基因重組技術(shù)生產(chǎn)胰島素

關(guān)于基因重組技術(shù)生產(chǎn)胰島素第一頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日第七章克隆基因的表達(dá)第二頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因表達(dá)載體重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞在宿主細(xì)胞中表達(dá)出蛋白質(zhì)提取蛋白宿主細(xì)胞：原核細(xì)胞或真核細(xì)胞?？寺』虻谋磉_(dá)：第三頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日第四頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng)絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)昆蟲表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)植物生物反應(yīng)器常見表達(dá)系統(tǒng)的類型第五頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日用原核生物作宿主AdividingE.coli

第一節(jié)

外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)原核或噬菌體啟動(dòng)子MCSSD序列終止子第六頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日識(shí)別原核細(xì)胞的啟動(dòng)子，催化所有的RNA合成。很多功能上相關(guān)的基因前后相連成串，由一個(gè)共同的控制區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的控制。一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)2.以操縱子為單位1.只有一種RNA聚合酶第七頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日3.轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進(jìn)行。第八頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日4.不含內(nèi)含子，缺乏轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)5.調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上位于mRNA的起始密碼AUG的上游5～10個(gè)堿基處，同核糖體16SrRNA3’末端序列互補(bǔ)，幫助從起始AUG處開始翻譯。6.mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)上，含有SD序列Shine-Dalgarno（SD）sequence:第九頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日1.外源基因不能帶有內(nèi)含子2.一般用cDNA，不能直接用真核基因組DNA3.必須利用原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動(dòng)子和SD序列等調(diào)控元件控制外源基因的表達(dá)4.利用宿主細(xì)胞的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)，防止外源基因的表達(dá)對(duì)宿主菌的毒害為何？二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng)第十頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控大腸桿菌基因表達(dá)載體基本結(jié)構(gòu)特征第十一頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日是DNA上的能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。

大腸桿菌的所有啟動(dòng)子中都有兩段一致順序（consensussequence）。

1.啟動(dòng)子TTGACA

TATAAT

轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)17bp5’

核糖體結(jié)合位點(diǎn)-35Box和

-10Box第十二頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日2.核糖體結(jié)合位點(diǎn)（

RBS）Shine-Dalgarno（SD）

sequence翻譯起始階段，與核糖體16sRNA的3’端相互作用，正確定位起始密碼子SD

5’—AGGAGGU——AUG——

16SrRNA3’

UCCUCCASD序列距離AUG的距離影響翻譯第十三頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日3.轉(zhuǎn)錄終止子

在表達(dá)載體克隆位點(diǎn)的下游一般設(shè)計(jì)一段轉(zhuǎn)錄終止子，mRNA轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。第十四頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位包涵體（inclusionbody）

是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種不溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。1.細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)第十五頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人生長(zhǎng)激素（humangrowthhormone,hGH）。例：

使重組蛋白易于分離、免受蛋白酶降解、不損害寄主細(xì)胞回收的蛋白生物活性差。①優(yōu)點(diǎn)②缺點(diǎn)第十六頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日周質(zhì)（periplasm）

革蘭氏陰性菌位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。優(yōu)點(diǎn)：2.周質(zhì)中表達(dá)

容易被濃縮和純化、有利于正確折疊、被降解的少。第十七頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日由于需要穿過兩層膜，大腸桿菌只能分泌極少的蛋白質(zhì)到培養(yǎng)基中，效果都不太理想。用溶血素基因構(gòu)建分泌性融合蛋白

使在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。或與細(xì)菌素釋放蛋白共表達(dá)3.胞外表達(dá)第十八頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日第十九頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（1）一致順序1.啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響五、影響外源基因表達(dá)效率的因素TTGACA

TATAAT

轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)17bp5’

核糖體結(jié)合位點(diǎn)-35Box和

-10Box第二十頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日

（2）-35區(qū)與-10區(qū)之間的距離間隔為17bp時(shí)，啟動(dòng)子最強(qiáng)。（3）-35區(qū)和-10區(qū)的堿基順序越接近一致順序，啟動(dòng)子越強(qiáng)。5’-TTGACA

TATAAT

一致順序lactrpPL

recAtacItacII5’-TTTACA

TATGTT

5’-TTGACA

TTAACT

5’-TTGACA

GATACT

5’-TTGATA

TATAAT

5’-TTGACA

TATAAT

5’-TTGACA

TTTAAT

-35box-10box第二十一頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（1）SD序列2.翻譯起始序列對(duì)表達(dá)效率的影響

翻譯起始階段，與核糖體16sRNA的3’端相互作用，正確定位起始密碼子SD

5’—AGGAGGU——AUG——

16SrRNA3’

UCCUCCA①

SD序列距離AUG的距離影響翻譯第二十二頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日5’-UAAGGAGG-3’

如果是A（T），翻譯效率最高；如果是G（C），效率只有50%或25%。②

mRNA-rRNA互補(bǔ)區(qū)域長(zhǎng)短影響基因的翻譯5’-AGGAGGU-3’

？？？？5’-AAGGA-3’

>③

SD序列后面的4個(gè)堿基第二十三頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日AUG左側(cè)的三個(gè)堿基也有影響（2）起始密碼AUGAUG左側(cè)如果是UAU或CUU時(shí)，最為有效；AUG右側(cè)的三個(gè)堿基也有影響。-半乳糖苷酶的mRNA中：是UUC、UCA或AGG時(shí)下降20倍。第二十四頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日3.啟動(dòng)子與外源基因之間的距離第二十五頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日

轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的存在保證載體不會(huì)轉(zhuǎn)錄非必須基因，不必浪費(fèi)資源和能量、不會(huì)干擾正常表達(dá)。

增加載體的拷貝數(shù)會(huì)增加轉(zhuǎn)錄出的mRNA數(shù)目，增加表達(dá)效率。4.轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對(duì)表達(dá)效率的影響5.載體拷貝數(shù)及穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響6.外源蛋白在菌體中的穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響但過度的外源基因的表達(dá)會(huì)影響宿主的正常生長(zhǎng)第二十六頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日轉(zhuǎn)錄水平的優(yōu)化（1）使用強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（2）強(qiáng)終止子，或?qū)蓚€(gè)終止子串聯(lián)（3）提高mRNA的穩(wěn)定性

如：在外源基因的下游插入“重復(fù)性基因外回文序列六、提高表達(dá)水平常用的方法第二十七頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日2.翻譯水平的優(yōu)化（1）優(yōu)化翻譯起始區(qū)①起始密碼子ATG②mRNA-rRNA互補(bǔ)區(qū)域長(zhǎng)短，SD序列距離AUG的距離，及堿基種類③翻譯增強(qiáng)子第二十八頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（2）翻譯的終止①三個(gè)終止密碼子，防止核糖體跳躍②終止密碼子后的核苷酸類型，如UAAU為大腸桿菌最有效的翻譯終止序列。（3）密碼子的選擇①受體菌中共表達(dá)稀有密碼子tRNA基因②將稀有密碼子改為偏愛密碼子第二十九頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（1）表達(dá)分泌蛋白

細(xì)胞質(zhì)外膜內(nèi)膜周間質(zhì)質(zhì)粒染色體“外排”：蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過內(nèi)外膜到培養(yǎng)液中?！胺置凇保旱鞍踪|(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過內(nèi)膜到周間質(zhì)中。3.提高目的產(chǎn)物穩(wěn)定性防止被宿主的酶降解。第三十頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日①使用次黃嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，減少宿主菌的蛋白酶合成。②大腸桿菌的htpR基因突變也減少蛋白酶的降解作用。③T4噬菌體的pin基因產(chǎn)物能抑制細(xì)菌的蛋白酶。可把pin增加到載體上。（2）

使用突變菌株，保護(hù)外源蛋白不被降解

減少宿主菌本身的蛋白酶的表達(dá)。第三十一頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（1）強(qiáng)啟動(dòng)子提高轉(zhuǎn)錄效率；（2）使用高拷貝表達(dá)載體。4.質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加mRNA數(shù)量，提高核糖體與mRNA的結(jié)合速度宿主大量生長(zhǎng)后，誘導(dǎo)載體質(zhì)粒復(fù)制，增加拷貝數(shù)宿主大量生長(zhǎng)時(shí)，抑制載體質(zhì)粒的復(fù)制可調(diào)控的誘導(dǎo)型復(fù)制子第三十二頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（1）培養(yǎng)基（2）環(huán)境因素（3）誘導(dǎo)時(shí)間和劑量5.宿主菌的選擇表達(dá)載體與宿主相互匹配6.培養(yǎng)條件優(yōu)化第三十三頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日1、缺乏翻譯后蛋白質(zhì)的加工修飾系統(tǒng)，如糖基化、氨基酸修飾等。2、原核表達(dá)外源蛋白常以包涵體形式存在，必須經(jīng)過變性、復(fù)性處理才能獲得有生物活性的蛋白，并且其表達(dá)量非常低。七、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷第三十四頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日4、原核細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，無(wú)法識(shí)別內(nèi)含子，故原核細(xì)胞無(wú)法表達(dá)沒有加工過的真核基因組。5、重組原核細(xì)胞在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的毒素難以排除，污染表達(dá)產(chǎn)物，影響產(chǎn)品純度。3、原核細(xì)胞中表達(dá)的真核蛋白不穩(wěn)定，容易被細(xì)菌蛋白酶降解。七、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷第三十五頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日1.胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成2.人胰島素的生產(chǎn)方法3.重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建七、利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素第三十六頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日1.胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成SSSSCNSSB肽（30）C肽（31）A肽（21）RRRKSSSSCNSSNC高爾基體內(nèi)的特異性肽酶NC信號(hào)肽B肽C肽A肽信號(hào)肽酶第三十七頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日2.人胰島素的生產(chǎn)方法（1）直接提取法制人胰島素迄今為止，有四種大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素的方法：早期人的胰島素是從人的胰臟中直接分離純化的，由于原料供應(yīng)的限制，其產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足日益增多的糖尿病人的臨床需求。第三十八頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（2）化學(xué)合成法制人胰島素

根據(jù)人胰島素A鏈和B鏈的序列，由單個(gè)氨基酸從頭合成。這條化學(xué)全合成的路線從技術(shù)上來(lái)說(shuō)是能夠做到的，但其生產(chǎn)成本奇高，從而也限制了產(chǎn)品的廣泛應(yīng)用。2.人胰島素的生產(chǎn)方法迄今為止，有四種大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素的方法：第三十九頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（3）化學(xué)轉(zhuǎn)型法制人胰島素

豬的胰島素可從原料豐富的豬胰臟中提取獲得，而且豬胰島素與人胰島素只在B鏈的C末端有一個(gè)氨基酸的差異，豬的為Ala，人的為Thr，因此將豬胰島素在體外酶促轉(zhuǎn)化為人胰島素不失為一種選擇。2.人胰島素的生產(chǎn)方法迄今為止，有四種大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素的方法：第四十頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日2.人胰島素的生產(chǎn)方法迄今為止，有四種大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素的方法：

上述思路的技術(shù)路線是：在pH為6-7的有機(jī)相中使胰蛋白酶催化其逆反應(yīng)，該酶在過量的蘇氨酸叔丁酯的存在下，將豬胰島素B鏈C末端的丙氨酸交換下來(lái)，所形成的人胰島素叔丁酯再用三氯乙酸脫去叔丁酯基團(tuán)，最終獲得人胰島素。該過程的總轉(zhuǎn)化率為60%，但工藝路線耗時(shí)，分離純化操作復(fù)雜，產(chǎn)品的價(jià)格不菲。（3）化學(xué)轉(zhuǎn)型法制人胰島素第四十一頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日2.人胰島素的生產(chǎn)方法迄今為止，有四種大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素的方法：1982年，美國(guó)ElyLiLi公司首先使用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素，成為世界上第一個(gè)上市的基因工程藥物。1987年，Novo公司又推出了利用重組酵母菌生產(chǎn)人胰島素的新工藝。（4）基因工程法制人胰島素第四十二頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日

上述由基因工程菌合成的重組人胰島素在體外胰島素受體結(jié)合性能、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的應(yīng)答能力、降血糖作用、血漿藥代動(dòng)力學(xué)等指標(biāo)上均與天然胰島素沒有任何區(qū)別，而且還具有無(wú)免疫原性、注射吸收迅速等優(yōu)點(diǎn)，充分展示了基因工程在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的巨大潛力。2.人胰島素的生產(chǎn)方法迄今為止，有四種大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素的方法：（4）基因工程法制人胰島素第四十三頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日3.重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建（1）A鏈和B鏈分別表達(dá)法化學(xué)合成:A、B鏈的編碼序列第四十四頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日表達(dá)產(chǎn)物的后處理路線：（1）A鏈和B鏈分別表達(dá)法第四十五頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日生產(chǎn)技術(shù)的評(píng)價(jià)：

由于A鏈和B鏈上共存在六個(gè)半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正確配對(duì)率較低，通常只有10%-20%，因此采用這條工藝路線生產(chǎn)的重組人胰島素每克成本高達(dá)100美元以上。為了進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，美國(guó)ElyLiLi公司隨后又建立了第二條生產(chǎn)重組人胰島素的工藝路線。（1）A鏈和B鏈分別表達(dá)法第四十六頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（2）人胰島素原表達(dá)法3.重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建第四十七頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（2）人胰島素原表達(dá)法表達(dá)產(chǎn)物的后處理路線：第四十八頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日二硫鍵的正確配對(duì)率相應(yīng)提高，折疊率高達(dá)80%以上。雖然這條工藝路線并不比AB鏈分別表達(dá)法更為簡(jiǎn)捷，而且還要使用兩種高純度的酶制劑，但理想的折疊率在很大程度上彌補(bǔ)了工藝繁瑣的缺陷，使得每克最終產(chǎn)品的成本僅50美元。目前美國(guó)ElyLiLi公司采用此工藝年產(chǎn)十幾噸的重組人胰島素。（2）人胰島素原表達(dá)法生產(chǎn)技術(shù)的評(píng)價(jià)：第四十九頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（3）A鏈和B鏈同時(shí)表達(dá)法3.重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建第五十頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（4）分泌型重組人胰島素表達(dá)法

上述三種重組大腸桿菌的構(gòu)建路線均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌b-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所產(chǎn)生的融合型重組蛋白表達(dá)率高、穩(wěn)定性強(qiáng)，但不能分泌，只要以包涵體的形式存在于胞質(zhì)中。3.重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建第五十一頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日

一種能促進(jìn)融合蛋白分泌的工程菌構(gòu)建策略，是將胰島素或胰島素原編碼序列與b-內(nèi)酰胺酶基因拼接，b-內(nèi)酰胺酶通常能被大腸桿菌分泌到胞外。由此獲得的工程菌同時(shí)具備了穩(wěn)定高效表達(dá)可分泌型融合蛋白的優(yōu)良特性，為胰島素的后續(xù)分離純化工序減輕了負(fù)擔(dān)。（4）分泌型重組人胰島素表達(dá)法3.重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建第五十二頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日第二節(jié)

外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)酵母菌、植物原生質(zhì)體、動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞等。真核或病毒啟動(dòng)子MCSPolyA信號(hào)終止子外源基因第五十三頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日一、真核生物表達(dá)的優(yōu)越性和必要性1、真核生物具有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，可識(shí)別并刪除基因中的內(nèi)含子，剪切加工為成熟mRNA2、具備完善的翻譯后加工系統(tǒng)，可進(jìn)行糖基化、乙?；刃揎?，使蛋白形成正確的天然構(gòu)型，因而真核生物表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白更接近天然狀態(tài)，有利于其功能、生物活性的研究。第五十四頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日3、某些真核細(xì)胞可將基因表達(dá)產(chǎn)物分泌到細(xì)胞培養(yǎng)液中，簡(jiǎn)化了純化工藝，降低了生產(chǎn)成本。4、另外，真核生物表達(dá)的調(diào)控方式非常復(fù)雜，有助于我們深入了解基因調(diào)控機(jī)制。一、真核生物表達(dá)的優(yōu)越性和必要性第五十五頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（一）外源基因在酵母中表達(dá)（二）植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（三）昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（四）哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)二、真核生物表達(dá)系統(tǒng)第五十六頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（一）外源基因在酵母中表達(dá)１．酵母菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)２．酵母轉(zhuǎn)化和表達(dá)的一般過程３．在啤酒酵母中表達(dá)的重組蛋白４．廣泛用于外源基因表達(dá)的酵母宿主菌

５．利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗第五十七頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日1.酵母菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)全基因組測(cè)序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡(jiǎn)便；具有原核細(xì)菌無(wú)法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)；已經(jīng)分離出很強(qiáng)的啟動(dòng)子；能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中；生長(zhǎng)迅速、大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡(jiǎn)單、成本低廉；不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素,美國(guó)FDA認(rèn)定為安全的基因工程受體系統(tǒng)。第五十八頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2

PEG整合到染色體上或獨(dú)立在酵母細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化Ura3+營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子克隆生長(zhǎng)帶有目的基因的重組載體鑒定克隆發(fā)酵表達(dá)外源基因產(chǎn)物分離、純化2.酵母轉(zhuǎn)化和表達(dá)的一般過程第五十九頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日將目的基因克隆至載體1.基因及載體分別用限制酶切割；2.回收切割的基因和載體，然后用T4DNA連接酶連接；3.將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌受體菌；4.提取重組質(zhì)粒DNA，酶切鑒定重組質(zhì)粒，篩選出陽(yáng)性重組菌株。第六十頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日HIV-1抗原丙肝病毒蛋白診斷試劑HIV-1外殼蛋白瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白乙肝病毒表面抗原疫苗名稱種類凝血因子VIIIa1抗胰蛋白酶集落刺激因子成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子胰島素前體血小板源生長(zhǎng)因子類胰島素生長(zhǎng)因子胰島素上皮生長(zhǎng)因子人類治療用蛋白藥物3.在啤酒酵母中表達(dá)的重組蛋白第六十一頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日4.廣泛用于外源基因表達(dá)的酵母宿主菌酵母屬如釀酒酵母克魯維酵母屬如乳酸克魯維酵母畢赤酵母屬如巴斯德畢赤酵母裂殖酵母屬如非洲酒裂殖酵母漢遜酵母屬如多態(tài)漢遜酵母

其中釀酒酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究最為詳盡，但巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因最理想。第六十二頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日5.利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗（1）乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白包裹的雙鏈DNA病毒，具有感染力的病毒顆粒呈球面狀，直徑為42nm，基因組僅為3.2kb。病毒顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽。顆粒內(nèi)的蛋白成份包括核心抗原（HBcAg

）、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。第六十三頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（1）乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝臟還能合成并釋放大量的22nm的空殼亞病毒顆粒，其免疫原性是未裝配的各種包裝蛋白組份的1000倍。包裝蛋白共有三種轉(zhuǎn)膜糖蛋白：S、M、L多肽。5.利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗第六十四頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（2）乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因5.利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗第六十五頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日

乙肝病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫苗是從病毒攜帶者的肝細(xì)胞質(zhì)膜上提取出來(lái)的。雖然這種質(zhì)膜來(lái)源的疫苗具有較高的免疫原性，但由于原材料的限制難以大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。（3）傳統(tǒng)乙肝疫苗的制備5.利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗第六十六頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（4）產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母20世紀(jì)80年代開始選擇釀酒酵母表達(dá)重組HBsAg，將S多肽的編碼置于ADH1啟動(dòng)子控制下，轉(zhuǎn)化子能表達(dá)出具有免疫活性的重組蛋白，它在細(xì)胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的形式存在，平均顆粒直徑為22nm，其結(jié)構(gòu)和形態(tài)均與慢性乙肝病毒攜帶者血清中的病毒顆粒相同。5.利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗第六十七頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日

目前，由釀酒酵母生產(chǎn)的重組HBsAg顆粒已作為乙肝疫苗商品化，重組產(chǎn)物的最終產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞總蛋白量的1%~2%。進(jìn)一步的研究表明，M多肽和L多肽對(duì)S型疫苗具有顯著的增效作用，由三者（或兩者）構(gòu)成的復(fù)合型乙肝疫苗還可以誘導(dǎo)那些對(duì)S抗原缺乏響應(yīng)的人群的免疫反應(yīng)。（4）產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母5.利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗第六十八頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（5）產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母第六十九頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日重組菌經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)HBsAg，最終S蛋白的產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞可溶性蛋白總量的2~3%，在大規(guī)模的生產(chǎn)過程中，巴斯德畢赤酵母工程菌在一個(gè)240L的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，最終可獲得90克22nm的HBsAg顆粒，足夠制成900萬(wàn)份乙肝疫苗。（5）產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母5.利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗第七十頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日（二）植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)1.植物受體系統(tǒng)的特點(diǎn)（1）細(xì)胞具有全能性（2）光合作用，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低（3）表達(dá)產(chǎn)物具有免疫原性和生物活性（4）靈活性及實(shí)用性強(qiáng)（5）穩(wěn)定的外植體來(lái)源第七十一頁(yè)，共八十頁(yè)，2022年，8月28日2.在植物品種改良中的應(yīng)用（1）控制果實(shí)成熟

乙烯由S-腺苷甲硫氨酸經(jīng)氨基環(huán)丙烷羧酸合成酶和乙烯合成酶催化裂解而成。（2）抗病蟲害的轉(zhuǎn)基因植物

蘇云金芽孢桿菌的BT基因、蛋白酶抑制劑基因、凝集素基因、脂肪氧化酶基因、幾丁質(zhì)酶基因、蝎毒素