zhì)，液層厚度1cm時(shí)，在指定波長(zhǎng)和一定條件下所測(cè)得的吸收度，用或

表示，單位是克-1厘米-1。摩爾吸收系數(shù)與百分吸收系數(shù)的相互關(guān)系為：

M：吸光物質(zhì)的分子量（摩爾質(zhì)量）。紫外-可見(jiàn)分光光度法摩爾吸收系數(shù)：指1升溶液中含有1摩爾溶質(zhì)，液層厚度為lcm6物質(zhì)的吸收系數(shù)與溶劑的種類(lèi)、溶液的pH、溫度以及波長(zhǎng)有關(guān)，測(cè)定時(shí)必需注意，表示吸收系數(shù)時(shí)這些條件應(yīng)注明。測(cè)定吸收系數(shù)時(shí)，將儀器的波長(zhǎng)調(diào)至最大吸收波長(zhǎng)（λmax）處。紫外-可見(jiàn)分光光度法物質(zhì)的吸收系數(shù)與溶劑的種類(lèi)、溶液的pH、溫度以及波長(zhǎng)有關(guān)，測(cè)7一、分析測(cè)定方法1．吸收系數(shù)法在無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，利用或

ε

進(jìn)行定量。從有關(guān)手冊(cè)或藥典中查得化合物的吸收系數(shù)，然后采用與標(biāo)準(zhǔn)品相同的溶劑，配制樣品溶液，在相同波長(zhǎng)下測(cè)定A值，按下式計(jì)算百分含量：在有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下：紫外-可見(jiàn)分光光度法儀器型號(hào)和操作條件一、分析測(cè)定方法1．吸收系數(shù)法在無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，利用82.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法（常用）從待測(cè)物質(zhì)的吸收光譜圖上選定某一最大吸收波長(zhǎng)，用一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液在該波長(zhǎng)處分別測(cè)定它們的吸收度。用吸收度對(duì)濃度作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。在同樣條件下測(cè)定樣品溶液的吸收度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上可求出樣品溶液的濃度。紫外-可見(jiàn)分光光度法2.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法（常用）從待測(cè)物質(zhì)的吸收光譜圖上選定某一最大93.直接比較法（單點(diǎn)校正）凡溶液中待測(cè)物質(zhì)吸收符合吸收定律，則配制一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)其吸收度，再在同樣條件下測(cè)樣品溶液的吸收度，根據(jù)下列公式求出樣品溶液的濃度。

A標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收度C標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度A樣為樣品溶液吸收度C樣為樣品溶液濃度紫外-可見(jiàn)分光光度法3.直接比較法（單點(diǎn)校正）凡溶液中待測(cè)物質(zhì)吸收符合吸收定律104．聯(lián)立方程法若待測(cè)樣品為兩種以上不起化學(xué)反應(yīng)的吸收物質(zhì)，如其吸收光譜并不互相重疊，可按單位組分分析方法，分別在各組分的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定，如其吸收光譜互相重疊，根據(jù)吸收度的加和性原則，混合物的吸收度為各組分吸收度之和，可在各組分的最大吸收波長(zhǎng)處，分別測(cè)混合物吸收度，通過(guò)解聯(lián)立方程的方法求得結(jié)果，如下式：

1221紫外-可見(jiàn)分光光度法4．聯(lián)立方程法若待測(cè)樣品為兩種以上不起化學(xué)反應(yīng)的吸收物質(zhì)，如11靛藍(lán)和靛玉紅的吸收光譜靛藍(lán)在608nm處、靛玉紅在544nm處有最大吸收。根據(jù)Lambert-beer定律A=EC分別計(jì)算出4個(gè)比吸光系數(shù)。當(dāng)波長(zhǎng)為608nm時(shí)，E608靛藍(lán)＝34.6，E608靛玉紅＝6.9；當(dāng)波長(zhǎng)為544nm時(shí)，E544靛藍(lán)＝19.6，E544靛玉紅＝44.6。

當(dāng)溶液為2種物質(zhì)的混合溶液時(shí)：A608＝E608靛藍(lán)×C靛藍(lán)+E608靛玉紅×C靛玉紅A544＝E544靛藍(lán)×C靛藍(lán)+E544靛玉紅×C靛玉紅推導(dǎo)出：C靛藍(lán)＝1.54×10-3×A608－1.87×10-4×A544C靛玉紅＝3.65×10-3×A544－9.41×10-4×A608靛藍(lán)和靛玉紅的吸收光譜靛藍(lán)在608nm處、靛玉紅在54412(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件135．雙波長(zhǎng)分光光度法假設(shè)a為干擾組分，b為被測(cè)組分，虛線(xiàn)則代表吸光度上反映的值。又設(shè)在λ1和λ2處干擾組分的吸光度值相等，于是△A值反映在λ1和λ2處b組分的吸光度差異。

XYx1x2y1紫外-可見(jiàn)分光光度法5．雙波長(zhǎng)分光光度法假設(shè)a為干擾組分，b為被測(cè)組分，虛線(xiàn)則14a的曲線(xiàn)在波長(zhǎng)λ1和λ2處吸收度相等，△Aa＝0；b物質(zhì)的吸收曲線(xiàn)在Al和A2處A值相差很大，為△Ab;混合物在此二波長(zhǎng)的△A即為b物質(zhì)的△Ab（

）;b物質(zhì)的含量則可用在λ1及λ2處測(cè)得的△Ab對(duì)濃度作圖所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上求出。

紫外-可見(jiàn)分光光度法a的曲線(xiàn)在波長(zhǎng)λ1和λ2處吸收度相等，△Aa＝0；15測(cè)定步驟：（1）選擇雙波長(zhǎng)。先用標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)出兩組分各自的吸收曲線(xiàn)，選干擾組分的吸收曲線(xiàn)上某對(duì)稱(chēng)兩點(diǎn)（等吸收波長(zhǎng)）的波長(zhǎng)λ1和λ2，在此二波長(zhǎng)處待測(cè)組分的吸收度應(yīng)有明顯差別。

（2）配制不同濃度的待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品，先在λ1處測(cè)出A1，再在λ2處測(cè)出A2，求出?A。用各種濃度下的?A對(duì)濃度C作圖，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。（3）混合物中待測(cè)組分的含量測(cè)定。在λ1和λ2處分別測(cè)得混合物的A1及A2，求出?A，由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出濃度即為待測(cè)組分濃度。

紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定步驟：紫外-可見(jiàn)分光光度法16可見(jiàn)光區(qū)的波長(zhǎng)范圍為400~760nm，人的視覺(jué)可以察覺(jué)。

二、可見(jiàn)分光光度法分析若兩種顏色的光按其適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度比例混合后可成為白色，則這兩種光色被稱(chēng)為互補(bǔ)色，如綠與紫紅、黃與藍(lán)、橙與青藍(lán)、紅與青。有色溶液呈現(xiàn)的不同顏色，就是由于物質(zhì)對(duì)光具有選擇性吸收所造成的，例如高錳酸鉀溶液由于吸收波長(zhǎng)為500~560nm（綠色光）而顯紫紅色。紫外-可見(jiàn)分光光度法可見(jiàn)光區(qū)的波長(zhǎng)范圍為400~760nm，人的視覺(jué)可以察覺(jué)。17可見(jiàn)分光光度法就是利用有色物質(zhì)吸收光能的特性來(lái)測(cè)定物質(zhì)含量的方法。藥物內(nèi)的各種有效成分或主成分，可用此方法進(jìn)行分析的條件：1.成分本身有色；2.或與一定顯色試劑作用后可形成有色物質(zhì)；3.并且在一定濃度范圍內(nèi)，溶液的吸收度與濃度符合朗伯-比爾定律。

紫外-可見(jiàn)分光光度法可見(jiàn)分光光度法就是利用有色物質(zhì)吸收光能的特性來(lái)測(cè)定物質(zhì)含量的181.黃酮類(lèi)成分的測(cè)定

應(yīng)用實(shí)例（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：精密稱(chēng)取120℃下干燥至恒重的無(wú)水蘆丁10mg，用30%乙醇定容于100ml容量瓶中。分別取上述溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于10ml容量瓶中，加入0.3ml5％亞硝酸鈉溶液，放置6min，加入10％硝酸鋁溶液0.3ml，放置6min，再加入1mol/l的氫氧化鈉溶液4.0ml，30%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min，510nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：Y=0.0018+1.0926XX：所測(cè)的吸光度Y：總黃酮的濃度R=0.9998紫外-可見(jiàn)分光光度法1.黃酮類(lèi)成分的測(cè)定應(yīng)用實(shí)例（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)19

應(yīng)用實(shí)例（2）測(cè)定步驟：精密稱(chēng)取樣品5g，提取，濃縮至近干，蒸餾水溶解后過(guò)濾。濾液用正丁醇萃取至無(wú)黃酮反應(yīng)為止。減壓回收正丁醇至近干，加30％乙醇溶解，過(guò)濾，移至50ml容量瓶中，用30％乙醇定容至刻度，稀釋25倍。精密吸取3ml于10ml容量瓶中，按上述顯色方法顯色，用754紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)于510nm處測(cè)吸光度。（3）樣品測(cè)定應(yīng)用實(shí)例（2）測(cè)定步驟：精密稱(chēng)取樣品5g，提20

應(yīng)用實(shí)例2、環(huán)烯醚萜類(lèi)（桃葉珊瑚苷）的測(cè)定（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：精密稱(chēng)取10mg標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中配成1mg/ml母液，分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml，加蒸餾水至1ml，依次加入1mlApstahl、1ml冰醋酸、2ml乙醇到5ml，80℃水浴中加熱顯色30min，中間搖動(dòng)2~3次；取出流水冷卻1min，然后在601nm處用754型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)溶液吸光度A；以濃度與相應(yīng)的吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為：Y=0.11605A+0.00033R=0.9976紫外-可見(jiàn)分光光度法應(yīng)用實(shí)例2、環(huán)烯醚萜類(lèi)（桃葉珊瑚苷）的測(cè)定紫21

應(yīng)用實(shí)例（2）測(cè)定步驟：精密稱(chēng)取烘干樣品5g，提取、濃縮、用蒸餾水定容于50ml容量瓶中，離心5min，取上清液1ml于25ml容量瓶中稀釋后，取稀釋液1ml，依次加入4ml乙醇、2ml對(duì)二甲氨基苯甲醛試劑（艾氏試劑）、2ml冰醋酸，用蒸餾水定容到10ml，充分搖勻；在80℃水浴中加熱顯色30min，中間搖動(dòng)2～3次；取出試管，管內(nèi)溶液根據(jù)濃度不同呈現(xiàn)不同深度的藍(lán)色，流水冷卻1min，然后在601nm處用分光光度計(jì)測(cè)溶液吸光度A；以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和校正方程計(jì)算樣品中桃葉珊瑚苷含量。（3）樣品測(cè)定

紫外-可見(jiàn)分光光度法應(yīng)用實(shí)例（2）測(cè)定步驟：精密稱(chēng)取烘干樣品5g22紫外-可見(jiàn)分光光度法紫外-可見(jiàn)分光光度法231、顯色化合物的吸收光譜桃葉珊瑚苷與Epstahl試劑在乙醇和醋酸溶液中形成的有色化合物的最大吸收波長(zhǎng)為601nm，吸收曲線(xiàn)見(jiàn)圖。桃葉珊瑚苷的分光光度法測(cè)定具體步驟桃葉珊瑚甙與Epstahl試劑形成的顯色化合物在乙醇和醋酸中的吸收光譜紫外-可見(jiàn)分光光度法1、顯色化合物的吸收光譜桃葉珊瑚苷的分光光度法測(cè)定具體步驟桃242、顯色劑的用量桃葉珊瑚甙含量在2.0×10-2g/L以?xún)?nèi)時(shí)，加1mLEpstahl試劑可使1mL試液中的桃葉珊瑚苷完全形成穩(wěn)定的有色化合物。顯色劑較少時(shí)，吸光度偏低；較多時(shí)影響不大。紫外-可見(jiàn)分光光度法2、顯色劑的用量紫外-可見(jiàn)分光光度法253、冰醋酸用量在醋酸濃度較小時(shí)，隨醋酸濃度的增大，顯色溶液的吸光度增加較多，醋酸濃度較大時(shí)，增大醋酸的濃度，顯色溶液的吸光度增加較少。測(cè)定中1mL試液加入1mL醋酸為宜。加入醋酸還可加快顯色反應(yīng)速度。紫外-可見(jiàn)分光光度法3、冰醋酸用量紫外-可見(jiàn)分光光度法264、顯色溶劑的選擇在水溶液中顯色，溶液為渾濁的藍(lán)色，并很快沉淀。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加入95％乙醇，顯色溶液為清徹的深藍(lán)色，無(wú)沉淀。表明乙醇能夠增大顯色化合物的溶解度而使其穩(wěn)定，因此采用乙醇為顯色溶劑。測(cè)定中1mL試液加人2mL95％乙醇為宜。紫外-可見(jiàn)分光光度法4、顯色溶劑的選擇紫外-可見(jiàn)分光光度法275、顯色溫度和顯色時(shí)間顯色反應(yīng)溫度過(guò)高，溶液沸騰，使溶劑損失嚴(yán)重，以80℃水浴顯色為宜。在該溫度下顯色25～30min后，顯色溶液的吸光度不再增加。紫外-可見(jiàn)分光光度法5、顯色溫度和顯色時(shí)間紫外-可見(jiàn)分光光度法286、顯色化合物的穩(wěn)定時(shí)間在擬定實(shí)驗(yàn)條件下，顯色化合物的吸光度在顯色后1h無(wú)變化，10h后，吸光度略有減小。Epstahl試劑的配制：對(duì)二甲氨基苯甲醛0.25g，冰醋酸50g，35%H3PO45g，水20mL。紫外-可見(jiàn)分光光度法6、顯色化合物的穩(wěn)定時(shí)間紫外-可見(jiàn)分光光度法297、樣品分析稱(chēng)取1.000g干燥杜仲葉粉末，用60%乙醇提取3次，提取液于50mL容量瓶定容。分別吸取100μL桃葉珊瑚苷溶液和提取液，加入Epstahl試劑，80℃加熱30min顯色。在601nm測(cè)定吸光度，根據(jù)工作曲線(xiàn)計(jì)算桃葉珊瑚甙的含量。紫外-可見(jiàn)分光光度法7、樣品分析紫外-可見(jiàn)分光光度法303、藥物中多糖的分光光度法分析1、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備多糖在濃HCl作用下，水解成單糖，和3,5-二硝基水楊酸縮合成有色化合物，可用分光光度法于適宜波長(zhǎng)處測(cè)定多糖含量，本法簡(jiǎn)便，顯色穩(wěn)定，靈敏度高，重現(xiàn)性好。取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品配置成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入3,5-二硝基水楊酸試劑，混勻，放入90℃水浴中加熱10min，取出，流水冷卻，用蒸餾水定容，搖勻，于492nm處測(cè)吸光度。得回歸方程：C＝112.4942A＋36.0148,R=0.9979。式中：C—標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（μg/mL），A—吸光度。紫外-可見(jiàn)分光光度法3、藥物中多糖的分光光度法分析1、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備紫外-可見(jiàn)分312、提取物中多糖的含量測(cè)定精密稱(chēng)取多糖提取物100mg（或從材料中提取多糖），用蒸餾水定容至10mL，精密吸取0.5mL。加入6mol/L的HCl10mL，沸水浴加熱水解30min，冷卻后用6mol/L的NaOH調(diào)pH至中性，加入2mL3,5-二硝基水楊酸試劑，另取一支試管以蒸餾水和3,5-二硝基水楊酸試劑為空白對(duì)照，充分混合后于90℃水浴中顯色10min，492nm測(cè)定A值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算酸性多糖的含量。紫外-可見(jiàn)分光光度法作用？Why?2、提取物中多糖的含量測(cè)定紫外-可見(jiàn)分光光度法作用？Why?32(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件33(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件34紫外-可見(jiàn)分光光度法原理：3,5-二硝基水楊酸在中性或偏堿性條件下與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物（3-氨基-5-硝基水楊酸），在一定范圍內(nèi)，還原糖的量和反應(yīng)液的顏色呈正比。紫外-可見(jiàn)分光光度法原理：35(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件36(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件37(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件38(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件39(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件40三、紫外分光光度法分析利用紫外分光光度法進(jìn)行定量分析具有快速、靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。一般測(cè)試范圍在1％至0.1ppm，準(zhǔn)確度可在2％以?xún)?nèi)。本法不需要顯色劑，因而不受顯色劑、溫度及顯色時(shí)間等因素的影響，操作簡(jiǎn)便。待測(cè)成分在紫外光區(qū)（200~400nm）有吸收，并在測(cè)試濃度范圍內(nèi)服從朗伯-比爾定律者，均可選用。紫外分光光度法三、紫外分光光度法分析利用紫外分光光度法進(jìn)行定量分析具有快速41常用中藥主成分的紫外吸收波長(zhǎng)紫外分光光度法常用中藥主成分的紫外吸收波長(zhǎng)紫外分光光度法42紙色譜分離-紫外分光光度法測(cè)阿魏酸展開(kāi)劑：水洗脫劑：95%乙醇分析波長(zhǎng)：330nm應(yīng)用實(shí)例紫外分光光度法紙色譜分離-紫外分光光度法測(cè)阿魏酸展開(kāi)劑：水應(yīng)用實(shí)例紫外分光43紫外分光光度法紫外分光光度法44第二章光譜分析法的應(yīng)用分光光度法第二章光譜分析法的應(yīng)用分光光度法45第二章光譜分析法的應(yīng)用分光光度法第二章光譜分析法的應(yīng)用分光光度法46第二章光譜分析法的應(yīng)用分光光度法第二章光譜分析法的應(yīng)用分光光度法47(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件48(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件49第二節(jié)紅外分光光度法的應(yīng)用*紅外分光光度法（1nfraredSpectrophotometry）：是以紅外區(qū)域電磁波連續(xù)光譜作為輻射源照射樣品，記錄樣品吸收曲線(xiàn)的一種物理光學(xué)分析方法，又稱(chēng)紅外吸收光譜法。紅外光譜區(qū)一般分為三個(gè)區(qū)域，近紅外光區(qū)，波長(zhǎng)0.75~2.5μm；中紅外區(qū)，波長(zhǎng)2.5~25μm；遠(yuǎn)紅外區(qū)，波長(zhǎng)25~500μm。第二節(jié)紅外分光光度法的應(yīng)用*紅外分光光度法（1nfra50紅外分光光度法紅外吸收光譜突出特點(diǎn)是具有高度的特征性，除光學(xué)異構(gòu)體外，每種有機(jī)化合物都有自己的紅外吸收光譜。有機(jī)化合物中各官能團(tuán)在某一區(qū)域出現(xiàn)吸收譜帶的位置相對(duì)恒定，不受或少受分子中其它部分的影響，這種譜帶稱(chēng)為相應(yīng)官能團(tuán)的特征吸收，可用于有機(jī)官能團(tuán)的鑒定。紅外分光光度法紅外吸收光譜突出特點(diǎn)是具有高度的特征性，除光學(xué)51第二章光譜分析法的應(yīng)用紅外分光光度法紅外光譜主要應(yīng)用在定性鑒別上，若兩個(gè)樣品的光譜完全相同，可以判斷它們是同一化合物。若峰數(shù)不多，且外形較鈍，則可靠性較差。紅外光譜是整個(gè)化合物的分子鑒別，紅外光譜的“指紋”區(qū)更具有鑒別化合物的特征。一、定性分析第二章光譜分析法的應(yīng)用紅外分光光度法紅外光譜主要應(yīng)用在定性52(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件53第二章光譜分析法的應(yīng)用紅外分光光度法第二章光譜分析法的應(yīng)用紅外分光光度法54(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件551.山藥2.參署3.木薯4.番薯1.山藥2.參署3.木薯4.番薯1.山藥2.參署3.木薯4.番薯1.山藥56第二章光譜分析法的應(yīng)用紅外分光光度法

利用紅外分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析，它的理論基礎(chǔ)仍然是朗伯-比爾定律。但有以下缺點(diǎn)。1、光源強(qiáng)度和檢測(cè)器靈敏度比可見(jiàn)和紫外光譜儀小。2、吸收池是由氯化鈉等組成，比較脆弱、其厚度不易確定，表面狀態(tài)也經(jīng)常改變。3、紅外光譜中ε最大不超過(guò)103，可見(jiàn)和紫外吸收光譜中的ε值可達(dá)105，紅外光譜的靈敏度低。二、定量分析第二章光譜分析法的應(yīng)用紅外分光光度法利用紅外分光光57S-410光柵透射型近紅外分光光度計(jì)傅立葉變換紅外光譜儀IR200S-410光柵透射型近紅外分光光度計(jì)傅立葉變換紅外光譜儀58含量測(cè)定方法:1、基線(xiàn)法在吸收峰兩側(cè)選基點(diǎn)P和Q，兩點(diǎn)連線(xiàn)稱(chēng)為基線(xiàn)，通過(guò)峰頂t作垂線(xiàn)rs則：由rs與ts線(xiàn)的長(zhǎng)度，可求出樣品在此波長(zhǎng)下的吸收度。依次配制一系列不同濃度的樣品溶液，在同樣的波長(zhǎng)下測(cè)定吸收度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，利用工作曲線(xiàn)求出樣品的濃度。含量測(cè)定方法:1、基線(xiàn)法由rs與ts線(xiàn)的長(zhǎng)度，可求出樣品在59含量測(cè)定方法:2、固體樣品吸收度法：最簡(jiǎn)便的方法是繪制KBr片中樣品的工作曲線(xiàn)。設(shè)s為壓片的面積，L為厚度，m為壓片中樣品的量，在壓片中的樣品濃度將為：比爾定律：同一模具壓片，S為常數(shù)E/S＝k，則A＝mk。在片中，樣品的吸收度只與片中樣品的量有關(guān)，而與片的厚度無(wú)關(guān)。制備一系列不同含量的片，測(cè)定吸收度，而后繪制工作曲線(xiàn)。3、峰高法：P96含量測(cè)定方法:2、固體樣品吸收度法：比爾定律：同一模具壓片，60第二章光譜分析法的應(yīng)用第三節(jié)熒光分析法的應(yīng)用

用一種波長(zhǎng)的光（如紫外光）照射某物質(zhì)時(shí)，物質(zhì)的分子吸收了該波長(zhǎng)的光后，在很短的時(shí)間內(nèi)（延遲幾納秒至幾微秒）發(fā)射出較照射波長(zhǎng)長(zhǎng)的光，即為熒光。因而熒光光譜是發(fā)射光譜。利用物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)不同，所吸收的紫外光波長(zhǎng)與發(fā)射的熒光波長(zhǎng)也有所不同的特性，可鑒別物質(zhì)。熒光分析法具有靈敏度高（濃度可低至10-4μg/m1）、選擇性好、試樣量少（幾十微克或幾十微升）等特點(diǎn)。

不足之處是干擾因素較多且實(shí)驗(yàn)條件嚴(yán)格。第二章光譜分析法的應(yīng)用第三節(jié)熒光分析法的應(yīng)用61第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法一、激發(fā)光譜與熒光光譜任何發(fā)熒光的分子都具有兩個(gè)特征光譜：激發(fā)光譜和熒光光譜。*激發(fā)光譜：將激發(fā)熒光的光源（紫外光或可見(jiàn)光）用單色器分光，測(cè)定樣品對(duì)每一波長(zhǎng)的激發(fā)光所發(fā)射的熒光強(qiáng)度，以激發(fā)光波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，就可得到熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法一、激發(fā)光譜與熒光光譜62*熒光光譜：用選好的最大激發(fā)波長(zhǎng)作光源，讓物質(zhì)發(fā)生的熒光通過(guò)單色器分光，測(cè)定每一個(gè)波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度對(duì)熒光波長(zhǎng)作圖，得熒光光譜。*熒光光譜：用選好的最大激發(fā)波長(zhǎng)作光源，讓物質(zhì)發(fā)生的熒光通63第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法二、熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

產(chǎn)生熒光的首要條件是物質(zhì)分子必須具有電子吸收光譜的特征結(jié)構(gòu)，其次是必須具有一定的熒光效率和合適的環(huán)境。

熒光通常發(fā)生于具有共軛雙鍵體系的分子，體系中電子共軛度越大，非定域π電子越易被激發(fā)，就越易產(chǎn)生熒光，且熒光光譜將向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng)。任何有利于提高π電子共軛程度的結(jié)構(gòu)改變，都能提高熒光效率、或使熒光波長(zhǎng)紅移。例如蒽：熒光效率0.36：熒光波長(zhǎng)402nn，9-乙烯基蒽：熒光效率0.76；熒光波長(zhǎng)432nm。第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法二、熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)64第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法

三、熒光強(qiáng)度

熒光強(qiáng)度與樣品濃度呈線(xiàn)性關(guān)系，與物質(zhì)本身的熒光效率及激發(fā)光強(qiáng)度成正比。熒光效率愈大，熒光強(qiáng)度愈強(qiáng)。激發(fā)光源愈強(qiáng)，產(chǎn)生的熒光愈強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度愈高。但很強(qiáng)的光源易使樣品光分解，通常使用中等強(qiáng)度的激發(fā)光?；衔锏哪栁障禂?shù)越大，其產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法三、熒光強(qiáng)度65第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法四、測(cè)定儀器測(cè)定熒光的儀器，常用的有目測(cè)熒光計(jì)、光電熒光計(jì)和熒光分光光度計(jì)等。其基本結(jié)構(gòu)都是由激發(fā)光源、單色器、樣品池與檢測(cè)系統(tǒng)組成的。熒光分光光度計(jì)基本結(jié)構(gòu)和原理圖AmincoBowmanSeries2型熒光分光光度計(jì)第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法四、測(cè)定儀器熒光分光光66第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法五、影響熒光強(qiáng)度的外界因素*1、溶劑溶劑的極性顯著地影響熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度。通常溶劑極性增大，對(duì)n-π共扼的熒光物質(zhì)，n-π*躍遷所需能量增加，躍遷兒率減少，熒光強(qiáng)度減弱，這些物質(zhì)的熒光測(cè)定，宜用非極性溶劑。相反，對(duì)π-π*共扼的熒光物質(zhì)，π-π*躍遷所需能量減小，躍遷幾率增加，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。含有重原子的溶劑如四溴化碳、碘乙烷等，使化合物的熒光大為減弱，應(yīng)盡可能避免使用這類(lèi)溶劑。通常配制溶液時(shí)，使用的溶劑除水外，常用的還有乙醇、環(huán)乙烷、四氯化碳、氯仿等。這些溶劑中常含有熒光雜質(zhì)，影響測(cè)定，必須經(jīng)過(guò)凈化處理后方可使用。第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法五、影響熒光強(qiáng)度的外界67第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法2、溫度：

通常溶液的熒光強(qiáng)度隨溫度的降低而增強(qiáng)。

如熒光素鈉的乙醇溶液，在0℃以下每降低10℃、熒光效率增加3％。這主要是因?yàn)樵谌芤簻囟认陆禃r(shí)，介質(zhì)粘度增加，熒光物質(zhì)分子與溶劑分子的碰撞也隨之減少的緣故。隨著溫度的升高，熒光降低的主要原因是由于分子內(nèi)的能量轉(zhuǎn)移作用，即將激發(fā)能轉(zhuǎn)為基態(tài)的振動(dòng)能，或通過(guò)碰撞將能量轉(zhuǎn)移給其它分子。另一原因可能是激發(fā)分子與溶劑分子之間發(fā)生某些可逆的光化學(xué)反應(yīng)。第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法2、溫度：68第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法3、溶液的pH

當(dāng)熒光物質(zhì)為帶有酸或堿功能團(tuán)的芳香化合物，或?yàn)榻饘俳j(luò)合物時(shí)，溶液pH值的變化將對(duì)溶液中熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度發(fā)生影響。例如苯酚是弱酸，在酸性溶液中以分子形式存在，呈現(xiàn)熒光，但在堿性溶液中則以苯酚陰離子形式存在，卻不呈現(xiàn)熒光。又如鎂和8-羥基喹啉-5-磺酸鈉，在pH8以上時(shí)形成絡(luò)合物，呈現(xiàn)熒光。當(dāng)pH下降到5.7以下，絡(luò)合物解離，熒光也消失。還有些熒光物質(zhì)在酸性或堿性介質(zhì)中，因水解而使熒光強(qiáng)度發(fā)生改變，也有的因發(fā)生環(huán)的破裂或鏈的斷開(kāi)而引起熒光強(qiáng)的變化。第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法3、溶液的pH69第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法六、定量分析方法熒光分析的定量方法與分光光度法基本相同，比分光光度法靈敏度高，但精密度較差，易受系統(tǒng)誤差的影響。常用方法有標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法，直接比較法、制備熒光衍生物測(cè)定法、淬滅熒光測(cè)定法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、激光熒光光譜法、導(dǎo)數(shù)熒光光譜法等。第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法六、定量分析方法70第二章光譜分析法的應(yīng)用誤差及處理第四節(jié)誤差及其處理誤差是衡量定量分析準(zhǔn)確性高低的一個(gè)尺度。一、絕對(duì)誤差和相對(duì)誤差1、絕對(duì)誤差測(cè)量值(x)與真實(shí)值(μ)的差值稱(chēng)為絕對(duì)誤差(absoluteerror)，用符號(hào)δ表示。δ=x-μ(絕對(duì)誤差可正也可負(fù)，代表的意義?)2、相對(duì)誤差絕對(duì)誤差與真實(shí)值的比值稱(chēng)為相對(duì)誤差（relativeerror）。相對(duì)誤差反映誤差在真實(shí)之中所占的比例，用百分率或千分率來(lái)表示，相對(duì)誤差沒(méi)有單位。第二章光譜分析法的應(yīng)用誤差及處理第四節(jié)誤差及其處理誤71第二章光譜分析法的應(yīng)用誤差及處理以上說(shuō)明，在相對(duì)誤差要求一定時(shí)，測(cè)定高含量組分可選用靈敏度低的方法，而對(duì)于含量較低的組分測(cè)定，則必須選用靈敏度較高的測(cè)定方法。第二章光譜分析法的應(yīng)用誤差及處理以上說(shuō)明，在相對(duì)誤差要求72第二章光譜分析法的應(yīng)用誤差及處理1、系統(tǒng)誤差（systematicerror）,也叫可定誤差，是由某種固定原因造成的，一般有固定的方向和大小，多次測(cè)量時(shí)會(huì)重復(fù)出現(xiàn)。如：方法誤差、儀器誤差、試劑誤差、操作誤差等。2、偶然誤差（accidentalerror），也叫隨機(jī)誤差，是由不確定原因引起的。如溫度的波動(dòng)、操作條件的微小差異等，

其大小和正負(fù)都不固定。二、系統(tǒng)誤差和偶然誤差第二章光譜分析法的應(yīng)用誤差及處理1、系統(tǒng)誤差（system73第二章光譜分析法的應(yīng)用誤差及處理1、準(zhǔn)確度（accuracy）是指測(cè)定值與真實(shí)值接近的程度。誤差越大，準(zhǔn)確度越低；誤差越小，準(zhǔn)確度越高。2、精密度（precision），是指平行測(cè)量的一組測(cè)量值之間互相接近的程度。各測(cè)量值間越接近，精密度就越高，越精密；反之，精密度就低。精密度可用偏差、相對(duì)平均偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。三、準(zhǔn)確度和精密度第二章光譜分析法的應(yīng)用誤差及處理1、準(zhǔn)確度（accurac74第二章光譜分析法的應(yīng)用誤差及處理1)偏差（deviation）：測(cè)定值與平均值之差，偏差有正有負(fù)，偏差越大，精密度越低。2)平均偏差（averagedeviation）：各單個(gè)偏差絕對(duì)值的平均值稱(chēng)為平均偏差，即n是測(cè)量次數(shù)。3)相對(duì)平均偏差（relativeaveragedeviation）:平均偏差與平均值之比稱(chēng)為相對(duì)平均偏差。4)標(biāo)準(zhǔn)偏差(standarddeviation)：5)）相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relativestandarddeviation)是標(biāo)準(zhǔn)偏差與平均值的比值。第二章光譜分析法的應(yīng)用誤差及處理1)偏差（deviati75第二章光譜分析法的應(yīng)用誤差及處理3、準(zhǔn)確度與精密度的關(guān)系精密度高、準(zhǔn)確度不高，系統(tǒng)誤差準(zhǔn)確度高精密度不高準(zhǔn)確度、精密度都不高準(zhǔn)確度、精密度均高第二章光譜分析法的應(yīng)用誤差及處理3、準(zhǔn)確度與精密度的關(guān)系精76第二章光譜分析法的應(yīng)用誤差及處理1、選擇恰當(dāng)?shù)姆治龇椒ā?、減少測(cè)量誤差。3、增加平行測(cè)定次數(shù)。4、消除測(cè)量中的系統(tǒng)誤差。對(duì)照試驗(yàn)、加樣回收率實(shí)驗(yàn)、空白試驗(yàn)、校準(zhǔn)儀器。四、提高分析準(zhǔn)確度的方法第二章光譜分析法的應(yīng)用誤差及處理1、選擇恰當(dāng)?shù)姆治龇椒?。?7*光譜分析法：利用各種化學(xué)物質(zhì)所具有的發(fā)射、吸收或散射光譜系的特征來(lái)確定物質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量的方法。第二章光譜分析法的應(yīng)用吸收光譜分析發(fā)射光譜分析散射光譜分析光譜分析可見(jiàn)分光光度法紫外分光光度法紅外分光光度法原子吸收光譜法熒光分析法火焰光度法比濁法√√√√*光譜分析法：利用各種化學(xué)物質(zhì)所具有的發(fā)射、吸收或散射光譜系78光是電磁波，其能量（輻射能）可以用波長(zhǎng)來(lái)表示第二章光譜分析法的應(yīng)用光是電磁波，其能量（輻射能）可以用波長(zhǎng)來(lái)表示第二章光譜分析79物質(zhì)吸收可見(jiàn)光和紫外光則引起價(jià)電子躍遷物質(zhì)吸收紅外光則引起分子振動(dòng)紫外光譜又稱(chēng)為電子光譜，紅外光譜又稱(chēng)為分子振動(dòng)光譜*分子吸收光譜：當(dāng)光通過(guò)固體、液體或氣體的透明層時(shí)，分子可以選擇性地吸收一定波長(zhǎng)的光，透過(guò)的光譜中就不出現(xiàn)這些波長(zhǎng)的光，這種光譜稱(chēng)為吸收光譜。紫外-可見(jiàn)分光光度法第一節(jié)可見(jiàn)—紫外分光光度法的應(yīng)用物質(zhì)吸收可見(jiàn)光和紫外光則引起價(jià)電子躍遷紫外-可見(jiàn)分光光度法第80吸收光譜的吸收強(qiáng)度在實(shí)驗(yàn)上可用朗伯-比爾（Lambert-Beer）定律來(lái)描述。這條定律是吸收光的基本定律，也是吸收光譜測(cè)量的理論基礎(chǔ)。當(dāng)一束單色光通過(guò)溶液時(shí)，由于溶液吸收了一部分光能，光的強(qiáng)度就要降低，溶液的濃度越大，液層的厚度越大，吸收的光能越多，光強(qiáng)度減弱也越顯著，可用下式來(lái)表示：第二章光譜分析法的應(yīng)用紫外-可見(jiàn)分光光度法吸收光譜的吸收強(qiáng)度在實(shí)驗(yàn)上可用朗伯-比爾（Lambe81吸收度與溶液的濃度及液層的厚度成正比；*吸收系數(shù)（Absorptivity）：?jiǎn)挝粷舛?、單位液層厚度的吸收度。紫?可見(jiàn)分光光度法吸收度與溶液的濃度及液層的厚度成正比；紫外-可見(jiàn)分光光度法82摩爾吸收系數(shù)：指1升溶液中含有1摩爾溶質(zhì)，液層厚度為lcm時(shí)，在指定波長(zhǎng)和一定條件（溶劑、pH、溫度）下的吸收度，用ε表示，單位是克分子-1厘米-1。百分吸收系數(shù)：指100m1溶液中含有1g溶質(zhì)，液層厚度1cm時(shí)，在指定波長(zhǎng)和一定條件下所測(cè)得的吸收度，用或

表示，單位是克-1厘米-1。摩爾吸收系數(shù)與百分吸收系數(shù)的相互關(guān)系為：

M：吸光物質(zhì)的分子量（摩爾質(zhì)量）。紫外-可見(jiàn)分光光度法摩爾吸收系數(shù)：指1升溶液中含有1摩爾溶質(zhì)，液層厚度為lcm83物質(zhì)的吸收系數(shù)與溶劑的種類(lèi)、溶液的pH、溫度以及波長(zhǎng)有關(guān)，測(cè)定時(shí)必需注意，表示吸收系數(shù)時(shí)這些條件應(yīng)注明。測(cè)定吸收系數(shù)時(shí)，將儀器的波長(zhǎng)調(diào)至最大吸收波長(zhǎng)（λmax）處。紫外-可見(jiàn)分光光度法物質(zhì)的吸收系數(shù)與溶劑的種類(lèi)、溶液的pH、溫度以及波長(zhǎng)有關(guān)，測(cè)84一、分析測(cè)定方法1．吸收系數(shù)法在無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，利用或

ε

進(jìn)行定量。從有關(guān)手冊(cè)或藥典中查得化合物的吸收系數(shù)，然后采用與標(biāo)準(zhǔn)品相同的溶劑，配制樣品溶液，在相同波長(zhǎng)下測(cè)定A值，按下式計(jì)算百分含量：在有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下：紫外-可見(jiàn)分光光度法儀器型號(hào)和操作條件一、分析測(cè)定方法1．吸收系數(shù)法在無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，利用852.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法（常用）從待測(cè)物質(zhì)的吸收光譜圖上選定某一最大吸收波長(zhǎng)，用一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液在該波長(zhǎng)處分別測(cè)定它們的吸收度。用吸收度對(duì)濃度作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。在同樣條件下測(cè)定樣品溶液的吸收度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上可求出樣品溶液的濃度。紫外-可見(jiàn)分光光度法2.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法（常用）從待測(cè)物質(zhì)的吸收光譜圖上選定某一最大863.直接比較法（單點(diǎn)校正）凡溶液中待測(cè)物質(zhì)吸收符合吸收定律，則配制一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)其吸收度，再在同樣條件下測(cè)樣品溶液的吸收度，根據(jù)下列公式求出樣品溶液的濃度。

A標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收度C標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度A樣為樣品溶液吸收度C樣為樣品溶液濃度紫外-可見(jiàn)分光光度法3.直接比較法（單點(diǎn)校正）凡溶液中待測(cè)物質(zhì)吸收符合吸收定律874．聯(lián)立方程法若待測(cè)樣品為兩種以上不起化學(xué)反應(yīng)的吸收物質(zhì)，如其吸收光譜并不互相重疊，可按單位組分分析方法，分別在各組分的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定，如其吸收光譜互相重疊，根據(jù)吸收度的加和性原則，混合物的吸收度為各組分吸收度之和，可在各組分的最大吸收波長(zhǎng)處，分別測(cè)混合物吸收度，通過(guò)解聯(lián)立方程的方法求得結(jié)果，如下式：

1221紫外-可見(jiàn)分光光度法4．聯(lián)立方程法若待測(cè)樣品為兩種以上不起化學(xué)反應(yīng)的吸收物質(zhì)，如88靛藍(lán)和靛玉紅的吸收光譜靛藍(lán)在608nm處、靛玉紅在544nm處有最大吸收。根據(jù)Lambert-beer定律A=EC分別計(jì)算出4個(gè)比吸光系數(shù)。當(dāng)波長(zhǎng)為608nm時(shí)，E608靛藍(lán)＝34.6，E608靛玉紅＝6.9；當(dāng)波長(zhǎng)為544nm時(shí)，E544靛藍(lán)＝19.6，E544靛玉紅＝44.6。

當(dāng)溶液為2種物質(zhì)的混合溶液時(shí)：A608＝E608靛藍(lán)×C靛藍(lán)+E608靛玉紅×C靛玉紅A544＝E544靛藍(lán)×C靛藍(lán)+E544靛玉紅×C靛玉紅推導(dǎo)出：C靛藍(lán)＝1.54×10-3×A608－1.87×10-4×A544C靛玉紅＝3.65×10-3×A544－9.41×10-4×A608靛藍(lán)和靛玉紅的吸收光譜靛藍(lán)在608nm處、靛玉紅在54489(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件905．雙波長(zhǎng)分光光度法假設(shè)a為干擾組分，b為被測(cè)組分，虛線(xiàn)則代表吸光度上反映的值。又設(shè)在λ1和λ2處干擾組分的吸光度值相等，于是△A值反映在λ1和λ2處b組分的吸光度差異。

XYx1x2y1紫外-可見(jiàn)分光光度法5．雙波長(zhǎng)分光光度法假設(shè)a為干擾組分，b為被測(cè)組分，虛線(xiàn)則91a的曲線(xiàn)在波長(zhǎng)λ1和λ2處吸收度相等，△Aa＝0；b物質(zhì)的吸收曲線(xiàn)在Al和A2處A值相差很大，為△Ab;混合物在此二波長(zhǎng)的△A即為b物質(zhì)的△Ab（

）;b物質(zhì)的含量則可用在λ1及λ2處測(cè)得的△Ab對(duì)濃度作圖所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上求出。

紫外-可見(jiàn)分光光度法a的曲線(xiàn)在波長(zhǎng)λ1和λ2處吸收度相等，△Aa＝0；92測(cè)定步驟：（1）選擇雙波長(zhǎng)。先用標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)出兩組分各自的吸收曲線(xiàn)，選干擾組分的吸收曲線(xiàn)上某對(duì)稱(chēng)兩點(diǎn)（等吸收波長(zhǎng)）的波長(zhǎng)λ1和λ2，在此二波長(zhǎng)處待測(cè)組分的吸收度應(yīng)有明顯差別。

（2）配制不同濃度的待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品，先在λ1處測(cè)出A1，再在λ2處測(cè)出A2，求出?A。用各種濃度下的?A對(duì)濃度C作圖，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。（3）混合物中待測(cè)組分的含量測(cè)定。在λ1和λ2處分別測(cè)得混合物的A1及A2，求出?A，由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出濃度即為待測(cè)組分濃度。

紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定步驟：紫外-可見(jiàn)分光光度法93可見(jiàn)光區(qū)的波長(zhǎng)范圍為400~760nm，人的視覺(jué)可以察覺(jué)。

二、可見(jiàn)分光光度法分析若兩種顏色的光按其適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度比例混合后可成為白色，則這兩種光色被稱(chēng)為互補(bǔ)色，如綠與紫紅、黃與藍(lán)、橙與青藍(lán)、紅與青。有色溶液呈現(xiàn)的不同顏色，就是由于物質(zhì)對(duì)光具有選擇性吸收所造成的，例如高錳酸鉀溶液由于吸收波長(zhǎng)為500~560nm（綠色光）而顯紫紅色。紫外-可見(jiàn)分光光度法可見(jiàn)光區(qū)的波長(zhǎng)范圍為400~760nm，人的視覺(jué)可以察覺(jué)。94可見(jiàn)分光光度法就是利用有色物質(zhì)吸收光能的特性來(lái)測(cè)定物質(zhì)含量的方法。藥物內(nèi)的各種有效成分或主成分，可用此方法進(jìn)行分析的條件：1.成分本身有色；2.或與一定顯色試劑作用后可形成有色物質(zhì)；3.并且在一定濃度范圍內(nèi)，溶液的吸收度與濃度符合朗伯-比爾定律。

紫外-可見(jiàn)分光光度法可見(jiàn)分光光度法就是利用有色物質(zhì)吸收光能的特性來(lái)測(cè)定物質(zhì)含量的951.黃酮類(lèi)成分的測(cè)定

應(yīng)用實(shí)例（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：精密稱(chēng)取120℃下干燥至恒重的無(wú)水蘆丁10mg，用30%乙醇定容于100ml容量瓶中。分別取上述溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于10ml容量瓶中，加入0.3ml5％亞硝酸鈉溶液，放置6min，加入10％硝酸鋁溶液0.3ml，放置6min，再加入1mol/l的氫氧化鈉溶液4.0ml，30%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min，510nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：Y=0.0018+1.0926XX：所測(cè)的吸光度Y：總黃酮的濃度R=0.9998紫外-可見(jiàn)分光光度法1.黃酮類(lèi)成分的測(cè)定應(yīng)用實(shí)例（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)96

應(yīng)用實(shí)例（2）測(cè)定步驟：精密稱(chēng)取樣品5g，提取，濃縮至近干，蒸餾水溶解后過(guò)濾。濾液用正丁醇萃取至無(wú)黃酮反應(yīng)為止。減壓回收正丁醇至近干，加30％乙醇溶解，過(guò)濾，移至50ml容量瓶中，用30％乙醇定容至刻度，稀釋25倍。精密吸取3ml于10ml容量瓶中，按上述顯色方法顯色，用754紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)于510nm處測(cè)吸光度。（3）樣品測(cè)定應(yīng)用實(shí)例（2）測(cè)定步驟：精密稱(chēng)取樣品5g，提97

應(yīng)用實(shí)例2、環(huán)烯醚萜類(lèi)（桃葉珊瑚苷）的測(cè)定（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：精密稱(chēng)取10mg標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中配成1mg/ml母液，分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml，加蒸餾水至1ml，依次加入1mlApstahl、1ml冰醋酸、2ml乙醇到5ml，80℃水浴中加熱顯色30min，中間搖動(dòng)2~3次；取出流水冷卻1min，然后在601nm處用754型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)溶液吸光度A；以濃度與相應(yīng)的吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為：Y=0.11605A+0.00033R=0.9976紫外-可見(jiàn)分光光度法應(yīng)用實(shí)例2、環(huán)烯醚萜類(lèi)（桃葉珊瑚苷）的測(cè)定紫98

應(yīng)用實(shí)例（2）測(cè)定步驟：精密稱(chēng)取烘干樣品5g，提取、濃縮、用蒸餾水定容于50ml容量瓶中，離心5min，取上清液1ml于25ml容量瓶中稀釋后，取稀釋液1ml，依次加入4ml乙醇、2ml對(duì)二甲氨基苯甲醛試劑（艾氏試劑）、2ml冰醋酸，用蒸餾水定容到10ml，充分搖勻；在80℃水浴中加熱顯色30min，中間搖動(dòng)2～3次；取出試管，管內(nèi)溶液根據(jù)濃度不同呈現(xiàn)不同深度的藍(lán)色，流水冷卻1min，然后在601nm處用分光光度計(jì)測(cè)溶液吸光度A；以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和校正方程計(jì)算樣品中桃葉珊瑚苷含量。（3）樣品測(cè)定

紫外-可見(jiàn)分光光度法應(yīng)用實(shí)例（2）測(cè)定步驟：精密稱(chēng)取烘干樣品5g99紫外-可見(jiàn)分光光度法紫外-可見(jiàn)分光光度法1001、顯色化合物的吸收光譜桃葉珊瑚苷與Epstahl試劑在乙醇和醋酸溶液中形成的有色化合物的最大吸收波長(zhǎng)為601nm，吸收曲線(xiàn)見(jiàn)圖。桃葉珊瑚苷的分光光度法測(cè)定具體步驟桃葉珊瑚甙與Epstahl試劑形成的顯色化合物在乙醇和醋酸中的吸收光譜紫外-可見(jiàn)分光光度法1、顯色化合物的吸收光譜桃葉珊瑚苷的分光光度法測(cè)定具體步驟桃1012、顯色劑的用量桃葉珊瑚甙含量在2.0×10-2g/L以?xún)?nèi)時(shí)，加1mLEpstahl試劑可使1mL試液中的桃葉珊瑚苷完全形成穩(wěn)定的有色化合物。顯色劑較少時(shí)，吸光度偏低；較多時(shí)影響不大。紫外-可見(jiàn)分光光度法2、顯色劑的用量紫外-可見(jiàn)分光光度法1023、冰醋酸用量在醋酸濃度較小時(shí)，隨醋酸濃度的增大，顯色溶液的吸光度增加較多，醋酸濃度較大時(shí)，增大醋酸的濃度，顯色溶液的吸光度增加較少。測(cè)定中1mL試液加入1mL醋酸為宜。加入醋酸還可加快顯色反應(yīng)速度。紫外-可見(jiàn)分光光度法3、冰醋酸用量紫外-可見(jiàn)分光光度法1034、顯色溶劑的選擇在水溶液中顯色，溶液為渾濁的藍(lán)色，并很快沉淀。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加入95％乙醇，顯色溶液為清徹的深藍(lán)色，無(wú)沉淀。表明乙醇能夠增大顯色化合物的溶解度而使其穩(wěn)定，因此采用乙醇為顯色溶劑。測(cè)定中1mL試液加人2mL95％乙醇為宜。紫外-可見(jiàn)分光光度法4、顯色溶劑的選擇紫外-可見(jiàn)分光光度法1045、顯色溫度和顯色時(shí)間顯色反應(yīng)溫度過(guò)高，溶液沸騰，使溶劑損失嚴(yán)重，以80℃水浴顯色為宜。在該溫度下顯色25～30min后，顯色溶液的吸光度不再增加。紫外-可見(jiàn)分光光度法5、顯色溫度和顯色時(shí)間紫外-可見(jiàn)分光光度法1056、顯色化合物的穩(wěn)定時(shí)間在擬定實(shí)驗(yàn)條件下，顯色化合物的吸光度在顯色后1h無(wú)變化，10h后，吸光度略有減小。Epstahl試劑的配制：對(duì)二甲氨基苯甲醛0.25g，冰醋酸50g，35%H3PO45g，水20mL。紫外-可見(jiàn)分光光度法6、顯色化合物的穩(wěn)定時(shí)間紫外-可見(jiàn)分光光度法1067、樣品分析稱(chēng)取1.000g干燥杜仲葉粉末，用60%乙醇提取3次，提取液于50mL容量瓶定容。分別吸取100μL桃葉珊瑚苷溶液和提取液，加入Epstahl試劑，80℃加熱30min顯色。在601nm測(cè)定吸光度，根據(jù)工作曲線(xiàn)計(jì)算桃葉珊瑚甙的含量。紫外-可見(jiàn)分光光度法7、樣品分析紫外-可見(jiàn)分光光度法1073、藥物中多糖的分光光度法分析1、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備多糖在濃HCl作用下，水解成單糖，和3,5-二硝基水楊酸縮合成有色化合物，可用分光光度法于適宜波長(zhǎng)處測(cè)定多糖含量，本法簡(jiǎn)便，顯色穩(wěn)定，靈敏度高，重現(xiàn)性好。取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品配置成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入3,5-二硝基水楊酸試劑，混勻，放入90℃水浴中加熱10min，取出，流水冷卻，用蒸餾水定容，搖勻，于492nm處測(cè)吸光度。得回歸方程：C＝112.4942A＋36.0148,R=0.9979。式中：C—標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（μg/mL），A—吸光度。紫外-可見(jiàn)分光光度法3、藥物中多糖的分光光度法分析1、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備紫外-可見(jiàn)分1082、提取物中多糖的含量測(cè)定精密稱(chēng)取多糖提取物100mg（或從材料中提取多糖），用蒸餾水定容至10mL，精密吸取0.5mL。加入6mol/L的HCl10mL，沸水浴加熱水解30min，冷卻后用6mol/L的NaOH調(diào)pH至中性，加入2mL3,5-二硝基水楊酸試劑，另取一支試管以蒸餾水和3,5-二硝基水楊酸試劑為空白對(duì)照，充分混合后于90℃水浴中顯色10min，492nm測(cè)定A值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算酸性多糖的含量。紫外-可見(jiàn)分光光度法作用？Why?2、提取物中多糖的含量測(cè)定紫外-可見(jiàn)分光光度法作用？Why?109(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件110(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件111紫外-可見(jiàn)分光光度法原理：3,5-二硝基水楊酸在中性或偏堿性條件下與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物（3-氨基-5-硝基水楊酸），在一定范圍內(nèi)，還原糖的量和反應(yīng)液的顏色呈正比。紫外-可見(jiàn)分光光度法原理：112(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件113(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件114(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件115(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件116(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件117三、紫外分光光度法分析利用紫外分光光度法進(jìn)行定量分析具有快速、靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。一般測(cè)試范圍在1％至0.1ppm，準(zhǔn)確度可在2％以?xún)?nèi)。本法不需要顯色劑，因而不受顯色劑、溫度及顯色時(shí)間等因素的影響，操作簡(jiǎn)便。待測(cè)成分在紫外光區(qū)（200~400nm）有吸收，并在測(cè)試濃度范圍內(nèi)服從朗伯-比爾定律者，均可選用。紫外分光光度法三、紫外分光光度法分析利用紫外分光光度法進(jìn)行定量分析具有快速118常用中藥主成分的紫外吸收波長(zhǎng)紫外分光光度法常用中藥主成分的紫外吸收波長(zhǎng)紫外分光光度法119紙色譜分離-紫外分光光度法測(cè)阿魏酸展開(kāi)劑：水洗脫劑：95%乙醇分析波長(zhǎng)：330nm應(yīng)用實(shí)例紫外分光光度法紙色譜分離-紫外分光光度法測(cè)阿魏酸展開(kāi)劑：水應(yīng)用實(shí)例紫外分光120紫外分光光度法紫外分光光度法121第二章光譜分析法的應(yīng)用分光光度法第二章光譜分析法的應(yīng)用分光光度法122第二章光譜分析法的應(yīng)用分光光度法第二章光譜分析法的應(yīng)用分光光度法123第二章光譜分析法的應(yīng)用分光光度法第二章光譜分析法的應(yīng)用分光光度法124(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件125(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件126第二節(jié)紅外分光光度法的應(yīng)用*紅外分光光度法（1nfraredSpectrophotometry）：是以紅外區(qū)域電磁波連續(xù)光譜作為輻射源照射樣品，記錄樣品吸收曲線(xiàn)的一種物理光學(xué)分析方法，又稱(chēng)紅外吸收光譜法。紅外光譜區(qū)一般分為三個(gè)區(qū)域，近紅外光區(qū)，波長(zhǎng)0.75~2.5μm；中紅外區(qū)，波長(zhǎng)2.5~25μm；遠(yuǎn)紅外區(qū)，波長(zhǎng)25~500μm。第二節(jié)紅外分光光度法的應(yīng)用*紅外分光光度法（1nfra127紅外分光光度法紅外吸收光譜突出特點(diǎn)是具有高度的特征性，除光學(xué)異構(gòu)體外，每種有機(jī)化合物都有自己的紅外吸收光譜。有機(jī)化合物中各官能團(tuán)在某一區(qū)域出現(xiàn)吸收譜帶的位置相對(duì)恒定，不受或少受分子中其它部分的影響，這種譜帶稱(chēng)為相應(yīng)官能團(tuán)的特征吸收，可用于有機(jī)官能團(tuán)的鑒定。紅外分光光度法紅外吸收光譜突出特點(diǎn)是具有高度的特征性，除光學(xué)128第二章光譜分析法的應(yīng)用紅外分光光度法紅外光譜主要應(yīng)用在定性鑒別上，若兩個(gè)樣品的光譜完全相同，可以判斷它們是同一化合物。若峰數(shù)不多，且外形較鈍，則可靠性較差。紅外光譜是整個(gè)化合物的分子鑒別，紅外光譜的“指紋”區(qū)更具有鑒別化合物的特征。一、定性分析第二章光譜分析法的應(yīng)用紅外分光光度法紅外光譜主要應(yīng)用在定性129(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件130第二章光譜分析法的應(yīng)用紅外分光光度法第二章光譜分析法的應(yīng)用紅外分光光度法131(第二章)藥物分析-光譜分析法的應(yīng)用課件1321.山藥2.參署3.木薯4.番薯1.山藥2.參署3.木薯4.番薯1.山藥2.參署3.木薯4.番薯1.山藥133第二章光譜分析法的應(yīng)用紅外分光光度法

利用紅外分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析，它的理論基礎(chǔ)仍然是朗伯-比爾定律。但有以下缺點(diǎn)。1、光源強(qiáng)度和檢測(cè)器靈敏度比可見(jiàn)和紫外光譜儀小。2、吸收池是由氯化鈉等組成，比較脆弱、其厚度不易確定，表面狀態(tài)也經(jīng)常改變。3、紅外光譜中ε最大不超過(guò)103，可見(jiàn)和紫外吸收光譜中的ε值可達(dá)105，紅外光譜的靈敏度低。二、定量分析第二章光譜分析法的應(yīng)用紅外分光光度法利用紅外分光光134S-410光柵透射型近紅外分光光度計(jì)傅立葉變換紅外光譜儀IR200S-410光柵透射型近紅外分光光度計(jì)傅立葉變換紅外光譜儀135含量測(cè)定方法:1、基線(xiàn)法在吸收峰兩側(cè)選基點(diǎn)P和Q，兩點(diǎn)連線(xiàn)稱(chēng)為基線(xiàn)，通過(guò)峰頂t作垂線(xiàn)rs則：由rs與ts線(xiàn)的長(zhǎng)度，可求出樣品在此波長(zhǎng)下的吸收度。依次配制一系列不同濃度的樣品溶液，在同樣的波長(zhǎng)下測(cè)定吸收度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，利用工作曲線(xiàn)求出樣品的濃度。含量測(cè)定方法:1、基線(xiàn)法由rs與ts線(xiàn)的長(zhǎng)度，可求出樣品在136含量測(cè)定方法:2、固體樣品吸收度法：最簡(jiǎn)便的方法是繪制KBr片中樣品的工作曲線(xiàn)。設(shè)s為壓片的面積，L為厚度，m為壓片中樣品的量，在壓片中的樣品濃度將為：比爾定律：同一模具壓片，S為常數(shù)E/S＝k，則A＝mk。在片中，樣品的吸收度只與片中樣品的量有關(guān)，而與片的厚度無(wú)關(guān)。制備一系列不同含量的片，測(cè)定吸收度，而后繪制工作曲線(xiàn)。3、峰高法：P96含量測(cè)定方法:2、固體樣品吸收度法：比爾定律：同一模具壓片，137第二章光譜分析法的應(yīng)用第三節(jié)熒光分析法的應(yīng)用

用一種波長(zhǎng)的光（如紫外光）照射某物質(zhì)時(shí)，物質(zhì)的分子吸收了該波長(zhǎng)的光后，在很短的時(shí)間內(nèi)（延遲幾納秒至幾微秒）發(fā)射出較照射波長(zhǎng)長(zhǎng)的光，即為熒光。因而熒光光譜是發(fā)射光譜。利用物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)不同，所吸收的紫外光波長(zhǎng)與發(fā)射的熒光波長(zhǎng)也有所不同的特性，可鑒別物質(zhì)。熒光分析法具有靈敏度高（濃度可低至10-4μg/m1）、選擇性好、試樣量少（幾十微克或幾十微升）等特點(diǎn)。

不足之處是干擾因素較多且實(shí)驗(yàn)條件嚴(yán)格。第二章光譜分析法的應(yīng)用第三節(jié)熒光分析法的應(yīng)用138第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法一、激發(fā)光譜與熒光光譜任何發(fā)熒光的分子都具有兩個(gè)特征光譜：激發(fā)光譜和熒光光譜。*激發(fā)光譜：將激發(fā)熒光的光源（紫外光或可見(jiàn)光）用單色器分光，測(cè)定樣品對(duì)每一波長(zhǎng)的激發(fā)光所發(fā)射的熒光強(qiáng)度，以激發(fā)光波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，就可得到熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法一、激發(fā)光譜與熒光光譜139*熒光光譜：用選好的最大激發(fā)波長(zhǎng)作光源，讓物質(zhì)發(fā)生的熒光通過(guò)單色器分光，測(cè)定每一個(gè)波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度對(duì)熒光波長(zhǎng)作圖，得熒光光譜。*熒光光譜：用選好的最大激發(fā)波長(zhǎng)作光源，讓物質(zhì)發(fā)生的熒光通140第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法二、熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

產(chǎn)生熒光的首要條件是物質(zhì)分子必須具有電子吸收光譜的特征結(jié)構(gòu)，其次是必須具有一定的熒光效率和合適的環(huán)境。

熒光通常發(fā)生于具有共軛雙鍵體系的分子，體系中電子共軛度越大，非定域π電子越易被激發(fā)，就越易產(chǎn)生熒光，且熒光光譜將向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng)。任何有利于提高π電子共軛程度的結(jié)構(gòu)改變，都能提高熒光效率、或使熒光波長(zhǎng)紅移。例如蒽：熒光效率0.36：熒光波長(zhǎng)402nn，9-乙烯基蒽：熒光效率0.76；熒光波長(zhǎng)432nm。第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法二、熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)141第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法

三、熒光強(qiáng)度

熒光強(qiáng)度與樣品濃度呈線(xiàn)性關(guān)系，與物質(zhì)本身的熒光效率及激發(fā)光強(qiáng)度成正比。熒光效率愈大，熒光強(qiáng)度愈強(qiáng)。激發(fā)光源愈強(qiáng)，產(chǎn)生的熒光愈強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度愈高。但很強(qiáng)的光源易使樣品光分解，通常使用中等強(qiáng)度的激發(fā)光?；衔锏哪栁障禂?shù)越大，其產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法三、熒光強(qiáng)度142第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法四、測(cè)定儀器測(cè)定熒光的儀器，常用的有目測(cè)熒光計(jì)、光電熒光計(jì)和熒光分光光度計(jì)等。其基本結(jié)構(gòu)都是由激發(fā)光源、單色器、樣品池與檢測(cè)系統(tǒng)組成的。熒光分光光度計(jì)基本結(jié)構(gòu)和原理圖AmincoBowmanSeries2型熒光分光光度計(jì)第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法四、測(cè)定儀器熒光分光光143第二章光譜分析法的應(yīng)用熒光分光光度法五、影響熒光強(qiáng)度的外界因素*