體內(nèi)藥物分析培訓(xùn)課件

體內(nèi)藥物分析體內(nèi)藥物分析1體內(nèi)藥物分析概述一、體內(nèi)藥物分析的定義研究生物機(jī)體中藥物及其代謝物和內(nèi)源性物質(zhì)的質(zhì)和量變化規(guī)律的分析方法學(xué)。

藥物分析,法醫(yī)鑒定,毒物分析

體內(nèi)藥物分析概述一、體內(nèi)藥物分析的定義2二、體內(nèi)藥物分析的意義（一）在新藥評價和開發(fā)中的意義

1．全面質(zhì)量控制(毒奶粉事件)

藥品三原則:安全,合理和有效

2．新藥報批

3．為設(shè)計(jì)新藥提供信息①從代謝產(chǎn)物中開發(fā)新藥(保泰松和羥基保泰松)②前藥設(shè)計(jì)③新劑型的研究，緩控釋、經(jīng)皮制劑等以上內(nèi)容必須通過測定體內(nèi)藥物濃度得以解決二、體內(nèi)藥物分析的意義（一）在新藥評價和開發(fā)中的意義3

1．血藥濃度與藥理作用思考題:劑量增加,藥效是否成正比增加???（二）臨床合理用藥中的意義1．血藥濃度與藥理作用（二）臨床合理用藥中的42.影響血藥濃度的因素（1）機(jī)體因素

a．生理因素:年齡、性別、生理狀況（妊娠期）

b．病理因素（胃腸道、肝臟、腎臟）

c．遺傳因素（乙?；D(zhuǎn)移酶代謝異煙肼、乙醇脫氫酶）（2）藥物因素

a．劑型因素（生物利用度問題）

b．藥物合并使用（酶抑、酶促）

c．環(huán)境因素（環(huán)境污染、食品、個人精神狀態(tài)）2.影響血藥濃度的因素（1）機(jī)體因素5分析目標(biāo)藥物在體內(nèi)的某些代謝產(chǎn)物常具有一定的生理活性,它們在體內(nèi)的變化規(guī)律對母體藥物的藥理學(xué)與毒理學(xué)評價特別重要.機(jī)體內(nèi)源性生物活性物質(zhì)往往參與機(jī)體重要的生理過程,其變化規(guī)律的異常改變也與某些疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)母藥藥物特有代謝產(chǎn)物體內(nèi)內(nèi)源性生物活性物質(zhì)分析目標(biāo)藥物在體內(nèi)的某些代謝產(chǎn)物常具有一定的生理活性,它們在6三、體內(nèi)藥物分析的對象CompanyLogo人動物鼠兔犬大鼠小鼠男女等等猴猩猩都是一些志愿者須動物管理與使用委員會同意三、體內(nèi)藥物分析的對象CompanyLogowww.the7CompanyLogo分析對象CompanyLogowww.themegallery.c8CompanyLogo藥物在體內(nèi)的形態(tài)游離型代謝產(chǎn)物游離型原藥結(jié)合型原藥結(jié)合型代謝產(chǎn)物情形極為復(fù)雜綴合物分子間力結(jié)合化學(xué)共價結(jié)合稱為兩類CompanyLogowww.themegallery.c9四、體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)1．干擾雜質(zhì)多(內(nèi)源性物質(zhì),分離純化)2．樣品濃度低(富集,凈化)3．取樣量少4．工作量大5．時間短6．有一定設(shè)備四、體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)1．干擾雜質(zhì)多(內(nèi)源性物質(zhì),分離純化10五、體內(nèi)藥物分析方法1.色譜分析法：TLC、、GC、HPLC、HPCE2.免疫分析法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、熒光免疫分析法等3.生物學(xué)方法：微生物學(xué)方法用于抗生素類藥物的體內(nèi)分析，如生物利用度，生物等效性或臨床TDM等體內(nèi)樣品測定五、體內(nèi)藥物分析方法1.色譜分析法：TLC、、GC、HPLC1112

第一節(jié)常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏一、生物樣品的采集與貯藏體內(nèi)藥物分析常用的分析品種有血液、尿液、唾液，也可用乳汁、淚液、腦脊液、膽汁等。12

第一節(jié)常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏一、生物樣品12（一）樣品的采集1．血樣血樣濃度與作用點(diǎn)的濃度密切相關(guān)，可以反映靶器官的濃度。血細(xì)胞血漿（plasma）血小板血清（serum）血細(xì)胞測定血樣中平均分布于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的藥濃抗凝自然全血血液（一）樣品的采集1．血樣血細(xì)胞血漿（plasma）血小板血清132．尿樣

目的：藥物劑量回收，藥物清除，藥物代謝和生物利用度特點(diǎn)：濃度高，易于收集，體內(nèi)代謝研究，應(yīng)水解分離優(yōu)點(diǎn)：易得，屬非損傷性取樣，樣品量大；尿中藥物濃度高，含有綴合物或代謝物，是研究代謝物結(jié)構(gòu)的首選樣品；蛋白含量極低，不需去蛋白處理。缺點(diǎn)：與血藥濃度不相關(guān)，難以反映藥物作用過程；受腎功能、pH影響；難以定時定量取樣，易污染；所含成分復(fù)雜，已知其中有紫外吸收的化合物就達(dá)數(shù)十種。2．尿樣

目的：藥物劑量回收，藥物清除，藥物代謝和生物利用度143．唾液

唾液是無損傷性采樣，易采集。一些藥物的唾液藥濃（S）與血漿游離藥濃(P)密切相關(guān)，因此，在TDM中可利用測定S代替P監(jiān)測；唾液樣品也可用于藥代動力學(xué)研究。優(yōu)點(diǎn)：不受時間和地點(diǎn)的限制，可反復(fù)采集，采集時無痛苦、無感染危險；唾液成分比血液、尿液簡單，提取方便，有時可直接上樣測定；有些唾液中藥物濃度可以反映血漿中游離型藥物濃度。3．唾液

唾液是無損傷性采樣，易采集。優(yōu)點(diǎn)：不受時間和地點(diǎn)1516

缺點(diǎn)：

唾液是各腺體分泌的的混合液體，其組成發(fā)生經(jīng)時變動。

S/P只有少數(shù)藥物是恒定值。

蛋白結(jié)合率較高的藥物，藥物在唾液中的濃度低。

對有些患者（昏迷）不能采集唾液樣品。16缺點(diǎn)：

唾液是各腺體分泌的的混合液體，其16（二）樣品的貯藏1．血樣（血漿、血清）及時分離→冷藏，-70℃加入穩(wěn)定劑NaF2．尿樣①尿中水、無機(jī)鹽、尿素等細(xì)菌的生長，4℃保存②加入防腐劑a．1%甲苯b．飽和氯仿c．pH改變3．唾液：同血樣（二）樣品的貯藏1．血樣（血漿、血清）及時分離→冷藏，-1718第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理與制備30%以上工作和費(fèi)用用在樣品前處理上18第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理與制備30%以上工作和費(fèi)用用在18二、生物樣品的預(yù)處理（一）預(yù)處理的目的將藥物從綴合物（尿）或結(jié)合物中釋放出來，以測定藥物的總濃度將微量藥物從復(fù)雜的介質(zhì)中純化、富集出來（分離濃縮）防止分析儀器的污染，提高測定靈敏度和選擇性等（出現(xiàn)渾濁和沉淀，雜質(zhì)多，與試劑起反應(yīng)，影響色譜柱壽命）二、生物樣品的預(yù)處理（一）預(yù)處理的目的19（二）處理方法選擇的一般原則1．藥物理化性質(zhì)

pKa親脂性揮發(fā)性溶解度光譜特征穩(wěn)定性2．濃度范圍靈敏的方法3．測定的目的定性定量母體代謝4．生物樣品的種類5．樣品處理與分析方法的選擇①專一性②靈敏性（二）處理方法選擇的一般原則1．藥物理化性質(zhì)20處理步驟與方法全血/血漿，組織(1)蛋白沉淀(2)調(diào)節(jié)pH選擇性溶劑提取放射免疫分析殘?jiān)瘜W(xué)衍生化(提取烴基化)堿回提酸回提HPLCUV、FLD、ECDTLC分光光度法UV、FLDGCFIDECDN/P-FIDGC-MS處理步驟與方法全血/血漿，組織(1)蛋白沉淀選擇性溶劑提取放21去除蛋白質(zhì)方法分離與富集方法微透析技術(shù)綴合物水解化學(xué)衍生化萃取如何進(jìn)行？常用體內(nèi)樣品預(yù)處理方法去除蛋白質(zhì)方法分離與富集方法微透析技術(shù)綴合物水解化學(xué)衍生化萃22CompanyLogo蛋白質(zhì)的去除加入與水混融的有機(jī)溶劑(乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃)加入中性鹽(飽和硫酸銨、硫酸鈉、枸櫞酸鹽)加入強(qiáng)酸(三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸)加入金屬沉淀劑(CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH)綴合物的水解酸水解(鹽酸)酶水解(葡糖酸苷酶、硫酸酯酶、枯草菌溶素)有機(jī)破壞(硝酸-高氯酸消化)分離、純化與濃集液-液萃取法

(Liquid-LiquidExtraction,LLE)液-固萃取法

(Liquid-SolidExtraction,LSE)溶解劑法(硝酸-高氯酸消化)常用體內(nèi)樣品預(yù)處理方法CompanyLogowww.themegallery.c23（三）生物樣品去蛋白處理目的：

去除蛋白質(zhì)可使結(jié)合型的藥物釋放出來，以便測定藥物的總濃度；去除蛋白質(zhì)也可預(yù)防提取過程中蛋白質(zhì)發(fā)泡，減少乳化的形成，以及可以保護(hù)儀器性能，延長使用期限（三）生物樣品去蛋白處理目的：

去除蛋白質(zhì)可使結(jié)合型241．加入與水能混溶的有機(jī)溶劑及中性鹽甲醇乙腈甲醇1:2乙腈1:1.5

（NH4）2SO4NaCl2．加入酸性沉淀劑三氯醋酸高氯酸苦味酸等使蛋白質(zhì)分子的陽離子形成不溶性鹽而↓，pH低于等電點(diǎn)1．加入與水能混溶的有機(jī)溶劑及中性鹽253．組織酶消化法加入酶使蛋白質(zhì)水解優(yōu)點(diǎn)：①平衡條件下進(jìn)行，可避免反應(yīng)和降解②可改善對蛋白結(jié)合率強(qiáng)的藥物的回收率③不產(chǎn)生乳化4．其他加熱超濾3．組織酶消化法26（四）生物樣品綴合物水解1．酸水解：0.1mol/LHCl，100℃，30min，條件較劇烈，易致藥物分解，空白值也高。2．酶水解：葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶，也可用二者的混和物。一般在pH4.5-7，37℃數(shù)小時，條件溫和，選擇性強(qiáng)，但費(fèi)用較高。3．溶劑解：綴合物（主要是硫酸酯）往往可通過加入的溶劑在萃取過程中被分解。為測定尿液中藥物總量，要將綴合物水解：（四）生物樣品綴合物水解1．酸水解：0.1mol/LH27CompanyLogo是以多孔半透膜（超濾膜）作為分離介質(zhì)的一種膜分離技術(shù)，選用不同的孔徑的不對稱膜，即可按照分子量大小進(jìn)行分離適合TDM血樣分析Therapeuticdrugmonitoring（五）超濾分離法CompanyLogowww.themegallery.c28why?某些藥物或者代謝產(chǎn)物極性大，揮發(fā)性低，或者對檢測器不夠靈敏，難以滿足常規(guī)HPLC及GC檢測的需要，因此進(jìn)行衍生HowforGC?硅烷化酰化烷基化不對稱化（六）化學(xué)衍生法why?某些藥物或者代謝產(chǎn)物極性大，揮發(fā)性低，或者對檢測器不29CompanyLogowhy?某些藥物或者代謝產(chǎn)物極性大，揮發(fā)性低，或者對檢測器不夠靈敏，難以滿足常規(guī)HPLC及GC檢測的需要，因此進(jìn)行衍生HowforLC?UVFL非對映衍生化CompanyLogowww.themegallery.c3031（五）分離、純化與濃集

有差別才有可能分離！

生物樣品含有大量可影響測定的內(nèi)源性雜質(zhì)，加上服用的藥物、代謝物、同時服用的其他藥物，組成一個極其復(fù)雜的混合物。

如何將微量的藥物從如此復(fù)雜的混合物中分離出來？31（五）分離、純化與濃集

有差別才有可能分離！31生物樣品的萃取優(yōu)點(diǎn)：①與雜質(zhì)分離②簡便③濃集④提取率高1、液液萃取法原理：多數(shù)藥物是親脂性的，在適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中的溶解度大于在水相中的溶解度，而生物樣品中的大多數(shù)內(nèi)源性雜質(zhì)是強(qiáng)極性的水溶性物質(zhì)（差別）。因而用有機(jī)溶劑萃取一次即可除去大部分雜質(zhì)，從大量的樣品中提取藥物經(jīng)濃集后測定。生物樣品的萃取優(yōu)點(diǎn)：①與雜質(zhì)分離②簡便③濃集④提取率高13233采用LLE要考慮的幾個問題（1）溶劑的選擇與純度要求純度AR以上①了解藥物與溶劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，按相似相溶原則選用②對藥物的未電離分子可溶，而對電離形式的分子不溶（光譜分析法）③沸點(diǎn)低、易揮發(fā)、濃集④與水不相混溶⑤無毒，不易燃燒⑥不易形成乳化（氯仿易乳化，毒性大）⑦具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和惰性⑧不影響紫外測定毒性大的盡量不用33采用LLE要考慮的幾個問題（1）溶劑的選擇與純度要求3334（3）水相的PH值

主要由藥物的pKa決定！

（2）有機(jī)溶劑相和水相的體積比1∶1或2∶1

由實(shí)際情況決定，文獻(xiàn)中有的10∶1以上生物樣品一般多在堿性下提取！34（3）水相的PH值主要由藥物的pKa決定3435由于血藥濃度較低，提取時需濃集傳統(tǒng)的濃集方法主要有兩種：一種是在末次提取時加入的提取液盡量少，使被測組分提取到小體積溶劑中，然后直接吸出適量供測定。另一種是揮去提取溶劑后，再用少量適合的溶劑溶解后測定。35由于血藥濃度較低，提取時需濃集3536

衡量提取方法優(yōu)劣的一個重要指標(biāo)就是提取回收率，它是指藥物從生物樣品中被分離出來用于測定的比例，一般應(yīng)高于60%----乙酸乙酯、叔丁基甲基醚可用于80%藥物的萃取36衡量提取方法優(yōu)劣的一個重要指標(biāo)就是提取回3637文獻(xiàn)上常提到的LLE的缺點(diǎn)

傳統(tǒng)萃取方式回收率低、樣品用量大、繁瑣費(fèi)時、溶劑用量大、溶劑毒性大、易乳化、不能自動化操作37文獻(xiàn)上常提到的LLE的缺點(diǎn)傳統(tǒng)萃取方式回3738

關(guān)于固相萃取小柱：a.常見的固相萃取柱分為三部分：醫(yī)用聚丙烯柱管，多孔聚丙烯篩板(20μm)和填料(多為40-60μm，80-100μm)。b.常用規(guī)格：100mg/1ml，200mg/3ml，500mg/3ml，1g/6ml等。以100mg/1ml為例：其中100mg為填料的質(zhì)量，1ml是空柱管的體積。c.一次性使用：為避免交叉污染，保證檢測可靠性，SPE柱通常是一次性使用的。2.固相萃取(SolidPhaseExtraction，簡稱SPE)法38關(guān)于固相萃取小柱：b.常用規(guī)格：100mg/1ml3839SPE填料親脂型:大孔吸附樹脂，親脂性鍵合硅膠。親水型：硅膠、硅藻土。離子交換：苯磺酸基，羧基等。39SPE填料親脂型:大孔吸附樹脂，親脂性鍵合硅膠。3940固相萃取操作一般有五步：活化——甲醇潤濕小柱，活化填料，除去雜質(zhì)并創(chuàng)造一定的溶劑環(huán)境。平衡——水或適當(dāng)緩沖液沖洗小柱。上樣——將樣品用一定的溶劑溶解，轉(zhuǎn)移入柱并使組分保留在柱上。棄去廢液淋洗——水或緩沖液最大程度除去干擾物。洗脫——用小體積的溶劑將被測物質(zhì)洗脫下來并收集。親脂性鍵合相硅膠SPE柱的實(shí)驗(yàn)步驟：40固相萃取操作一般有五步：親脂性鍵合相硅膠SPE柱的實(shí)驗(yàn)步4041414142親水型填料

用作SPE的親水型填料有硅藻土、硅膠、棉纖維等，其原理為分配作用。填料為支持物，水基質(zhì)中極性強(qiáng)的成分與填料結(jié)合牢固，流動相為與水不相混溶的有機(jī)溶劑，較親脂的藥物易分布于流動相，從而達(dá)到萃取的目的。

親水型填料SPE有較高的萃取回收率（大于80%），但洗脫劑用量較大（一般大于5ml），無濃集作用，萃取液較干凈。42親水型填料用作SPE的親水型填料有硅藻土、4243SPE優(yōu)點(diǎn)：1、不發(fā)生乳化；2、適應(yīng)的極性范圍較廣；3、提取效率高；4、方便快速；5、溶劑用量少；6、易于自動化；7、室溫下操作，尤其適于處理揮發(fā)性及對熱不穩(wěn)定的藥物。目前，商品化固相提取小柱（cartridge）的應(yīng)用已比較普遍。最大的缺點(diǎn)：貴20多元/支43SPE優(yōu)點(diǎn)：1、不發(fā)生乳化；2、適應(yīng)的極性范圍較廣；3、4344三種方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較44三種方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較44第三節(jié)體內(nèi)藥物分析方法的建立與評價一、分析方法根據(jù)藥物理化性質(zhì)，結(jié)構(gòu)特征，藥物濃度，干擾成分大小，實(shí)驗(yàn)?zāi)康撵`敏度專屬性色譜法++++++HPLCGC免疫法++++++免疫交叉反應(yīng)，重現(xiàn)性生物學(xué)方法++特異性較差，需與色譜法平行使用第三節(jié)體內(nèi)藥物分析方法的建立與評價一、分析方法根據(jù)藥物理化45二、分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù)方法的建立原始方法改進(jìn)→創(chuàng)新創(chuàng)立方法二、分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù)原始方法改進(jìn)→創(chuàng)新461．做好文獻(xiàn)總結(jié)2．充分了解藥物特征及體內(nèi)狀況

pH、親脂性、溶解度、極性、光譜特征、藥動學(xué)參數(shù)、體內(nèi)代謝情況3．明確測定目的、要求目的4．結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件

設(shè)備條件

預(yù)處理方法藥濃監(jiān)測藥代動力學(xué)研究母體藥物和代謝物1．做好文獻(xiàn)總結(jié)藥濃監(jiān)測47三、分析方法的建立方法

的驗(yàn)證特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍定量下限準(zhǔn)確度與精密度穩(wěn)定性回收率分析過程的質(zhì)量控制未知樣品濃度超出范圍的處理相關(guān)物質(zhì)測定其它方法驗(yàn)證三、分析方法的建立方法

的驗(yàn)證特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍定量下48四、體內(nèi)樣品分析方法與方法驗(yàn)證

（一)、特異性

所測的物質(zhì)是原型藥物或特定的活性代謝物，內(nèi)源性物質(zhì)和響應(yīng)的其他代謝物及其他藥物不影響樣品的測定。四、體內(nèi)樣品分析方法與方法驗(yàn)證（一)、特異性49CompanyLogo(二)、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍6.412.819.225.630.60茶堿(μg/ml)·····Y=9.56610-2X+6.15310-3

r=0.9995至少6個濃度點(diǎn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍必須覆蓋全部待測濃度，不得外推最低濃度點(diǎn)偏差在±20%其余濃度點(diǎn)的偏差在±

15%。四、體內(nèi)樣品分析方法與方法驗(yàn)證CompanyLogowww.themegallery.c50四、分析方法的評價可行性和可靠性

1．準(zhǔn)確度

accuracy

測定結(jié)果與真實(shí)性的差異用回收率表示

①接近100%②相對恒定四、分析方法的評價可行性和可靠性51①絕對回收率絕對回收率=提取回收率=萃取回收率測定血漿樣品中藥物濃度/相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液=絕對回收率考慮3個濃度（高、中、低）

分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線成上、中、下一般要求絕對回收率在≥70%一般方法 HPLC內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)法時注意：藥物與內(nèi)標(biāo)用各自外標(biāo)法測定回收率應(yīng)相近，差值<10%①絕對回收率52②相對回收率相對回收率=方法學(xué)回收率藥物系列濃度+血樣→標(biāo)準(zhǔn)曲線取高、中、低三濃度加入到空白血漿中，處理后測定，與加入標(biāo)準(zhǔn)量相比，得方法回收率，測定值<15%，定量限<20%②相對回收率532．精密度precision

①標(biāo)準(zhǔn)差SD②相對標(biāo)準(zhǔn)性偏差

RSD不大于15%，定量限不大于20%②日間精密度 日內(nèi)精密度2．精密度precision

①標(biāo)準(zhǔn)差SD543．靈敏度（sensitivity）

檢測的最小量（1）檢測限（LOD）從背景中檢測到的最小藥物濃度：S/N≥3的絕對量

LOD=3N/S（N噪間

S被測物信號/單位重量）N=1mm取2μg·ml樣品，20μl進(jìn)樣

峰度30mmLOD=4ng3．靈敏度（sensitivity）檢測的最小量（1）檢55（2）定量限(LOQ)

在一定精密度和準(zhǔn)確度前提下求得最低檢測量，通常以標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)作為一定量限，也可S/N=10作為定量限，實(shí)際測定時，滿足3~5個半衰期濃度，或Cmax1/10~1/20（2）定量限(LOQ)56（3）最低檢測濃度可以進(jìn)行定量測定的某一藥物的最低濃度，它與樣品體積大小等因素有關(guān)最低檢測濃度=LOQ/進(jìn)樣體積體內(nèi)濃度檢測限=儀器濃度檢測限×稀釋度

1ml→0.1ml體內(nèi)檢測限=儀×0.11ml→10ml體內(nèi)檢測限=儀×10（3）最低檢測濃度57（4）提高靈敏度的方法①提高儀器靈敏度

②提高進(jìn)樣量

③降低儀器噪音

④富集待測組分（4）提高靈敏度的方法586．穩(wěn)定性（stability）（1）長期貯存穩(wěn)定性

-20~-70℃（2）短期室溫穩(wěn)定性

室溫放置4~24h（3）冷凍解凍穩(wěn)定性

冷凍—解凍—冷凍—解凍（4）貯備液穩(wěn)定性貯備液在室溫或冷凍條件下6．穩(wěn)定性（stability）59體內(nèi)藥物分析體內(nèi)藥物分析60體內(nèi)藥物分析概述一、體內(nèi)藥物分析的定義研究生物機(jī)體中藥物及其代謝物和內(nèi)源性物質(zhì)的質(zhì)和量變化規(guī)律的分析方法學(xué)。

藥物分析,法醫(yī)鑒定,毒物分析

體內(nèi)藥物分析概述一、體內(nèi)藥物分析的定義61二、體內(nèi)藥物分析的意義（一）在新藥評價和開發(fā)中的意義

1．全面質(zhì)量控制(毒奶粉事件)

藥品三原則:安全,合理和有效

2．新藥報批

3．為設(shè)計(jì)新藥提供信息①從代謝產(chǎn)物中開發(fā)新藥(保泰松和羥基保泰松)②前藥設(shè)計(jì)③新劑型的研究，緩控釋、經(jīng)皮制劑等以上內(nèi)容必須通過測定體內(nèi)藥物濃度得以解決二、體內(nèi)藥物分析的意義（一）在新藥評價和開發(fā)中的意義62

1．血藥濃度與藥理作用思考題:劑量增加,藥效是否成正比增加???（二）臨床合理用藥中的意義1．血藥濃度與藥理作用（二）臨床合理用藥中的632.影響血藥濃度的因素（1）機(jī)體因素

a．生理因素:年齡、性別、生理狀況（妊娠期）

b．病理因素（胃腸道、肝臟、腎臟）

c．遺傳因素（乙?；D(zhuǎn)移酶代謝異煙肼、乙醇脫氫酶）（2）藥物因素

a．劑型因素（生物利用度問題）

b．藥物合并使用（酶抑、酶促）

c．環(huán)境因素（環(huán)境污染、食品、個人精神狀態(tài)）2.影響血藥濃度的因素（1）機(jī)體因素64分析目標(biāo)藥物在體內(nèi)的某些代謝產(chǎn)物常具有一定的生理活性,它們在體內(nèi)的變化規(guī)律對母體藥物的藥理學(xué)與毒理學(xué)評價特別重要.機(jī)體內(nèi)源性生物活性物質(zhì)往往參與機(jī)體重要的生理過程,其變化規(guī)律的異常改變也與某些疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)母藥藥物特有代謝產(chǎn)物體內(nèi)內(nèi)源性生物活性物質(zhì)分析目標(biāo)藥物在體內(nèi)的某些代謝產(chǎn)物常具有一定的生理活性,它們在65三、體內(nèi)藥物分析的對象CompanyLogo人動物鼠兔犬大鼠小鼠男女等等猴猩猩都是一些志愿者須動物管理與使用委員會同意三、體內(nèi)藥物分析的對象CompanyLogowww.the66CompanyLogo分析對象CompanyLogowww.themegallery.c67CompanyLogo藥物在體內(nèi)的形態(tài)游離型代謝產(chǎn)物游離型原藥結(jié)合型原藥結(jié)合型代謝產(chǎn)物情形極為復(fù)雜綴合物分子間力結(jié)合化學(xué)共價結(jié)合稱為兩類CompanyLogowww.themegallery.c68四、體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)1．干擾雜質(zhì)多(內(nèi)源性物質(zhì),分離純化)2．樣品濃度低(富集,凈化)3．取樣量少4．工作量大5．時間短6．有一定設(shè)備四、體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)1．干擾雜質(zhì)多(內(nèi)源性物質(zhì),分離純化69五、體內(nèi)藥物分析方法1.色譜分析法：TLC、、GC、HPLC、HPCE2.免疫分析法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、熒光免疫分析法等3.生物學(xué)方法：微生物學(xué)方法用于抗生素類藥物的體內(nèi)分析，如生物利用度，生物等效性或臨床TDM等體內(nèi)樣品測定五、體內(nèi)藥物分析方法1.色譜分析法：TLC、、GC、HPLC7071

第一節(jié)常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏一、生物樣品的采集與貯藏體內(nèi)藥物分析常用的分析品種有血液、尿液、唾液，也可用乳汁、淚液、腦脊液、膽汁等。12

第一節(jié)常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏一、生物樣品71（一）樣品的采集1．血樣血樣濃度與作用點(diǎn)的濃度密切相關(guān)，可以反映靶器官的濃度。血細(xì)胞血漿（plasma）血小板血清（serum）血細(xì)胞測定血樣中平均分布于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的藥濃抗凝自然全血血液（一）樣品的采集1．血樣血細(xì)胞血漿（plasma）血小板血清722．尿樣

目的：藥物劑量回收，藥物清除，藥物代謝和生物利用度特點(diǎn)：濃度高，易于收集，體內(nèi)代謝研究，應(yīng)水解分離優(yōu)點(diǎn)：易得，屬非損傷性取樣，樣品量大；尿中藥物濃度高，含有綴合物或代謝物，是研究代謝物結(jié)構(gòu)的首選樣品；蛋白含量極低，不需去蛋白處理。缺點(diǎn)：與血藥濃度不相關(guān)，難以反映藥物作用過程；受腎功能、pH影響；難以定時定量取樣，易污染；所含成分復(fù)雜，已知其中有紫外吸收的化合物就達(dá)數(shù)十種。2．尿樣

目的：藥物劑量回收，藥物清除，藥物代謝和生物利用度733．唾液

唾液是無損傷性采樣，易采集。一些藥物的唾液藥濃（S）與血漿游離藥濃(P)密切相關(guān)，因此，在TDM中可利用測定S代替P監(jiān)測；唾液樣品也可用于藥代動力學(xué)研究。優(yōu)點(diǎn)：不受時間和地點(diǎn)的限制，可反復(fù)采集，采集時無痛苦、無感染危險；唾液成分比血液、尿液簡單，提取方便，有時可直接上樣測定；有些唾液中藥物濃度可以反映血漿中游離型藥物濃度。3．唾液

唾液是無損傷性采樣，易采集。優(yōu)點(diǎn)：不受時間和地點(diǎn)7475

缺點(diǎn)：

唾液是各腺體分泌的的混合液體，其組成發(fā)生經(jīng)時變動。

S/P只有少數(shù)藥物是恒定值。

蛋白結(jié)合率較高的藥物，藥物在唾液中的濃度低。

對有些患者（昏迷）不能采集唾液樣品。16缺點(diǎn)：

唾液是各腺體分泌的的混合液體，其75（二）樣品的貯藏1．血樣（血漿、血清）及時分離→冷藏，-70℃加入穩(wěn)定劑NaF2．尿樣①尿中水、無機(jī)鹽、尿素等細(xì)菌的生長，4℃保存②加入防腐劑a．1%甲苯b．飽和氯仿c．pH改變3．唾液：同血樣（二）樣品的貯藏1．血樣（血漿、血清）及時分離→冷藏，-7677第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理與制備30%以上工作和費(fèi)用用在樣品前處理上18第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理與制備30%以上工作和費(fèi)用用在77二、生物樣品的預(yù)處理（一）預(yù)處理的目的將藥物從綴合物（尿）或結(jié)合物中釋放出來，以測定藥物的總濃度將微量藥物從復(fù)雜的介質(zhì)中純化、富集出來（分離濃縮）防止分析儀器的污染，提高測定靈敏度和選擇性等（出現(xiàn)渾濁和沉淀，雜質(zhì)多，與試劑起反應(yīng)，影響色譜柱壽命）二、生物樣品的預(yù)處理（一）預(yù)處理的目的78（二）處理方法選擇的一般原則1．藥物理化性質(zhì)

pKa親脂性揮發(fā)性溶解度光譜特征穩(wěn)定性2．濃度范圍靈敏的方法3．測定的目的定性定量母體代謝4．生物樣品的種類5．樣品處理與分析方法的選擇①專一性②靈敏性（二）處理方法選擇的一般原則1．藥物理化性質(zhì)79處理步驟與方法全血/血漿，組織(1)蛋白沉淀(2)調(diào)節(jié)pH選擇性溶劑提取放射免疫分析殘?jiān)瘜W(xué)衍生化(提取烴基化)堿回提酸回提HPLCUV、FLD、ECDTLC分光光度法UV、FLDGCFIDECDN/P-FIDGC-MS處理步驟與方法全血/血漿，組織(1)蛋白沉淀選擇性溶劑提取放80去除蛋白質(zhì)方法分離與富集方法微透析技術(shù)綴合物水解化學(xué)衍生化萃取如何進(jìn)行？常用體內(nèi)樣品預(yù)處理方法去除蛋白質(zhì)方法分離與富集方法微透析技術(shù)綴合物水解化學(xué)衍生化萃81CompanyLogo蛋白質(zhì)的去除加入與水混融的有機(jī)溶劑(乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃)加入中性鹽(飽和硫酸銨、硫酸鈉、枸櫞酸鹽)加入強(qiáng)酸(三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸)加入金屬沉淀劑(CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH)綴合物的水解酸水解(鹽酸)酶水解(葡糖酸苷酶、硫酸酯酶、枯草菌溶素)有機(jī)破壞(硝酸-高氯酸消化)分離、純化與濃集液-液萃取法

(Liquid-LiquidExtraction,LLE)液-固萃取法

(Liquid-SolidExtraction,LSE)溶解劑法(硝酸-高氯酸消化)常用體內(nèi)樣品預(yù)處理方法CompanyLogowww.themegallery.c82（三）生物樣品去蛋白處理目的：

去除蛋白質(zhì)可使結(jié)合型的藥物釋放出來，以便測定藥物的總濃度；去除蛋白質(zhì)也可預(yù)防提取過程中蛋白質(zhì)發(fā)泡，減少乳化的形成，以及可以保護(hù)儀器性能，延長使用期限（三）生物樣品去蛋白處理目的：

去除蛋白質(zhì)可使結(jié)合型831．加入與水能混溶的有機(jī)溶劑及中性鹽甲醇乙腈甲醇1:2乙腈1:1.5

（NH4）2SO4NaCl2．加入酸性沉淀劑三氯醋酸高氯酸苦味酸等使蛋白質(zhì)分子的陽離子形成不溶性鹽而↓，pH低于等電點(diǎn)1．加入與水能混溶的有機(jī)溶劑及中性鹽843．組織酶消化法加入酶使蛋白質(zhì)水解優(yōu)點(diǎn)：①平衡條件下進(jìn)行，可避免反應(yīng)和降解②可改善對蛋白結(jié)合率強(qiáng)的藥物的回收率③不產(chǎn)生乳化4．其他加熱超濾3．組織酶消化法85（四）生物樣品綴合物水解1．酸水解：0.1mol/LHCl，100℃，30min，條件較劇烈，易致藥物分解，空白值也高。2．酶水解：葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶，也可用二者的混和物。一般在pH4.5-7，37℃數(shù)小時，條件溫和，選擇性強(qiáng)，但費(fèi)用較高。3．溶劑解：綴合物（主要是硫酸酯）往往可通過加入的溶劑在萃取過程中被分解。為測定尿液中藥物總量，要將綴合物水解：（四）生物樣品綴合物水解1．酸水解：0.1mol/LH86CompanyLogo是以多孔半透膜（超濾膜）作為分離介質(zhì)的一種膜分離技術(shù)，選用不同的孔徑的不對稱膜，即可按照分子量大小進(jìn)行分離適合TDM血樣分析Therapeuticdrugmonitoring（五）超濾分離法CompanyLogowww.themegallery.c87why?某些藥物或者代謝產(chǎn)物極性大，揮發(fā)性低，或者對檢測器不夠靈敏，難以滿足常規(guī)HPLC及GC檢測的需要，因此進(jìn)行衍生HowforGC?硅烷化酰化烷基化不對稱化（六）化學(xué)衍生法why?某些藥物或者代謝產(chǎn)物極性大，揮發(fā)性低，或者對檢測器不88CompanyLogowhy?某些藥物或者代謝產(chǎn)物極性大，揮發(fā)性低，或者對檢測器不夠靈敏，難以滿足常規(guī)HPLC及GC檢測的需要，因此進(jìn)行衍生HowforLC?UVFL非對映衍生化CompanyLogowww.themegallery.c8990（五）分離、純化與濃集

有差別才有可能分離！

生物樣品含有大量可影響測定的內(nèi)源性雜質(zhì)，加上服用的藥物、代謝物、同時服用的其他藥物，組成一個極其復(fù)雜的混合物。

如何將微量的藥物從如此復(fù)雜的混合物中分離出來？31（五）分離、純化與濃集

有差別才有可能分離！90生物樣品的萃取優(yōu)點(diǎn)：①與雜質(zhì)分離②簡便③濃集④提取率高1、液液萃取法原理：多數(shù)藥物是親脂性的，在適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中的溶解度大于在水相中的溶解度，而生物樣品中的大多數(shù)內(nèi)源性雜質(zhì)是強(qiáng)極性的水溶性物質(zhì)（差別）。因而用有機(jī)溶劑萃取一次即可除去大部分雜質(zhì)，從大量的樣品中提取藥物經(jīng)濃集后測定。生物樣品的萃取優(yōu)點(diǎn)：①與雜質(zhì)分離②簡便③濃集④提取率高19192采用LLE要考慮的幾個問題（1）溶劑的選擇與純度要求純度AR以上①了解藥物與溶劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，按相似相溶原則選用②對藥物的未電離分子可溶，而對電離形式的分子不溶（光譜分析法）③沸點(diǎn)低、易揮發(fā)、濃集④與水不相混溶⑤無毒，不易燃燒⑥不易形成乳化（氯仿易乳化，毒性大）⑦具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和惰性⑧不影響紫外測定毒性大的盡量不用33采用LLE要考慮的幾個問題（1）溶劑的選擇與純度要求9293（3）水相的PH值

主要由藥物的pKa決定！

（2）有機(jī)溶劑相和水相的體積比1∶1或2∶1

由實(shí)際情況決定，文獻(xiàn)中有的10∶1以上生物樣品一般多在堿性下提?。?4（3）水相的PH值主要由藥物的pKa決定9394由于血藥濃度較低，提取時需濃集傳統(tǒng)的濃集方法主要有兩種：一種是在末次提取時加入的提取液盡量少，使被測組分提取到小體積溶劑中，然后直接吸出適量供測定。另一種是揮去提取溶劑后，再用少量適合的溶劑溶解后測定。35由于血藥濃度較低，提取時需濃集9495

衡量提取方法優(yōu)劣的一個重要指標(biāo)就是提取回收率，它是指藥物從生物樣品中被分離出來用于測定的比例，一般應(yīng)高于60%----乙酸乙酯、叔丁基甲基醚可用于80%藥物的萃取36衡量提取方法優(yōu)劣的一個重要指標(biāo)就是提取回9596文獻(xiàn)上常提到的LLE的缺點(diǎn)

傳統(tǒng)萃取方式回收率低、樣品用量大、繁瑣費(fèi)時、溶劑用量大、溶劑毒性大、易乳化、不能自動化操作37文獻(xiàn)上常提到的LLE的缺點(diǎn)傳統(tǒng)萃取方式回9697

關(guān)于固相萃取小柱：a.常見的固相萃取柱分為三部分：醫(yī)用聚丙烯柱管，多孔聚丙烯篩板(20μm)和填料(多為40-60μm，80-100μm)。b.常用規(guī)格：100mg/1ml，200mg/3ml，500mg/3ml，1g/6ml等。以100mg/1ml為例：其中100mg為填料的質(zhì)量，1ml是空柱管的體積。c.一次性使用：為避免交叉污染，保證檢測可靠性，SPE柱通常是一次性使用的。2.固相萃取(SolidPhaseExtraction，簡稱SPE)法38關(guān)于固相萃取小柱：b.常用規(guī)格：100mg/1ml9798SPE填料親脂型:大孔吸附樹脂，親脂性鍵合硅膠。親水型：硅膠、硅藻土。離子交換：苯磺酸基，羧基等。39SPE填料親脂型:大孔吸附樹脂，親脂性鍵合硅膠。9899固相萃取操作一般有五步：活化——甲醇潤濕小柱，活化填料，除去雜質(zhì)并創(chuàng)造一定的溶劑環(huán)境。平衡——水或適當(dāng)緩沖液沖洗小柱。上樣——將樣品用一定的溶劑溶解，轉(zhuǎn)移入柱并使組分保留在柱上。棄去廢液淋洗——水或緩沖液最大程度除去干擾物。洗脫——用小體積的溶劑將被測物質(zhì)洗脫下來并收集。親脂性鍵合相硅膠SPE柱的實(shí)驗(yàn)步驟：40固相萃取操作一般有五步：親脂性鍵合相硅膠SPE柱的實(shí)驗(yàn)步9910041100101親水型填料

用作SPE的親水型填料有硅藻土、硅膠、棉纖維等，其原理為分配作用。填料為支持物，水基質(zhì)中極性強(qiáng)的成分與填料結(jié)合牢固，流動相為與水不相混溶的有機(jī)溶劑，較親脂的藥物易分布于流動相，從而達(dá)到萃取的目的。

親水型填料SPE有較高的萃取回收率（大于80%），但洗脫劑用量較大（一般大于5ml），無濃集作用，萃取液較干凈。42親水型填料用作SPE的親水型填料有硅藻土、101102SPE優(yōu)點(diǎn)：1、不發(fā)生乳化；2、適應(yīng)的極性范圍較廣；3、提取效率高；4、方便快速；5、溶劑用量少；6、易于自動化；7、室溫下操作，尤其適于處理揮發(fā)性及對熱不穩(wěn)定的藥物。目前，商品化固相提取小柱（cartridge）的應(yīng)用已比較普遍。最大的缺點(diǎn)：貴20多元/支43SPE優(yōu)點(diǎn)：1、不發(fā)生乳化；2、適應(yīng)的極性范圍較廣；3、102103三種方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較44三種方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較103第三節(jié)體內(nèi)藥物分析方法的建立與評價一、分析方法根據(jù)藥物理化性質(zhì)，結(jié)構(gòu)特征，藥物濃度，干擾成分大小，實(shí)驗(yàn)?zāi)康撵`敏度專屬性色譜法++++++HPLCGC免疫法++++++免疫交叉反應(yīng)，重現(xiàn)性生物學(xué)方法++特異性較差，需與色譜法平行使用第三節(jié)體內(nèi)藥物分析方法的建立與評價一、分析方法根據(jù)藥物理化104二、分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù)方法的建立原始方法改進(jìn)→創(chuàng)新創(chuàng)立方法二、分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù)原始方法改進(jìn)→創(chuàng)新1051．做好文獻(xiàn)總結(jié)2．充分了解藥物特征及體內(nèi)狀況

pH、親脂性、溶解度、極性、光譜特征、藥動學(xué)參數(shù)、體內(nèi)代謝情況3．明確測定目的、要求目的4．結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件

設(shè)備條件

預(yù)處理方法藥濃監(jiān)測藥代動力學(xué)研究母體藥物和代謝物