qRT-PCR-生物分析檢測(cè)技術(shù)課件

第二節(jié)實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、技術(shù)原理及應(yīng)用一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的技術(shù)原理

1.定量與常規(guī)的差別2.熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)3.熒光閾值和CT值

4.熔解曲線(xiàn)5.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

6.何為實(shí)時(shí)？7.SYBRGreenI的工作原理8.MolecularBeacons（發(fā)夾型雜交探針）的工作原理9.TaqMan（水解型雜交探針）的工作原理10.多色多通道技術(shù)應(yīng)用——基因表達(dá)分析11.內(nèi)標(biāo)技術(shù)介紹三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用介紹1.醫(yī)療方面2.研究方面

3.其它方面四、熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)室所需儀器設(shè)備清單五、實(shí)時(shí)定量PCR及應(yīng)用于植物分子生物學(xué)的研究不產(chǎn)熱的光源---

發(fā)光二極管（LED）靈敏度高的檢測(cè)器---

光電倍增管（PMT）優(yōu)點(diǎn)：

不產(chǎn)熱---無(wú)散熱裝置，全封閉無(wú)機(jī)械轉(zhuǎn)動(dòng)裝置---抗震性強(qiáng)無(wú)需經(jīng)常校準(zhǔn)，耐用靈敏度高線(xiàn)性范圍廣

Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀熒光檢測(cè)熱循環(huán)儀光色:藍(lán)色光均一性:±0.4°C染料:FAM,SYBRGreenI,MolecularbeaconsTaqManProbes

精確性:±0.3°C激發(fā)光波長(zhǎng)：450-495nm發(fā)射光波長(zhǎng):515-545nm

升降溫速率:最高3°C/秒.靈敏度:<5nM的熒光素溫度梯度:有檢測(cè)范圍:100-108拷貝容量:96樣品反應(yīng)管:0.2mL反應(yīng)管&96孔板操作系統(tǒng):WindowsNT二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的技術(shù)原理1.定量與常規(guī)的差別常規(guī)PCR技術(shù)：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析定量PCR技術(shù)：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡(jiǎn)介實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡(jiǎn)介

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡(jiǎn)介

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡(jiǎn)介實(shí)時(shí)熒光定量PCR：其反應(yīng)體系中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)。3.熒光閾值和CT值

熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。熒光閾值線(xiàn)的位置一般事實(shí)上位于減去本底的位置上，這時(shí)的熒光信號(hào)超過(guò)了熒光背景信號(hào)并且開(kāi)始增加。對(duì)某一樣品的C（t）值就定義為熒光量與熒光閾值線(xiàn)交叉時(shí)的循環(huán)數(shù)。即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱(chēng)為CT值（thresholdvalue）。

定量熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)是熒光量與循環(huán)數(shù)的圖表。4.熔解曲線(xiàn)在PCR結(jié)束后，我們可以根據(jù)變性過(guò)程中的熒光值變化繪出每個(gè)樣品的熔解曲線(xiàn)。繪制熔解曲線(xiàn)時(shí)，Real-TimePCR儀連續(xù)監(jiān)測(cè)每個(gè)樣品在從雙鏈完全配對(duì)到完全解鏈的升溫過(guò)程中熒光值的變化過(guò)程。不同的擴(kuò)增產(chǎn)物因?yàn)槠溟L(zhǎng)度和GC含量不同而在不一樣的溫度下解鏈，當(dāng)產(chǎn)物解鏈時(shí)，SYBRGreenⅠ的熒光值將降低并被儀器監(jiān)測(cè)到。由此繪制出熒光強(qiáng)度隨溫度變化的負(fù)一次倒數(shù)圖。熒光強(qiáng)度變化的拐點(diǎn)（熔點(diǎn)，Tm）即為熔解峰值。熔解曲線(xiàn)是擴(kuò)增反應(yīng)的質(zhì)控途徑，當(dāng)圖中沒(méi)有出現(xiàn)雜峰，也未出現(xiàn)主峰的異常增寬：表明實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)污染、引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。

5.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)CT值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個(gè)模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線(xiàn)性關(guān)系：起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其中橫坐標(biāo)代表CT值，縱坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)（如圖3所示）。因些只要獲得未知樣品的CT值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。Thistechnologyisvery

sensitiveinthatitisabletodetectsinglecopiesofgenesandrequiresverylittlestartingmaterialacrossawidespectrumofconditions.ThesystemmonitorsPCRateachcycleofareaction,andestimatesthecyclewhenthereactionreacheslogphaseincrements(whenthemostusefulquantitativeinformationaboutthesampleisavailable)Quantitationcanbe"relative"toaninternalstandardsuchasahousekeepinggene,or"absolute"whencomparedtoastandardcurvegeneratedfromknownconcentrations.SYBRGreenⅠ的特點(diǎn)由于它與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，不必因?yàn)槟０宀煌貏e定制，因此通用性好，且價(jià)格相對(duì)較低。利用熒光染料可以指示雙鏈DNA熔點(diǎn)的性質(zhì)，通過(guò)熔點(diǎn)曲線(xiàn)分析可以識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體，因而可以區(qū)分非特異擴(kuò)增。此外，由于一個(gè)PCR產(chǎn)物可以與多個(gè)分子的染料結(jié)合，因此SYBRGreenⅠ的檢測(cè)靈敏度很高。但是，由于SYBRGreenⅠ與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽(yáng)性會(huì)影響定量的精確性。通過(guò)測(cè)量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響。由熔解曲線(xiàn)來(lái)分析產(chǎn)物的均一性有助于更準(zhǔn)確地分析SYBRGreenI。MolecularBeacons（發(fā)夾型雜交探針）的工作原理原理：熒光諧振能量傳遞（FRET）

環(huán)與目標(biāo)序列完全配對(duì)

莖由互補(bǔ)配對(duì)的序列組成變性:產(chǎn)生非特異性的熒光延伸:沒(méi)有熒光分子Beacons是一種在靶DNA不存在時(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針。在此發(fā)夾結(jié)構(gòu)中：位于分子一端的熒光基團(tuán)與分子另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。在此結(jié)構(gòu)中，熒光基團(tuán)被激發(fā)后不是產(chǎn)生光子，而是將能量傳遞給淬滅劑，這一過(guò)程稱(chēng)為熒光諧振能量傳遞（FRET）。分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)：是一個(gè)具有莖－環(huán)（loop-stem）結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針，通常有25～35個(gè)核苷酸，兩端分別標(biāo)上一個(gè)熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。分子Beacons的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)的部分用于與靶序列雜交（與目標(biāo)序列互補(bǔ)），通常由15～30個(gè)核苷酸組成，要求與靶序列雜交后能形成與探針－靶序列雙螺旋有關(guān)的反式構(gòu)型，并使干的部分打開(kāi)，盡量得使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開(kāi)足夠的距離。一般莖（干的部分）一般5-8個(gè)核苷酸長(zhǎng)（堿基對(duì)），并相互配對(duì)形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)連接在莖臂的一端，一般連在5’端；而淬滅基團(tuán)一般連在3’端。通常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作為淬滅基團(tuán)。分子Beacons必須非常仔細(xì)的設(shè)計(jì)，以致于在復(fù)性溫度下：

模板不存在時(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)；

模板存在時(shí)則與模板配對(duì)。自由狀態(tài)時(shí)，分子信標(biāo)呈發(fā)夾型結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)靠得很近，二者之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移（FRET和直接能量轉(zhuǎn)移），熒光基團(tuán)的能量被淬滅基團(tuán)吸收并以熱的形式散發(fā)，熒光幾乎完全被猝滅。。當(dāng)有靶序列存在的時(shí)候，靶序列和分子信標(biāo)的探針序列雜交形成有一定剛性的雙螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致分子信標(biāo)的構(gòu)象改變，干的部分打開(kāi)，熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)分開(kāi)，二者之間的能量轉(zhuǎn)移終止；在有相應(yīng)的單色光激活時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)出熒光。熒光強(qiáng)度與溶液中靶序列的多少成正比，通過(guò)檢測(cè)熒光的強(qiáng)度就可以計(jì)算出靶序列的量。Beacons與模板配對(duì)后：分子Beacons的構(gòu)象改變使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開(kāi)；當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時(shí)，它發(fā)出自身波長(zhǎng)的光子。分子Beacons不同于SYBRGreen的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是它特異性地檢測(cè)感興趣的目標(biāo)DNA。通過(guò)精心設(shè)計(jì)分子Beacons和優(yōu)化反應(yīng)條件（溫度和緩沖液）后，其靈敏度非常高，可用于單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的檢測(cè)。但是，為檢測(cè)某一特定的目標(biāo)DNA，每一個(gè)探針都必須單獨(dú)仔細(xì)地設(shè)計(jì)。

分子Beacons是美國(guó)紐約公共健康研究學(xué)會(huì)的技術(shù)專(zhuān)利。MolecularBeacons

的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)

定量起始模板濃度基因型分析鑒定產(chǎn)物單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測(cè)對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性，用于SNP檢測(cè)的最靈敏的試劑之一熒光背景低設(shè)計(jì)困難無(wú)終點(diǎn)分析功能只能用于一個(gè)特定的目標(biāo)價(jià)格較高9.

TaqMan（水解型雜交探針）的工作原理

目標(biāo)特異性探針5’為熒光素，3’為淬滅劑模板和探針雜交

延伸:聚合反應(yīng)，Taq酶切下5’端熒光素出現(xiàn)熒光TaqMan(水解型雜交探針)的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)

定量起始模板濃度基因型分析產(chǎn)物鑒定

SNP分析對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性,特別適合于SNP檢測(cè)與MolecularBeacons相比，設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單價(jià)格較高只適合于一個(gè)特定的目標(biāo)

不能進(jìn)行融解曲線(xiàn)分析QuantitativeReal-TimePolymeraseChainReactionfortheCoreFacilityUsingTaqManandthePerkin-Elmer/AppliedBiosystemsDivision7700SequenceDetector

DeborahS.Grove

NucleicAcidFacility,LifeScienceConsortium,ThePennsylvaniaStateUniversity,UniversityPark,PA16802

Probe

Aprobe(ie,TaqMan)isdesignedtoannealtothetargetsequencebetweenthetraditionalforward

andreverseprimers.Theprobeislabeledatthe5‘endwithareporterfluorochrome(usually6-carboxyfluorescein[6-FAM]，6-羧基熒光素)andaquencherfluorochrome(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine

[TAMRA],6-羧基-四甲基-若丹明)addedatanyTpositionoratthe3'end.TheprobeisdesignedtohaveahigherTm

thantheprimers,andduringtheextensionphase,theprobemustbe100%hybridized

forsuccessoftheassay.PrincipleAslongasbothfluorochromesareontheprobe,thequenchermoleculestopsallfluorescencebythereporter.However,asTaqpolymeraseextendstheprimer,theintrinsic（內(nèi)在的，固有的）5'to3'nucleaseactivityofTaqdegradestheprobe,releasingthereporterfluorochrome.Theamountoffluorescencereleasedduringtheamplificationcycleisproportionaltotheamountofproductgeneratedineachcycle.

Fluorogenic5'nucleasechemistry.(1)ForwardandreverseprimersareextendedwithTaqpolymeraseasinatraditionalPCRreaction.Aprobewithtwofluorescentdyesattachedannealstothegenesequencebetweenthetwoprimers.(2)Asthepolymeraseextendstheprimer,theprobeisdisplaced.(3)Aninherentnucleaseactivityinthepolymerasecleavesthereporterdyefromtheprobe.(4)Afterreleaseofthereporterdyefromthequencher,afluorescentsignalisgenerated.ThesensitivityofdetectionallowsacquisitionofdatawhenPCRamplificationisstillintheexponentialphase.Thisisdeterminedbyidentifyingthecyclenumberatwhichthereporterdyeemissionintensitiesrisesabovebackgroundnoise;thiscyclenumberiscalledthethresholdcycle(Ct).TheCtisdeterminedatthemostexponentialphaseofthereactionandismorereliable.TheCt

isinverselyproportionaltothecopynumberofthetargettemplate;thehigherthetemplateconcentration,thelowerthethresholdcyclemeasured.

Oneoftheviewsavailableaftercompletionoftherunisanamplificationwindow.Thiswindowshowstheamountoffluorescenceobtainedineachamplificationcycleforeachreaction.Thethresholdcycle(Ct)isshownbythedarkerhorizontalline.AdvantageProvidesanaccuratemethodfordeterminationoflevelsofspecificDNAandRNAsequencesintissuesamples.BasedondetectionofafluorescentsignalproducedproportionallyduringamplificationofaPCRproduct.

Turn-aroundtimefordataacquisitionandanalysisisshort,ResultsaremorereliablethanbytraditionalPCRmethods.SybrgreenIdetectionislessexpensiveandnosequence

specificprobeisrequired.Userswillalsoneedtopurchaseflat-top,opticalcapsor0.2mm

thermalmicroseal

filmfortheirplates.Allotherplatesandcapswillnotworkwiththenewmachines.ApplicationsTheapplicationsforquantitativereal-timePCRareinnumerable（數(shù)不清的）.

DetectionofgenomicorviralDNAintissuescanbeavaluablediagnostictool.

GeneexpressioncanbemeasuredafterextractionoftotalRNAandpreparationofcDNAbyareversetranscription(RT)step.Setupandanalysisaresimpleandcanmoreeasilybeextendedtotheclinicalenvironment

thantraditionalPCRtechniques.Anallelicdiscriminationassaythatcandetectsingle-basenucleotidemutationsandpolymorphisms.Allelic(等位基因的)discriminationassayTheseassaysrequiretwoseparateprobesthatdifferonlybyonebasemismatch.Oneprobelabeledwith6-FAM(6-羧基熒光素)representsoneallele（等位基因）,andtheotherprobelabeledwiththefluorochromeVICrepresentstheotherallele.Amismatchleadsto

alessefficientamplification.Fluorescencespectraarecollectedaftertherun,andusingmulticomponentanalysis,thesoftwareextractsthecontributionofeachcomponentdyetotheobservedspectrum.HomozygotesforFAMshowanincreaseintheFAMsignalbutnoincreaseintheVICsignal,andhomozygotesfortheVICprobeshowanincreaseinthatsignal.Heterozygotes（雜合子）showintermediateincreasesofFAMandVICsignals.Allthreegroupsareclearlydistinguishable,andthesensitivityissimilartothatforthequantitativePCRapplication

10.多色多通道技術(shù)應(yīng)用

——基因表達(dá)分析PRIMERANDPROBEDESIGN

Primersandprobesmustbecarefullydesignedbecauseofthecostsassociatedwithproducingprobeswithdifferentdyesat5'and3'ends.

PE/ABDPrimerExpresssoftware,

whichisspecificallydesignedtoselecttheprimersandprobes.Therequiredparametersforwell-designedprimersandprobehavebeenwellbuiltintotheprogram.TheseparametersincludeaTmfortheprobethatis10°Chigherthantheprimers,primerTmisbetween58°Cand60°C,ampliconsizebetween50and150bases,absenceof5'Gs.Primerandprobedesignisdifferentfortheallelicdiscriminationassays.Theprobesdesignedforeachalleleshouldbecenteredoverthemismatchedbase,andtheprobesonly

havetodifferbythatbase.AnothermajordifferenceisthattheprobefortheseassayshasalowerTmrequirementthantheTaqManPCRassays.

PrescreeningassaySYBRGreencanbeusedasa"probeless"alternativetotheTaqMansystem.Becauseitbindstoalldouble-strandedDNA,itisimperativetoensurethatthePCRproductbeingquantifiedisaclean,singleproduct,becauseanyprimer-dimersorbackgroundsmearsaredetected.Itcanbeusedasaprescreeningassaybeforeorderingaprobe.Iftheresultsaresatisfactory,theprobecanbeorderedandTaqManreactionsrunwithhigherspecificity.

11.內(nèi)標(biāo)技術(shù)介紹三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用介紹熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用對(duì)DNA、RNA樣品進(jìn)行定量和定性分析定量分析包括絕對(duì)定量分析和相對(duì)定量分析。前者可以得到某個(gè)樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度；后者可以對(duì)不同方式處理的兩個(gè)樣本中的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較?？梢圆欢ㄆ趯?duì)PCR產(chǎn)物或樣品進(jìn)行定性分析如：利用熔解曲線(xiàn)分析識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體，以區(qū)分非特異擴(kuò)增；利用特異性探針進(jìn)行基因型分析及SNP檢測(cè)等。目前實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域。其中最主要的應(yīng)用集中在以下幾個(gè)方面：比較經(jīng)過(guò)不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異（如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等），及特定基因在不同相的表達(dá)差異；比較正常組織與病理組織中各種mRNA表達(dá)量差異；驗(yàn)證基因芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果；驗(yàn)證RNA干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。四、熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)室所需儀器設(shè)備清單專(zhuān)用工作服和工作鞋專(zhuān)用辦公用品一次性手套、一次性吸水紙微量加樣器一套（覆蓋1~1000ul）

以上物品各一套。2~8℃和-20℃或-80℃冰箱混勻器耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾心）高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)五、實(shí)時(shí)定量PCR及應(yīng)用于植物分子生物學(xué)的研究Microarray最強(qiáng)大的功能是平行分析，在單次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)觀察上萬(wàn)種RNA的相對(duì)量變，也因?yàn)槠叫刑幚碇?，無(wú)法對(duì)每一個(gè)probe做最佳化、標(biāo)準(zhǔn)化，所以目前大部份結(jié)果都會(huì)再以

NorthernblotorReal-timequantitativePCR再做確認(rèn)。雖然Northernblot在過(guò)去曾扮演十分稱(chēng)職的角色，但有時(shí)microarray篩選出來(lái)的基因常有上千個(gè)譜，以傳統(tǒng)方法來(lái)驗(yàn)證，仍是耗費(fèi)人力物力的苦差事。

Real-timequantitativePCR

在近年來(lái)迅速普及，原因在其高靈敏度、快速及精確，樣品需求量少也是很重要的優(yōu)勢(shì)，是最適合承接microarray驗(yàn)證的工具。

LaserCapturedMicrodissection(LCM)

RealTimeQuantitativePCR：量化組織中特定基因之表現(xiàn)共聚焦顯微影像系統(tǒng)(ConfocalImagingSystem)流速細(xì)胞篩選分析系統(tǒng)(FlowCytometry)以上技術(shù)就基因表現(xiàn)之各個(gè)面相作系統(tǒng)探討。

實(shí)驗(yàn)程序（舉例）RNA的定量：RNA的測(cè)量?jī)x上，以NonoDrop軟件進(jìn)行RNA的定量(ng/μl)。如濃度過(guò)高必須稀釋后再定量，以便定量盡可能地準(zhǔn)確。同時(shí)，可從260/280的比值看出RNA的純度(一般在1.9-2.1之間)是否在要求的范圍內(nèi)。RNA的反轉(zhuǎn)錄及cDNA模板的稀釋?zhuān)河米鱎NA反轉(zhuǎn)錄的RNA量，在鹽芥和擬南芥兩種材料、各200mMNaCl處理2小時(shí)及對(duì)照的4種RNA之間必須完全準(zhǔn)確一致，即Ara200、Ara0、Th200、Th0的RNA量均為2000ng。以下的反轉(zhuǎn)錄體系中RNA和RNase-freeH2O的總體積為8.5μl

。RNA+RNase-freeH2O：8.5μl(2000ngRNA)Oligo-dT18(500ng/μl)：0.5μldNTP(2.5mM/each)：4μl計(jì)

：13μl該體系于65-70℃，5min；置于冰上冷卻后，加下面反應(yīng)體系：5×

RTBuffer：4μl0.1MDTT：2μlSuperScriptIIIRT：1μl總計(jì)：20μl混勻，50℃保持6小時(shí)或過(guò)夜，即得到20μlcDNA；該cDNA稀釋20倍，即為400μl稀釋的cDNA，此用于實(shí)時(shí)定量PCR作為反應(yīng)模板。

DTT即Dithiothreitol，中文名為二硫蘇糖醇。分子式為C4H10O2S2。

是一種常用d的小分子有機(jī)還原劑，有抗氧化作用。二硫蘇糖醇的名字衍生自蘇糖（一種四碳單糖）。DTT的異構(gòu)體為Dithioerythritol（DTE），即DTT的氧化結(jié)構(gòu)。

實(shí)時(shí)定量PCR(Real-timePCR)

SYBR?GreenPCRMasterMix：12.5μl稀釋的cDNA模板：2μlPrimer-F：1μlPrimer-R：1μl總計(jì)：25μl

2-ΔΔCT方法與相對(duì)基因表達(dá)差異的分析使用內(nèi)標(biāo)基因的目的是為了對(duì)加入到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的RNA進(jìn)行均一化處理，標(biāo)準(zhǔn)的看家基因一般都可被用作內(nèi)標(biāo)基因。適合于實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)的內(nèi)標(biāo)基因包括GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase），β-actin(細(xì)胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin)、β2-microglobulin(微球蛋白)以及rRNA；當(dāng)然，其它的看家基因也同樣能被用作內(nèi)標(biāo)。我們?cè)趹?yīng)用某一基因作為內(nèi)標(biāo)之前首先確證該基因的表達(dá)不會(huì)受實(shí)驗(yàn)處理的影響。

相對(duì)定量的方法分析基因表達(dá)差異(i)選擇一個(gè)內(nèi)標(biāo)基因；(ii)確定內(nèi)標(biāo)的有效性，確保它不會(huì)受到實(shí)驗(yàn)處理的影響；(iii)通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因RNA或cDNA的一系列梯度稀釋模板，確保它們的

擴(kuò)增效率相同。(iv)最后通過(guò)2-ΔΔCT計(jì)算將統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成線(xiàn)性形式而不是原始CT值。ΔΔCT表示目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因CT值的差異;

2-ΔΔCT方法是實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)中分析基因表達(dá)相對(duì)變化的一種簡(jiǎn)便方法。Giovanna(2002)提出“相對(duì)CT”或“δ-δCT”的方法，這個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要為每次實(shí)驗(yàn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，只需要一個(gè)優(yōu)化步驟證明外源基因與內(nèi)源基因有相同的、至少是相似的反應(yīng)效率即可。比較CT方法的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、適合多個(gè)樣品，當(dāng)然它也消除了創(chuàng)造標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)任何稀釋錯(cuò)誤的不利影響。

相比于標(biāo)準(zhǔn)子(normalizer)，比較CT法(ΔΔCT)在對(duì)模板進(jìn)行相對(duì)定量、監(jiān)測(cè)基因的表達(dá)水平時(shí)，不需標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并增加了樣品的通量；為了使這個(gè)方法成功應(yīng)用，目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率必須相等。只要靶基因和標(biāo)準(zhǔn)者具有相似的動(dòng)力學(xué)范圍，比較CT(ΔΔCT)方法就是最具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的方法。2-ΔΔCT方法中參照因子的選擇決定于基因表達(dá)定量實(shí)驗(yàn)的類(lèi)型；本實(shí)驗(yàn)中參照因子是未經(jīng)NaCl處理的對(duì)照樣品；內(nèi)標(biāo)基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)的看家基因Actin。根據(jù)實(shí)驗(yàn)獲得的經(jīng)驗(yàn)值，使用公式：

1.9-ΔΔCT進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每個(gè)基因在兩種處理情況下的表達(dá)水平均來(lái)自3次實(shí)時(shí)定量PCR的平均值。Ct-ActinCt(control)Ct-ActinCt(200mMNaCl處理)deltaCtFolddifferenceAveFoldChangeStDevThePyruvatedecarboxylase1GeneofArabidopsisIsRequiredduringAnoxia(缺氧癥）ButNotOtherEnvironmentalStressesOliverKursteiner,IsabelleDupuis,andCrisKuhlemeier*InstituteofPlantSciences,Altenbergrain21,CH–3013Berne,SwitzerlandPlantPhysiology,June2003,Vol.132,pp.968–978,?2003AmericanSocietyofPlantBiologistsFermentationhasimportantfunctionsinthepresenceofoxygen,mainlyingerminatingpollenandduringabioticstress.

Pyruvatedecarboxylase

(PDC,丙酮酸鹽(或酯)脫羧酶),whichcatalyzesthefirststepinthispathway,isthoughttobethemainregulatoryenzyme.PDCis

encodedbyfourcloselyrelatedgenes

inArabidopsis.

Usingreal-timequantitativepolymerasechainreaction,wedeterminedtheexpressionlevelsofeachindividualgene

indifferenttissues,undernormalgrowthconditions,andwhentheplantsweresubjectedto

anoxiaorotherenvironmentalstressconditions.

PDC1istheonlygeneinducedunderoxygenlimitationamongthePDC1genefamilyandthatapdc1nullmutantiscomprisedinanoxiatolerancebutnototherenvironmentalstresses.Characterizetheexpressionofthealdehydedehydrogenase(ALDH)genefamily.Noneofthethreegenesisinducedbyanoxia，butALDH2B7

reactsstronglyto

ABAapplicationand

dehydration,suggestingthatALDHmayplayaroleinaerobicdetoxificationofacetaldehyde.Discussthepossibleroleofethanolicfermentationasarobustback-upenergyproductionpathwayunderadverseconditionswhenmitochondrialfunctionisdisturbed.Estimatingthecopynumberoftransgenesintransformedricebyreal-timequantitativePCR.

YangL,DingJ,ZhangC,JiaJ,WengH,LiuW,ZhangD.

SchooloflifeScienceandBiotechnology,ShanghaiJiaoTongUniversity,800DongchuanRoad,Shanghai,200240,People'sRepublicofChina.

PlantCellRep.2005Mar;23(10-11):759-63.Epub2004Oct1.

Intransgenicplants,transgenecopynumbercangreatlyinfluencetheexpressionlevelandgeneticstabilityofthetargetgene,makingestimationoftransgenecopynumberanimportantareaofgeneticallymodified(GM)cropresearch.TransgenecopynumbersarecurrentlyestimatedbySouthernanalysis,whichislaboriousandtime-consuming,requiresrelativelylargeamountsofplantmaterialsandmayinvolvehazardousradioisotopes.

Reportherethedevelopmentofasensitive,high-throughputreal-time(RT)-PCRtechniqueforestimatingtransgenecopynumberinGMrice.UseTaqManquantitativeRT-PCRandcomparisontoanovelriceendogenousreferencegenecodingforsucrosephosphatesynthase(SPS)todeterminethecopynumbersoftheexogenousbeta-glucuronidase(GUS)andhygromycinphosphotransferase(HPT)genesintransgenicrice.Thecopynumbers

oftheGUSandHPTin

primaryricetransformants(T0)werecalculatedbycomparingquantitativePCRresultsoftheGUSandHPTgeneswiththoseoftheinternalstandard,SPS.

WithoptimizedPCRconditions,achievedsignificantlyaccurateestimatesofone,two,threeandfourtransgenecopiesintheT0transformants.CopynumberestimationsofboththeGUSreporter

geneandtheHPTselectivemarkergeneshowedthatrearrangementsoftheT-DNAoccurredmorefrequentlythanisgenerallybelievedintransgenicrice.

Anexpressionanalysisofagenefamilyencodingplasma