CreloxPCRISPRCas技術(shù)和病毒載體在課件

Content第一節(jié)、Cre-loxP技術(shù)第二節(jié)、CRISPR-Cas9技術(shù)第三節(jié)、病毒工具簡(jiǎn)介第四節(jié)、組合應(yīng)用示例Content第一節(jié)、Cre-loxP技術(shù)2基因操作技術(shù)一覽基因操作技術(shù)一覽3Cre蛋白于1981年從P1噬菌體中被發(fā)現(xiàn)，屬于λInt酶超基因家族。Cre重組酶基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)1029bp,編碼343個(gè)氨基酸,38kDa,單體蛋白。Cre重組酶不僅具有催化活性，而且與限制酶相似，能特異地在兩個(gè)loxP位點(diǎn)間發(fā)生基因重組。Cre重組酶無(wú)需借助任何輔助因子，可作用于多種結(jié)構(gòu)的DNA底物，如線形、環(huán)狀甚至超螺旋DNA。loxP位點(diǎn)，是locusofX-overP1的縮寫(xiě)，來(lái)自P1噬菌體。間隔序列決定loxP的方向，如下所示：1.Cre-loxP技術(shù)簡(jiǎn)介13bp

8bp

13bpATAACTTCGTATA-NNNTANNN-TATACGAAGTTATCyclizationrecombinaseCre蛋白于1981年從P1噬菌體中被發(fā)現(xiàn)，屬于λInt酶超41.1Cre-loxP技術(shù)基本原理1.1Cre-loxP技術(shù)基本原理51.2Cre-loxP技術(shù)應(yīng)用1.2Cre-loxP技術(shù)應(yīng)用6啟動(dòng)子靶組織或細(xì)胞albumin肝臟insulin胰島b細(xì)胞adiposeprotein2脂肪細(xì)胞b-lactoglobin乳腺keratin5皮膚musclecreatinekinase骨骼肌myosin心臟protamine-1精子CD19B淋巴細(xì)胞proximallckT淋巴細(xì)胞Wnt-1orengrailed-2神經(jīng)系統(tǒng)與組織特異性啟動(dòng)子結(jié)合應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)Cre轉(zhuǎn)基因的空間控制1.2Cre-loxP技術(shù)應(yīng)用——組織特異性應(yīng)用啟動(dòng)子靶組織或細(xì)胞albumin肝臟insulin胰島b細(xì)胞7啟動(dòng)子誘導(dǎo)物Cre表達(dá)的靶組織Mx1IFN肝臟、免疫細(xì)胞CMV-tTAtetracycline廣泛表達(dá)CMV-ERtamoxifen廣泛表達(dá)與誘導(dǎo)性表達(dá)啟動(dòng)子結(jié)合應(yīng)用，對(duì)Cre轉(zhuǎn)基因的表達(dá)進(jìn)行控制—MerCreMer重組蛋白1.2Cre-loxP技術(shù)應(yīng)用——可誘導(dǎo)性應(yīng)用啟動(dòng)子誘導(dǎo)物Cre表達(dá)的靶組織Mx1IFN肝臟、免疫細(xì)胞CM81.3Cre-loxP技術(shù)仍有不足之處1.3Cre-loxP技術(shù)仍有不足之處9傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)主要依賴于基因同源重組，利用設(shè)計(jì)的同源臂替代靶基因片段，從而達(dá)到目的。但是同源重組在細(xì)胞中的發(fā)生概率極低，而且步驟比較復(fù)雜、耗時(shí)間、費(fèi)用也比較高。非同源末端連接（nonhomologousendjoining,NHEJ）2.CRISPR-Cas9技術(shù)傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)主要依賴于基因同源重組，利用設(shè)計(jì)的同源臂替10均由自然界存在的核酸酶系統(tǒng)改造而來(lái)均具有識(shí)別核酸堿基特異性的結(jié)構(gòu)域作用機(jī)制：均通過(guò)在細(xì)胞基因組創(chuàng)造雙鏈斷裂缺口，從而誘發(fā)細(xì)胞自身修復(fù)機(jī)制完成基因修飾新3代基因組編輯工具均由自然界存在的核酸酶系統(tǒng)改造而來(lái)新3代基因組編輯工具112.1CRISPR-Cas9技術(shù)來(lái)源2.1CRISPR-Cas9技術(shù)來(lái)源12N代表任意DNA堿基GuideRNA:crRNA（CRISPR-derivedRNA）通過(guò)堿基配對(duì)與tracrRNA（trans-activatingcrRNA）結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物。通過(guò)人工設(shè)計(jì)這兩種RNA，可以改造形成具有引導(dǎo)作用的sgRNA（shortguideRNA）Cas9:復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA。HNH結(jié)構(gòu)域剪切配對(duì)的部分，Ruvc結(jié)構(gòu)域剪切未配對(duì)的鏈。DNA、RNA和蛋白質(zhì)聚合物2.2CRISPR-Cas9系統(tǒng)組成N代表任意DNA堿基GuideRNA:DNA、RNA和蛋131.

靶基因分析：明確CDS外顯子部分；2.

sgRNA位點(diǎn)設(shè)計(jì)：確定待敲除位點(diǎn)，對(duì)于蛋白編碼基因，如果該蛋白具有重要結(jié)構(gòu)功能域，可考慮將基因敲除位點(diǎn)設(shè)計(jì)在編碼該結(jié)構(gòu)域的外顯子；如果不能確定基因產(chǎn)物性質(zhì)，可選擇將待敲除位點(diǎn)放在起始密碼子ATG后的外顯子上。如果是microRNA，可以將待敲除位點(diǎn)設(shè)計(jì)在編碼成熟microRNA的外顯子或在編碼成熟microRNA的外顯子的5’和3’側(cè)翼序列。3.

Cas9載體構(gòu)建：根據(jù)sgRNA序列，設(shè)計(jì)引物，合成帶粘性末端的雙鏈片段。對(duì)表達(dá)載體先進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，得到線性化載體，再把前面得到的雙鏈片段連接入表達(dá)載體。再進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的鑒定；4.

Cas9載體活性檢測(cè)：轉(zhuǎn)染細(xì)胞，采用特異性片段擴(kuò)增后進(jìn)行的T7E1酶切處理，進(jìn)行重組效率的檢測(cè)。2.3CRISPR-Cas9技術(shù)流程1.

靶基因分析：明確CDS外顯子部分；2.3CRISP141.

CRISPR-Cas9系統(tǒng)的可用位點(diǎn)更多：理論上基因組中每8個(gè)堿基就能找到一個(gè)可用CRISPR-Cas9進(jìn)行編輯的位點(diǎn)，而TALEN和ZFN系統(tǒng)則在數(shù)百甚至上千個(gè)堿基中才能找到一個(gè)可用位點(diǎn)；2.

CRISPR-Cas9系統(tǒng)更具有可拓展性：例如可以通過(guò)對(duì)Cas9蛋白的修飾，讓它不切斷DNA雙鏈，而只是切開(kāi)單鏈，這樣可以大大降低切開(kāi)雙鏈后帶來(lái)的非同源末端連接造成的染色體變異風(fēng)險(xiǎn)；此外還可以將Cas9蛋白連接其他功能蛋白，從而在特定DNA序列上研究這些蛋白對(duì)細(xì)胞的影響；3.

CRISPR-Cas9系統(tǒng)的使用極為方便，只需要簡(jiǎn)單的幾步就能完成，幾乎任何實(shí)驗(yàn)室都可以開(kāi)展工作，因此省時(shí)省力；4.

可同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行操作而ZFNs和TALEN兩項(xiàng)技術(shù)則難以實(shí)現(xiàn)這種效果。5.多種功能性蛋白都可以通過(guò)與Cas9蛋白融合，然后利用gRNA的靶向作用結(jié)合到dsDNA的任意位點(diǎn)，發(fā)揮人們預(yù)期的功能。2.4CRISPR-Cas9技術(shù)優(yōu)勢(shì)2.4CRISPR-Cas9技術(shù)優(yōu)勢(shì)153.病毒載體3.病毒載體163.1病毒載體比較3.1病毒載體比較173.1病毒載體比較3.1病毒載體比較18組成型啟動(dòng)子-感染特性決定表達(dá)分布3.2病毒載體應(yīng)用組成型啟動(dòng)子-感染特性決定表達(dá)分布3.2病毒載體應(yīng)用19特異性啟動(dòng)子-空間和時(shí)間精細(xì)表達(dá)3.2病毒載體應(yīng)用特異性啟動(dòng)子-空間和時(shí)間精細(xì)表達(dá)3.2病毒載體應(yīng)用204組合應(yīng)用示例——Cre-loxP與病毒工具結(jié)合4組合應(yīng)用示例——Cre-loxP與病毒工具結(jié)合21“條件性基因激活”模式4.1Cre-loxP與病毒工具結(jié)合應(yīng)用“條件性基因激活”模式4.1Cre-loxP與病毒工具結(jié)合224.1Cre-loxP與病毒工具結(jié)合應(yīng)用4.1Cre-loxP與病毒工具結(jié)合應(yīng)用23B4.2Cas9系統(tǒng)與病毒工具結(jié)合應(yīng)用B4.2Cas9系統(tǒng)與病毒工具結(jié)合應(yīng)用244.2Cas9系統(tǒng)與病毒工具結(jié)合應(yīng)用4.2Cas9系統(tǒng)與病毒工具結(jié)合應(yīng)用254.3Cre-loxP、CRISPR-Cas9與病毒結(jié)合應(yīng)用Cre-dependentCas9mice4.3Cre-loxP、CRISPR-Cas9與病毒結(jié)合應(yīng)26思考題闡述Cre-LoxP技術(shù)的基本原理和程序。CRISPR-Cas9技術(shù)與ZFN、TALEN相比均有哪些優(yōu)勢(shì)？舉例說(shuō)明CRISPR-Cas9技術(shù)與病毒工具的組合應(yīng)用。思考題27Thanksforyourattention!Thanksforyourattention!28Content第一節(jié)、Cre-loxP技術(shù)第二節(jié)、CRISPR-Cas9技術(shù)第三節(jié)、病毒工具簡(jiǎn)介第四節(jié)、組合應(yīng)用示例Content第一節(jié)、Cre-loxP技術(shù)29基因操作技術(shù)一覽基因操作技術(shù)一覽30Cre蛋白于1981年從P1噬菌體中被發(fā)現(xiàn)，屬于λInt酶超基因家族。Cre重組酶基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)1029bp,編碼343個(gè)氨基酸,38kDa,單體蛋白。Cre重組酶不僅具有催化活性，而且與限制酶相似，能特異地在兩個(gè)loxP位點(diǎn)間發(fā)生基因重組。Cre重組酶無(wú)需借助任何輔助因子，可作用于多種結(jié)構(gòu)的DNA底物，如線形、環(huán)狀甚至超螺旋DNA。loxP位點(diǎn)，是locusofX-overP1的縮寫(xiě)，來(lái)自P1噬菌體。間隔序列決定loxP的方向，如下所示：1.Cre-loxP技術(shù)簡(jiǎn)介13bp

8bp

13bpATAACTTCGTATA-NNNTANNN-TATACGAAGTTATCyclizationrecombinaseCre蛋白于1981年從P1噬菌體中被發(fā)現(xiàn)，屬于λInt酶超311.1Cre-loxP技術(shù)基本原理1.1Cre-loxP技術(shù)基本原理321.2Cre-loxP技術(shù)應(yīng)用1.2Cre-loxP技術(shù)應(yīng)用33啟動(dòng)子靶組織或細(xì)胞albumin肝臟insulin胰島b細(xì)胞adiposeprotein2脂肪細(xì)胞b-lactoglobin乳腺keratin5皮膚musclecreatinekinase骨骼肌myosin心臟protamine-1精子CD19B淋巴細(xì)胞proximallckT淋巴細(xì)胞Wnt-1orengrailed-2神經(jīng)系統(tǒng)與組織特異性啟動(dòng)子結(jié)合應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)Cre轉(zhuǎn)基因的空間控制1.2Cre-loxP技術(shù)應(yīng)用——組織特異性應(yīng)用啟動(dòng)子靶組織或細(xì)胞albumin肝臟insulin胰島b細(xì)胞34啟動(dòng)子誘導(dǎo)物Cre表達(dá)的靶組織Mx1IFN肝臟、免疫細(xì)胞CMV-tTAtetracycline廣泛表達(dá)CMV-ERtamoxifen廣泛表達(dá)與誘導(dǎo)性表達(dá)啟動(dòng)子結(jié)合應(yīng)用，對(duì)Cre轉(zhuǎn)基因的表達(dá)進(jìn)行控制—MerCreMer重組蛋白1.2Cre-loxP技術(shù)應(yīng)用——可誘導(dǎo)性應(yīng)用啟動(dòng)子誘導(dǎo)物Cre表達(dá)的靶組織Mx1IFN肝臟、免疫細(xì)胞CM351.3Cre-loxP技術(shù)仍有不足之處1.3Cre-loxP技術(shù)仍有不足之處36傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)主要依賴于基因同源重組，利用設(shè)計(jì)的同源臂替代靶基因片段，從而達(dá)到目的。但是同源重組在細(xì)胞中的發(fā)生概率極低，而且步驟比較復(fù)雜、耗時(shí)間、費(fèi)用也比較高。非同源末端連接（nonhomologousendjoining,NHEJ）2.CRISPR-Cas9技術(shù)傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)主要依賴于基因同源重組，利用設(shè)計(jì)的同源臂替37均由自然界存在的核酸酶系統(tǒng)改造而來(lái)均具有識(shí)別核酸堿基特異性的結(jié)構(gòu)域作用機(jī)制：均通過(guò)在細(xì)胞基因組創(chuàng)造雙鏈斷裂缺口，從而誘發(fā)細(xì)胞自身修復(fù)機(jī)制完成基因修飾新3代基因組編輯工具均由自然界存在的核酸酶系統(tǒng)改造而來(lái)新3代基因組編輯工具382.1CRISPR-Cas9技術(shù)來(lái)源2.1CRISPR-Cas9技術(shù)來(lái)源39N代表任意DNA堿基GuideRNA:crRNA（CRISPR-derivedRNA）通過(guò)堿基配對(duì)與tracrRNA（trans-activatingcrRNA）結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物。通過(guò)人工設(shè)計(jì)這兩種RNA，可以改造形成具有引導(dǎo)作用的sgRNA（shortguideRNA）Cas9:復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA。HNH結(jié)構(gòu)域剪切配對(duì)的部分，Ruvc結(jié)構(gòu)域剪切未配對(duì)的鏈。DNA、RNA和蛋白質(zhì)聚合物2.2CRISPR-Cas9系統(tǒng)組成N代表任意DNA堿基GuideRNA:DNA、RNA和蛋401.

靶基因分析：明確CDS外顯子部分；2.

sgRNA位點(diǎn)設(shè)計(jì)：確定待敲除位點(diǎn)，對(duì)于蛋白編碼基因，如果該蛋白具有重要結(jié)構(gòu)功能域，可考慮將基因敲除位點(diǎn)設(shè)計(jì)在編碼該結(jié)構(gòu)域的外顯子；如果不能確定基因產(chǎn)物性質(zhì)，可選擇將待敲除位點(diǎn)放在起始密碼子ATG后的外顯子上。如果是microRNA，可以將待敲除位點(diǎn)設(shè)計(jì)在編碼成熟microRNA的外顯子或在編碼成熟microRNA的外顯子的5’和3’側(cè)翼序列。3.

Cas9載體構(gòu)建：根據(jù)sgRNA序列，設(shè)計(jì)引物，合成帶粘性末端的雙鏈片段。對(duì)表達(dá)載體先進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，得到線性化載體，再把前面得到的雙鏈片段連接入表達(dá)載體。再進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的鑒定；4.

Cas9載體活性檢測(cè)：轉(zhuǎn)染細(xì)胞，采用特異性片段擴(kuò)增后進(jìn)行的T7E1酶切處理，進(jìn)行重組效率的檢測(cè)。2.3CRISPR-Cas9技術(shù)流程1.

靶基因分析：明確CDS外顯子部分；2.3CRISP411.

CRISPR-Cas9系統(tǒng)的可用位點(diǎn)更多：理論上基因組中每8個(gè)堿基就能找到一個(gè)可用CRISPR-Cas9進(jìn)行編輯的位點(diǎn)，而TALEN和ZFN系統(tǒng)則在數(shù)百甚至上千個(gè)堿基中才能找到一個(gè)可用位點(diǎn)；2.

CRISPR-Cas9系統(tǒng)更具有可拓展性：例如可以通過(guò)對(duì)Cas9蛋白的修飾，讓它不切斷DNA雙鏈，而只是切開(kāi)單鏈，這樣可以大大降低切開(kāi)雙鏈后帶來(lái)的非同源末端連接造成的染色體變異風(fēng)險(xiǎn)；此外還可以將Cas9蛋白連接其他功能蛋白，從而在特定DNA序列上研究這些蛋白對(duì)細(xì)胞的影響；3.

CRISPR-Cas9系統(tǒng)的使用極為方便，只需要簡(jiǎn)單的幾步就能完成，幾乎任何實(shí)驗(yàn)室都可以開(kāi)展工作，因此省時(shí)省力；4.

可同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行操作而ZFNs和TALEN兩項(xiàng)技術(shù)則難以實(shí)現(xiàn)這種效果。5.多種功能性蛋白都可以通過(guò)與Cas9蛋白融合，然后利用gRNA的靶向作用結(jié)合到dsDNA的任意位點(diǎn)，發(fā)揮人們預(yù)期的功能。2.4CRISPR-Cas9技術(shù)優(yōu)勢(shì)2.4CRISPR-Cas9技術(shù)優(yōu)勢(shì)423.病毒載體3.病毒載體433.1病毒載體