自由基生物學(xué)課件

自由基生物學(xué)

FreeRadicalBiology

前言1.什么是自由基生物學(xué)：是一門以現(xiàn)代自由基的理論、觀點和方法研究自由基在生物和人體的產(chǎn)生、反應(yīng)及其與各種生命現(xiàn)象相關(guān)的科學(xué)。自由基生物學(xué)是一門新興的前沿和交叉科學(xué)，具有重要理論意義和廣泛應(yīng)用前景并且與人類健康密切相關(guān)。2.自由基生物學(xué)的發(fā)展1900年，Gomberg對甲苯基的發(fā)現(xiàn)揭開了自由基的首篇章。1969年弗里多維奇（Fridovich）和麥科德（McCord）發(fā)現(xiàn)了超氧化物歧化酶（SOD）及其重要的生物學(xué)作用是自由基生物學(xué)發(fā)展史上的里程碑。1998年，NO自由基研究獲得諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎3.檢測自由基的新技術(shù)和方法自由基檢測是研究自由基的關(guān)鍵。物理學(xué)發(fā)展了多種檢測短壽命自由基的手段，如研制成功時間分辨的ESR技術(shù)和ESR成像儀，不僅可以檢測自由基的種類和濃度，而且可以檢測自由基在生物體內(nèi)的空間分布。利用這些方法系統(tǒng)地研究了氧自由基和一氧化氮自由基的性質(zhì)、生物功能和疾病的關(guān)系，特別是在炎癥、心腦缺血再灌注損傷和神經(jīng)退行性疾病中的作用。

4.自由基與醫(yī)學(xué)的關(guān)系從射線產(chǎn)生自由基及其具有順磁性和近年來對活性氧的研究得出結(jié)論：許多病理過程，包括輻射損傷、衰老、毒物作用及心血管疾病中的一些環(huán)節(jié)等，都和自由基有關(guān)。自由基病理學(xué)就是在這一基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。2007年8月5日《參考消息》第7版，〈科學(xué)技術(shù)〉欄，大篇幅介紹了英國劍橋大學(xué)德?格雷博士的“人活千歲不是夢”的全新科學(xué)理念老齡化并非人類身體自身條件無法避免的一個結(jié)果，而是細胞或分子長期受損造成的后果，而醫(yī)學(xué)的發(fā)展可以避免這一受損過程，甚至可以完成細胞修復(fù)。讓壽命以健康的方式延長，而不是脆弱地慢慢變老。細微老化工程策略：德格雷在2003年建立了“高壽鼠獎”，用300萬美元獎勵可以證明再生治療法在老鼠身上可行的科學(xué)家。什么是自由基呢？自由基是含奇數(shù)電子的一群原子。奇數(shù)不成對的電子急欲尋求其他電子來配對，因此會把別的物質(zhì)氧化。就像空氣中的鐵生銹、削好的蘋果變色一樣。

當化合物的共價鍵斷裂時，成對的電子由2個原子均分，稱為均裂反應(yīng)，所需能量由熱能、電磁輻射等提供，高溫氣相反應(yīng)即燃燒就是一種自由基過程；當共價鍵異裂時，一個原子接受了成對電子，如水異裂生成H+和OH-，由于都不存在不配對的電子，故不是自由基。6.1.1自由基的產(chǎn)生熱解熱解是通過加熱使共價鍵均裂產(chǎn)生自由基的方法。(CH3)3C-O-O-H(CH3)3C-O·+·OH

(一般鍵離能越高，熱解所需的能量就越大，生成的自由基也越不穩(wěn)定。)·6.1.1自由基的產(chǎn)生光解

光解是利用光化學(xué)反應(yīng)吸收光量子（在波長適當?shù)淖贤饣蚩梢姽庹丈湎拢┦构矁r鍵均裂產(chǎn)生自由基的方法。如：Cl2Cl2*2Cl·

可光解產(chǎn)生自由基的化合物有：鹵素、R-O-O-R、R-N=N-R、R-O-Cl、酸酐、丙酮等。6.1.1自由基的產(chǎn)生輻射分解

其能源是高能光子（X-ray）、高能電子流

氧化還原法是產(chǎn)生自由基的方便方法。一般有機過氧化物與過渡金屬離子發(fā)生單電子氧化還原反應(yīng)時，可產(chǎn)生自由基。通式：Mn++R1-O-O-R2M(n+1)++R1-O·+R2O-6.1.1自由基的產(chǎn)生例如：(1)Fe2++(CH3)3C-O-O-HFe3++(CH3)3C-O·+OH-(2)Fe2++H2O2Fe3++·OH+OH-酶促氧化還原反應(yīng)也可以產(chǎn)生自由基。如黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤產(chǎn)生尿酸反應(yīng)中產(chǎn)生O2·-。除上述幾種方法外，還有請氫鍵破壞等方法也可以產(chǎn)生自由基。按照自由基產(chǎn)生的方式分為內(nèi)源性自由基和外源性自由基；內(nèi)源性自由基指生物體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，主要是O2-·與·OH及其衍生物如H2O2、O2、RO·、RO2·

、ROOH；外源性自由基指以物理或化學(xué)方法產(chǎn)生的自由基，有通過熱解、光解、輻射分解使共價鍵均裂產(chǎn)生的，也包括使帶有成對電子的物質(zhì)俘獲一個電子產(chǎn)生的自由基。6.1.2自由基性質(zhì)自由基具有順磁性特性自由基一般具有活潑的化學(xué)活性與自身結(jié)構(gòu)、反應(yīng)物、反應(yīng)條件（溫度最顯著）決定自由基反應(yīng)的關(guān)鍵因素：

自由基中心單電子的定域程度；反應(yīng)過程中斷裂的共價鍵和生成共價鍵的強度。6.1.2自由基性質(zhì)1、獨特的物理特性――順磁性：自由基中的未成對電子，因自旋運動產(chǎn)生的磁距未被抵消，具有凈的電子自旋磁矩。在無外加磁場時，未成對電子的自旋磁距是隨機取向，處于同一個平均能量狀態(tài)。當自由基置于外加恒定磁場中，電子自旋磁距就會與外磁場相互作用，其磁距方向就會沿外磁場方向排列，使含有自由基的物質(zhì)表現(xiàn)出凈的磁化強度，這種現(xiàn)象稱之為順磁性，順磁性是自由基獨特的物理特性。有少數(shù)自由基化學(xué)反應(yīng)性很低，如三苯甲基自由基，這是由于其空間因素和共振效應(yīng)引起的。3、絕大多數(shù)自由基半衰期短在通常條件下很難存在，平均壽命僅有10-5s，所以不易制備，這就給自由基的分離和檢測工作帶來困難。6.1.2自由基性質(zhì)5、自由基的穩(wěn)定性是指自由基碎裂成較小碎片或通過鍵斷裂進行重排的傾向。它與結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。R-H鍵的離解能越高，自由基越不穩(wěn)定。有共振的自由基穩(wěn)定性增加。Ph-或CH2=CH-數(shù)目增加，自由基穩(wěn)定性也增加，這種穩(wěn)定性增加還包括空間障礙因素。6.1.3自由基反應(yīng)定義：有自由基參加的化學(xué)過程分類：單分子自由基反應(yīng)自由基-分子相互作用自由基-自由基相互作用鏈式反應(yīng)6.1.3自由基反應(yīng)1.單分子自由基反應(yīng)

不穩(wěn)定自由基本身發(fā)生的碎裂和重排反應(yīng)，沒有其他反應(yīng)物參加。

碎裂：自由基碎裂成一個穩(wěn)定分子和一個新的自由基。重排：在環(huán)狀體系中通常是臨近氧的C-C鍵斷裂生成羰基和一個異構(gòu)的自由基；1,2-或1,5-氫原子或氯原子轉(zhuǎn)移。6.1.3自由基反應(yīng)3.自由基-自由基相互作用①二聚或偶聯(lián)②歧化反應(yīng)影響自由基反應(yīng)的因素：①位阻效應(yīng)②溶劑效應(yīng)6.1.3自由基反應(yīng)4.鏈式反應(yīng)自由基鏈式反應(yīng)分為引發(fā)、擴展、終止三個階段。啟動和終止階段反應(yīng)前后的自由基數(shù)目發(fā)生變化，而增長階段反應(yīng)前后自由基數(shù)目不變。以甲烷的氯代反應(yīng)為例：CH4+Cl2=CH3Cl+HCl

6.1.3自由基反應(yīng)（1）引發(fā)：通過熱輻射、光照、單電子氧化還原法等手段使分子的共價鍵發(fā)生均裂產(chǎn)生自由基的過程稱為引發(fā)。ClCl

→2Cl·（2）擴展：Cl·+CH4→CH3·+HClCH3·+Cl2→Cl·+CH3Cl（3）終止：兩個自由基互相結(jié)合形成分子的過程稱為終止。Cl·+Cl·→Cl2

Cl·+CH3·→CH3ClCH3·+CH3→CH3-CH3除上述外，自由基還有這可發(fā)生裂解、重排、氧化還原、歧化等反應(yīng)。6.1.4自由基研究方法1.電子順磁共振2.脈沖射解與停流技術(shù)3.超微弱化學(xué)發(fā)光法4.O2·-、H2O2的測定6.過氧化產(chǎn)物測定6.相關(guān)酶的活力測定（CAT、SOD）6.1.4自由基研究方法電子順磁共振（EPR）EPR方法就是利用具有未配對電子的物質(zhì)在靜磁場作用下對電磁波的共振吸收特性來對物質(zhì)進行檢測與分析。EPR測量通常是固定微波頻率，通過線性掃描磁場來獲得信號。6.1.4自由基研究方法脈沖射解與停流技術(shù)

脈沖射解法，即用一個脈沖式電離輻射源照射化合物溶液，自由基可在微秒或更長時間內(nèi)產(chǎn)生，而許多自由基的吸收光譜與原化合物不同，可用吸收光譜進行檢測。

停流法，把反應(yīng)物同時壓到石英管中，混合后再進入收集管?？刂茥l件可使混合液體在石英管中停留很短時間而來不及進行明顯的反應(yīng)。進入收集管的液體被迫突然停止后，石英管中的反應(yīng)才進行直到完成，通過測量吸收光譜的變化可算出反應(yīng)速率。6.1.4自由基研究方法超微弱化學(xué)發(fā)光法超微弱化學(xué)發(fā)光法，是對脂質(zhì)過氧化過程中的自由基反應(yīng)常用研究方法。可分為自發(fā)發(fā)光和誘發(fā)發(fā)光，誘發(fā)發(fā)光可采用物理或化學(xué)誘發(fā)因子。6.1.4自由基研究方法O2·-、H2O2的測定

O2·-的測定：O2·-可使細胞色素C(CytC,λmax570nm)變成還原型CytC(λmax550nm)，測定ΔA，根據(jù)消光系數(shù)，計算CytC還原量間接表示O2·-含量。

H2O2的測定：H2O2的λmax為240nm，根據(jù)其消光系數(shù)，無干擾物存在可直接采用紫外法測定。6.1.4自由基研究方法過氧化產(chǎn)物測定(1)丙二醛(MDA)測定：MDA是不飽和脂肪酸過氧化產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)量多寡可表示過氧化程度高低。

(2)共軛雙烯測定：MDA易與細胞內(nèi)其他物質(zhì)反應(yīng)，僅測MDA含量不足以充分反應(yīng)客觀自由基損傷程度。最好還測定不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化過程中產(chǎn)生的共軛雙烯。利用紫外法可直接測定。6.1.4自由基研究方法相關(guān)酶活力測定（CAT和SOD）(1)過氧化氫酶(CAT)活力測定：分光光度法、滴定法、側(cè)壓法。分光光度法最常用，原理是CAT能催化H2O2變成H2O和O2，使H2O2在240nm處吸收值下降，測定單位時間A240nm的差值，根據(jù)H2O2的消光系數(shù)可計算CAT活力。6.1.4自由基研究方法相關(guān)酶活力測定（CAT和SOD）(2)SOD(超氧化物歧化酶)活力測定：

直接法，直接測SOD所催化反應(yīng)底物消耗速率或產(chǎn)生速率。

間接法，原理是有一個產(chǎn)生O2·-的系統(tǒng)，讓O2·-再產(chǎn)生另一個便于檢測的反應(yīng)，通過檢測SOD對這個反應(yīng)的抑制程度間接計算SOD活力。6.2活性氧概念O2的代謝產(chǎn)物及其衍生的活性物質(zhì)，統(tǒng)稱為活性氧

(reactiveoxygenspecies,ROS或OFR)。如:、·OH、H2O2、氫過氧基(HO2·-)、烷氧基(RO·)、烷過氧基(ROO·)、氫過氧化物(ROOH)等。氧及其衍生物天然存在的氧分子是自由基，含有2個不配對的電子，分別位于不同的π*反鍵軌道上，有相同的自旋量子數(shù)（自旋平行），這是氧的最穩(wěn)定的狀態(tài)，稱為基態(tài)氧（groundstate）;活潑形式的氧稱為單線態(tài)氧，是基態(tài)氧接受了能轉(zhuǎn)變成的，有2種形式，1ΔgO2狀態(tài)比基態(tài)氧的能量高93.7kJ，1Σg+O2更活潑，比基態(tài)氧的能量高156.9kJ；這兩種單線態(tài)氧都已不存在自旋限制，氧化能力大大增加。

由兩個氧原子組成的氧分子。兩側(cè)的不成對的電子呈對稱，穩(wěn)定。普遍存在的自由基。單邊只有一個電子很不穩(wěn)定。單側(cè)的電子進入到另一側(cè)的軌道上，出現(xiàn)了空的軌道，很不穩(wěn)定。經(jīng)常發(fā)生在紫外線照射下的皮下組織里。由兩個氧原子和兩個氫組成，雖然沒有不對稱的電子，很不穩(wěn)定。常用做殺菌劑。也可殺死進入到體內(nèi)的細菌。

最活躍的自由基。一個氧原子和一個氫原子形成。過氧化氫和金屬離子反應(yīng)時產(chǎn)生。非自由基活性氧的特點是可以在自由基反應(yīng)中產(chǎn)生，同時還可以直接或間接地觸發(fā)自由基反應(yīng)。一些處于激發(fā)態(tài)的含氧有機物，如激發(fā)態(tài)羰基化合物和二氧乙烷及臭氧等也都屬于具有生物學(xué)意義的活性氧。在生物體系中，電子轉(zhuǎn)移是一個基本的變化。氧分子可以通過單電子接受反應(yīng)，依次轉(zhuǎn)變?yōu)镺2·?、HO2·?、HOOH、·OH等中間產(chǎn)物。由于這些物質(zhì)都是直接或間接地由分子氧轉(zhuǎn)化而來，而且具有較分子氧活潑的化學(xué)反應(yīng)性，遂統(tǒng)稱為活性氧，亦稱氧自由基。6.2.1體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生O2·-的產(chǎn)生

(1)酶反應(yīng)產(chǎn)生：需氧生物體內(nèi)氧代謝過程可產(chǎn)生O2·-。如XOD（黃嘌呤氧化酶）次黃嘌呤+2O2+H2O→黃嘌呤+2O2·-+2H+黃嘌呤+2O2+H2O→尿酸+2O2·-+2H+NADPH氧化酶NADPH+2O2→NADP++2O2·-XODXOD6.2.1體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生O2·-的產(chǎn)生(2)非酶反應(yīng)產(chǎn)生:O2從還原劑接受一個電子轉(zhuǎn)變成O2·-。

如：①某些生物因子（還原型核黃素、半胱氨酸等）在O2存在下氧化時可產(chǎn)生O2·-；②氧合血紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)楦哞F血紅蛋白時可生成O2·-；③體內(nèi)產(chǎn)生的半醌自由基與O2反應(yīng)生成O2·-；④體內(nèi)H2O2遇到過渡金屬離子或其復(fù)合物時，均可產(chǎn)生O2·-。6.2.1體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生·OH的產(chǎn)生(1)通過過渡金屬離子（Fe3+）的催化發(fā)生Haber-Weiss反應(yīng)產(chǎn)生·OH。Mn++O2·-→M(n-1)++O2M(n-1)+H2O2→Mn++·OH+OH-___________________________________________________O2·-+H2O2→·OH+O2+OH-這是生物體內(nèi)·OH產(chǎn)生的主要來源。6.2.1體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生·OH的產(chǎn)生(2)某些酶催化系統(tǒng)可產(chǎn)生·OH：如前列腺素合成酶、鳥嘌呤環(huán)化酶催化反應(yīng)；(3)某些生理或病理生理過程可產(chǎn)生·OH：如嗜中性白細胞及巨噬細胞吞噬細菌時可產(chǎn)生·OH；(4)某些藥物在體內(nèi)代謝可能產(chǎn)生·OH：羥化藥物（5-羥基巴比妥酸等）及具有醌型抗腫瘤抗生素（博萊霉素）進入生物體內(nèi)可產(chǎn)生·OH。6.2.1體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生H2O2的產(chǎn)生生物體內(nèi)是通過酶催化反應(yīng)生成H2O2,如：2O2·-+2H+→H2O2+O2黃嘌呤+2O2+H2O→尿酸+2O2·-+2H+

線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生的O2·-是H2O2的主要來源，其H2O2產(chǎn)量約占氧耗量的1.7%XODSOD6.2.1體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生1O2的產(chǎn)生過氧化物酶催化產(chǎn)生1O2：人嗜中性細胞溶酶體內(nèi)富含髓過氧化物酶，它能催化反應(yīng)：OCl-+H2O2→1O2+Cl-+H2O2某些植物和細菌的過氧化物酶催化反應(yīng)也產(chǎn)生1O2光敏反應(yīng)產(chǎn)生1O2：眼角膜中柱細胞的視黃醛在光敏反應(yīng)中可產(chǎn)生1O2脂質(zhì)過氧化過程產(chǎn)生1O2：ROO·的分子間相互作用2ROO·→ROOR+1O2

6.2.1體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物的產(chǎn)生

生物體內(nèi)O2·-本身并不能使脂質(zhì)過氧化，只有其質(zhì)子化的產(chǎn)物HO2·具有引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用；·OH可引發(fā)脂質(zhì)過氧化；1O2可在脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生并引發(fā)脂質(zhì)過氧化，但首要前提是要有其他活性物質(zhì)（·OH）作為最初引發(fā)劑。6.2.1體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物的產(chǎn)生

RO·、RO2·和ROOH是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物。正常生理下，此產(chǎn)物含量極低且可轉(zhuǎn)化為無害物質(zhì)。病理條件下，外源性物質(zhì)（毒物、藥物等）可間接引發(fā)脂質(zhì)過氧化；內(nèi)源性活性氧增加則可使脂質(zhì)過氧化發(fā)生或加強。其產(chǎn)物對機體將產(chǎn)生損害。6.2.1體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物的產(chǎn)生

它由引發(fā)、增長、終止三個階段組成。增長階段可產(chǎn)生多種自由基，如脂質(zhì)過氧自由基(ROO·)、脂氧自由基(RO·)、脂自由基(R·)。終止階段可產(chǎn)生多種小分子產(chǎn)物如丙二醛(MDA)等。6.2.1體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物的產(chǎn)生

引發(fā)劑：光、射線或自由基鏈式反應(yīng)：脂質(zhì)分子LH脫去1個氫原子形成脂質(zhì)自由基L·，此脂質(zhì)自由基再與氧反應(yīng)生成脂質(zhì)過氧自由基LOO·。此過氧自由基再進攻其它脂質(zhì)分子，奪取其氫原子，再生成新的自由基和脂質(zhì)過氧化物LOOH，此反應(yīng)反復(fù)進行，從而導(dǎo)致脂質(zhì)分子的不斷消耗和脂質(zhì)過氧化物的大量生成。6.2.1體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物的產(chǎn)生終產(chǎn)物：最終生成小分子的醛、酮、羧酸以及烷烴和烯烴產(chǎn)物。在脂質(zhì)過氧化過程中，過渡元素金屬離子起著加速脂質(zhì)過氧化作用，2LOOH→LO·+LOO·+H2O它由引發(fā)、增長、終止三個階段組成。增長階段可產(chǎn)生多種自由基，如脂質(zhì)過氧自由基(ROO·)、脂氧自由基(RO·)、脂自由基(R·)。終止階段可產(chǎn)生多種小分子產(chǎn)物如丙二醛(MDA)等。6.2.2活性氧的毒性·OH的毒性

·OH是活性氧中最活潑的，幾乎能與細胞中的任何分子發(fā)生反應(yīng)，且反應(yīng)速率極快。（1）奪氫反應(yīng)：如·OH與膜上的卵磷脂通過奪氫反應(yīng)產(chǎn)生碳自由基而造成膜損傷。還有·OH能攻擊DNA中的脫氧核糖產(chǎn)生許多不同產(chǎn)物，其中有的具致突變作用。（2）加成反應(yīng)：如·OH能加到DNA堿基的雙鍵上。（3）電子轉(zhuǎn)移：·OH可與無機或有機物發(fā)生電子轉(zhuǎn)移。6.2.2活性氧的毒性O(shè)2·-的毒性O(shè)2·-對細胞損傷作用主要表現(xiàn)為使核酸鏈斷裂、多糖解聚、不飽和脂肪酸過氧化，進而造成膜損傷，使某些酶失活和改變線粒體氧化磷酸化作用等。

O2·-在水中主要起還原劑作用，通過歧化反應(yīng)生成H2O2。SOD&CAT有防護作用，推測O2·-不能單獨造成損傷。6.2.2活性氧的毒性O(shè)2·-的毒性

O2·-之所以有毒性主要在于它可以生成更活潑的·OH，這就是Haber-Weiss反應(yīng)。O2·-+H2O2→·OH+OH-+O2

但是機體內(nèi)O2·-和H2O2的濃度不可能使此反應(yīng)進行，McCord等為此提出一個鐵催化的H-W反應(yīng)（因體內(nèi)必然含有鐵離子）6.2.2活性氧的毒性鐵催化的H-W反應(yīng)Fe3++O2·-→Fe2++O2Fe2++H2O2→Fe3++·OH+OH-(Fenton反應(yīng))O2·-+H2O2→·OH+OH-+O2(Haber-Weiss反應(yīng))O2·-和H2O2活潑性較低，可從產(chǎn)生處擴散出去，在細胞其他部分碰到過渡金屬離子時即可生成·OH?！H極活潑，立即與周圍分子反應(yīng)而表現(xiàn)出毒性。6.2.2活性氧的毒性H2O2的毒性

H2O2是個強氧化劑，可使某些酶的-SH氧化而失活。H2O2常用作消毒劑，它能殺菌和損傷動物細胞。其毒性的原因可能是通過H-W反應(yīng)生成·OH。當H2O2與紫外線結(jié)合使用，殺菌效果更好，可能是紫外線使H2O2均裂成

·OH。6.2.2活性氧的毒性1O2的毒性

1O2分子中沒有不成對電子，不是自由基。1O2與其它分子作用有兩種方式：即化合和能量轉(zhuǎn)移。有時這兩個反應(yīng)可同時發(fā)生。1O2可與具有C=C結(jié)構(gòu)的化合物化合，這在脂質(zhì)過氧化作用中十分重要。1O2可氧化色氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、組氨酸引起蛋白質(zhì)損傷。此外還可損傷DNA。6.2.2活性氧的毒性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的毒性脂質(zhì)是過氧化是指脂質(zhì)中不飽和脂肪酸氧化講解的鏈反應(yīng)過程，它由引發(fā)、擴展、終止三個階段組成。擴展階段產(chǎn)生多種自由基，如脂過氧自由基；終止階段產(chǎn)生多種小分子產(chǎn)物，如MDA等。脂質(zhì)過氧化物均有毒性，可引起多種細胞功能的損傷，且和多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。6.2.2活性氧的毒性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的毒性

生物膜上脂質(zhì)過氧化，對膜損傷是嚴重的，如使膜流動性下降，使膜堅固性破壞等。醛類(MDA)是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，能與蛋白質(zhì)的-SH和-NH2作用，既可產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子內(nèi)交聯(lián)，使依賴-SH和-NH2維持活性的酶失活，使激素受體受傷。6.2.2活性氧的毒性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的毒性

1.脂質(zhì)過氧化可使細胞的脂質(zhì)受到破壞，從而影響細胞膜功能。

細胞和細胞器膜由脂質(zhì)（磷脂，膽固醇）和脂蛋白構(gòu)成。脂質(zhì)內(nèi)的脂肪酸分飽和和不飽和二大類，飽和脂肪酸使膜堅硬，不飽和脂肪酸使膜柔軟且富于流動性。兩者比例適當才能維持細胞膜即堅又軟的特性，維持細胞膜的完整和通透性。脂質(zhì)過氧化消耗大量不飽和脂肪酸，產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化物，使細胞膜流動性降低，使膜的脆性增加，線粒體膨脹，溶酶體膜通透性增強，釋放溶酶體酶，導(dǎo)致細胞裂解、壞死。6.2.2活性氧的毒性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的毒性

2.脂質(zhì)過氧化的中間產(chǎn)物對蛋白質(zhì)分子的作用在過氧化過程中產(chǎn)生的L·、LO·、LOO·與蛋白質(zhì)分子發(fā)生奪氫反應(yīng)，使蛋白質(zhì)分子變?yōu)樽杂苫?，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚合，使蛋白質(zhì)變性，酶失活。6.2.2活性氧的毒性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的毒性

3.脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物中醛類化合物對細胞也有毒性作用如MDA是1個雙功能基化合物，可作交聯(lián)劑，能與蛋白質(zhì)、核酸、磷脂等含氨基化合物反應(yīng)，使之發(fā)生交聯(lián)，喪失功能。醛類化合物還可與蛋白質(zhì)的巰基反應(yīng)，使其失活。

6.2.3體內(nèi)活性氧的清除

體內(nèi)產(chǎn)生的自由基如積累，將對細胞產(chǎn)生損傷，必須及時將其清除，在長期進化過程中，機體內(nèi)存在著完整的防御系統(tǒng)，它對自由基造成的損傷既有預(yù)防性質(zhì)的，也有阻斷性質(zhì)的，還有修復(fù)性質(zhì)的，其中起重要作用的是一些酶類。

自由基清除劑：凡能和自由基反應(yīng)使之成為非自由基的化合物稱為自由基清除劑。6.2.3體內(nèi)活性氧的清除（一）酶類抗氧化劑

酶既是自由基攻擊的靶分子，又是自由基的天然清除劑。O2還原為水的過程中第一個中間產(chǎn)物是O2·-。在體內(nèi)SOD能將O2·-歧化為H2O2，而CAT或GSH-Px或其它過氧化物酶可催化H2O2生成水。這是生物體內(nèi)對活性氧解毒的一條及其重要的途徑。

如果體內(nèi)產(chǎn)生的O2·-、H2O2超出了上述酶的清除能力，則會產(chǎn)生毒性最強的·OH，并對機體產(chǎn)生嚴重損傷。6.2.3體內(nèi)活性氧的清除1、超氧化物歧化酶(SuperoxidDismutase,SOD)2、過氧化氫酶（(Catalase,CAT)3、硒谷胱甘肽過氧化物酶(SeGSHPx)4、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(Non-Se-GSHPx)6.2.3體內(nèi)活性氧的清除1.超氧化物歧化酶（SOD）正常生物體具有維持活性氧的平衡生理濃度的能力，過多的O2·?依靠SOD消除；SOD由蛋白質(zhì)和金屬離子組成，廣泛存在于自然界的動植物和一些微生物體內(nèi)；催化反應(yīng)：研究表明：人體的一些病變可反映在SOD與O2·?含量變化上，對SOD減少或O2·?增加的疾病可用SOD藥物來治療。6.2.3體內(nèi)活性氧的清除２.過氧化氫酶（CAT）

H2O2是自由基鏈式反應(yīng)的中間產(chǎn)物，極易還原為化學(xué)活性很強的·OH，CAT可使H2O2分解為H2O，使H2O2不致與O2·?在鐵螯合物作用下生成非常有害的·OH；CAT是H2O2的特異清除劑，利用CAT可簡便準確地檢測出H2O2；CAT大部分局限在過氧化物酶體。6.2.3體內(nèi)活性氧的清除３硒谷胱甘肽過氧化物酶(SeGSHPx)

是清除脂質(zhì)過氧化物與H2O2的清除劑，它可使ROOH和H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)閷C體無毒副作用的產(chǎn)物，從而終止脂質(zhì)過氧化作用，防止組織中特別是不含CAT的組織（如腦）中的H2O2的損傷作用。6.2.3體內(nèi)活性氧的清除4、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(Non-Se-GSHPx)

主要和親電藥物結(jié)合，起解毒作用，和SeGSHPx協(xié)同起作用還原脂質(zhì)過氧化物，減輕脂質(zhì)過氧化對機體的損傷，但不能催化H2O2還原為H2O；GSHPx包括SeGSHPx和Non-Se-GSHPx，主要分布在胞液（75%）和線粒體基質(zhì)（25%）中，GSSG積累后由谷胱甘肽還原酶還原為GSH；不同組織中GSH－Px分布也不相同。

6.2.3體內(nèi)活性氧的清除

（二）非酶性防御系統(tǒng)（抗氧化劑）

具有還原性，可抑制啟動自由基鏈反應(yīng)，阻止自由基反應(yīng)傳播，終止自由基反應(yīng)的化合物稱為抗氧化劑。1、脂溶性（1）VitE（2）胡蘿卜素（3）CoQ(4）激素2、水溶性（1）VitC（2）谷胱甘肽（3）尿酸3、蛋白類（1）銅蘭蛋白（2）膽紅素（3）其它血漿蛋白6.2.3體內(nèi)活性氧的清除6.2.3體內(nèi)活性氧的清除新的抗氧化劑：多酚類物質(zhì)多酚是一類重要的膳食非營養(yǎng)成分，包括酚酸、類黃酮、木酚素、香豆素和單寧等。原花青素是多酚中的較大分子，也被稱作單寧，在植物的皮、種籽核及木實質(zhì)中含量較高。最早研究的目的是其抗營養(yǎng)性能，它能夠與蛋白質(zhì)、消化酶形成難溶于水的復(fù)合物，影響食物的消化吸收?；ㄉ厥侵参锎蠖鄶?shù)品種紅、藍、紫色的來源。6.2.3體內(nèi)活性氧的清除最近對于原花青素的抗氧化作用研究較多，證實具有清除體內(nèi)自由基，減輕脂質(zhì)過氧化；保護細胞膜和DNA免受氧化損傷，干擾激素結(jié)合于細胞，絡(luò)合金屬、誘導(dǎo)改變致癌性的酶；抗誘變和抗癌作用；抑制血小板聚集、消炎；抗過敏；抗衰老。

6.2.3體內(nèi)活性氧的清除

抗氧化酶及其作用機制抗氧化酶指清除活性氧的酶，它具有以下特點：A、細胞含量的高度特異性，有專門的亞細胞定位，這些定位常常以互補方式重疊。B、含有專門的金屬，特別是Cu，Mn，Zn，F(xiàn)e，Se?？寡趸阜植嫉膹V泛性說明它們在生物體系中，在防止自由基的損傷中具有重要的作用。抗氧化酶在清除自由基過程中的協(xié)同作用

抗氧化劑及其作用機制

抗氧化劑和自由基是一對矛盾體?？寡趸瘎┑姆肿咏Y(jié)構(gòu)比較特殊，它的電子是單個排列的，它可以給出電子中和自由基，而自身不會形成有危害的物質(zhì)，也不會發(fā)生鏈式反應(yīng)，通過清除自由基達到抗氧化的目的。常見的抗氧化劑有VC、VE、β-胡蘿卜素等。

6.2.3體內(nèi)活性氧的清除

6.2.3體內(nèi)活性氧的清除其他化合物的清除作用含硫化合物：如麥角硫因、半胱氨酸，可以通過給氫過程而抑制自由基引發(fā)反應(yīng)。VE和Vc：VE能抑制脂質(zhì)過氧化作用，而Vc能與前面反應(yīng)的自由基中間體反應(yīng)使VE重新生成，反應(yīng)中產(chǎn)生的Vc自由基可被NADH還原酶還原成Vc。β-胡蘿卜素與NADPH:它們均可以是CCl3O2·轉(zhuǎn)變成CCl3O2-，使R·轉(zhuǎn)變成RH，起到減輕自由基損失的作用。尿酸：是·OH的清除劑6.3自由基的生理功能生命過程中產(chǎn)生的自由基，是行使生理功能及介導(dǎo)其生化反應(yīng)所必需的。6.3自由基的生理功能體內(nèi)產(chǎn)生自由基的主要途徑白細胞和多形核白細胞在吞食外來異物和細菌過程產(chǎn)生呼吸爆發(fā)，釋放大量活性氧，其中包括超氧陰離子自由基、羥基自由基、過氧化氫、單線態(tài)氧等。它們既可以作為殺傷外來入侵者的有力武器，在炎癥和免疫方面發(fā)揮著巨大作用，但是也可以對正常細胞膜及其他細胞成分產(chǎn)生損傷作用。

6.3自由基的生理功能體內(nèi)產(chǎn)生自由基的主要途徑

線粒體的正常功能是通過氧化磷酸化在呼吸鏈上將氧氣還原成水，合成ATP，為細胞提供能量。但有1％-3％的氧氣生成自由基。這些自由基如果泄漏出來，就會造成嚴重的細胞損傷。6.3自由基的生理功能1.吞噬作用吞噬細胞碰到侵入病菌時，細胞膜凹陷，然后把整個病菌包圍并形成吞噬體再轉(zhuǎn)入細胞質(zhì)內(nèi)。質(zhì)膜的表面成了吞噬體的內(nèi)表面，膜上的NADPH氧化酶產(chǎn)生氧自由基，并進入吞噬體內(nèi)殺滅細菌。氧在吞噬細胞殺菌時必不可少，要利用它來形成各種有殺菌能力的活性氧。6.3自由基的生理功能2.在生物合成中的作用

一些物質(zhì)的生物合成過程中有氧自由基參與，如：在凝血酶原前體生成凝血酶原過程中，維生素K是不可缺少的因子。6.3自由基的生理功能膠原蛋白的生成膠原蛋白是體內(nèi)含量最多的蛋白質(zhì)，約占蛋白總量的1/4～1/3。膠原蛋白的前體為原膠原蛋白，原膠原蛋白轉(zhuǎn)化成膠原蛋白的關(guān)鍵步驟是羥化作用，羥化過程需要自由基的參與。6.3自由基的生理功能脯氨酸（Lys)羥脯氨酸(羥賴氨酸）在膠原蛋白結(jié)構(gòu)中具有羥脯氨酸、羥賴氨酸、半乳糖基羥賴氨酸和葡萄糖基半乳糖基羥賴氨酸都由羥化作用形成。這些酶促反應(yīng)都需要O2·

—，·OH，H2O2，1O2參與。6.3自由基的生理功能凝血酶原的合成

凝血酶原是由凝血酶原前體轉(zhuǎn)變而來，當凝血酶原氨基端10個Glu殘基經(jīng)羧化轉(zhuǎn)為γ-羧基谷氨酰殘基后便形成凝血酶原，在羧化過程中，O2·

-是必不可少的。6.3自由基的生理功能3.解毒作用

機體對外來毒物的解毒作用主要在肝臟中進行，其解毒作用實際上是有肝微粒體細胞色素P450催化使外來毒物羥化的過程。對象可以是抗生素、麻醉劑等各種藥物、各種致癌物。6.3自由基的生理功能4.其他方面植物對創(chuàng)傷的響應(yīng)

植物組織受傷時可促發(fā)一系列反應(yīng)形成脂質(zhì)過氧化物和它們的終產(chǎn)物，這些物質(zhì)在殺死進入傷口的病菌方面起重要作用。

6.3自由基的生理功能排除多精受精

海膽受精作用與活性氧有關(guān)。受精作用進行時誘導(dǎo)氧消耗突發(fā)并在卵表面形成一層膜，該膜含有交聯(lián)酪氨酸殘基。膜形成可以阻止更多精子進入，故而排除多精受精現(xiàn)象。6.3自由基的生理功能一氧化氮自由基在腦的發(fā)育過程起著重要作用，它是神經(jīng)傳導(dǎo)的逆信使，在學(xué)習和記憶過程中發(fā)揮著重要作用。植物中葉綠體光合作用產(chǎn)生大量自由基，甚至在一些植物抗病、感病和免疫過程中自由基也發(fā)揮著重要作用。6.4自由基與癌癥1.自由基與致癌物活化

化學(xué)致癌劑（多環(huán)芳烴、芳胺、硝基和亞硝基化合物）須經(jīng)過一個代謝或體外活化階段，從分子狀態(tài)改變成自由基后才致癌。體外經(jīng)光、電、輻射或燃燒可活化形成自由基。體內(nèi)活化主要在肝、腎的微粒體和消化道菌落中進行，它是被NADPH-細胞色素P450系統(tǒng)催化的一系列氧化還原過程。6.4自由基與癌癥2.自由基與誘癌和促癌作用

細胞發(fā)生癌變須經(jīng)歷誘發(fā)和促進兩步。

誘發(fā)階段，人成纖維細胞在熒光誘發(fā)下發(fā)生染色體斷裂和交換是由于產(chǎn)生了H2O2和·OH自由基破壞堿基，使DNA鏈斷裂或交聯(lián)，引起染色體異常，最終導(dǎo)致細胞突變。脂質(zhì)過氧化物既能致癌又能致突變。6.4自由基與癌癥2.自由基與誘癌和促癌作用促癌階段，自由基參與促癌過程的根據(jù)為：多種促癌劑本身能產(chǎn)生自由基典型的促癌劑刺激氧自由基產(chǎn)生，且它的促癌能力與其產(chǎn)生自由基能力相平促癌劑抑制抗氧化防御機制許多抗氧化劑（Ve、Vc等）能抑制促癌劑的促癌作用，也能抑制自由基產(chǎn)生6.4自由基與癌癥3.自由基與抗癌作用活性氧有殺傷正常細胞能力，癌細胞內(nèi)抗氧化酶普遍下降，活性氧對癌細胞殺傷力更大。一些抗腫瘤抗生素（道諾霉素、阿霉素）含有醌式結(jié)構(gòu)，它們可通過半醌自由基與氧生成O2·-。（醌類抗癌藥物共同機理）其它許多抗腫瘤抗生素（黑孢霉素、博萊霉素等）也都與自由基有關(guān)。6.5自由基與衰老衰老的自由基學(xué)說1956年由Harman提出的，認為隨著年齡增大的退行性變化是有自由基引起的組織隨機毒害的結(jié)果。正常情況下，機體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡。當自由基產(chǎn)生增高或自由基清除減弱，過量的自由基對巨細胞的重要生物大分子化學(xué)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞。6.5自由基與衰老自由基的損傷作用1.脂質(zhì)過氧化和生物膜的損傷

自由基對細胞膜的損傷是作用于細胞膜及亞細胞器膜上的多聚不飽和脂肪酸，使其發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，一方面自由基與膜上的酶或/和受體共價結(jié)合，改變膜成分的活性及其結(jié)構(gòu)，另一方面膜上巰基被氧化，造成膜運動過程紊亂，導(dǎo)致膜流動性下降，膜脆性增加，細胞內(nèi)外離子交換障礙。6.5自由基與衰老自由基的損傷作用2.核酸的損傷這是造成生理紊亂并加速衰老的一個重要因素。其中DNA的損傷占重要地位。最普通類型有:無堿基位點：核苷酸尤其嘌呤上會發(fā)生N-核糖鍵斷裂堿基-核苷酸變更嘧啶二聚體：雙鏈DNA單股上相鄰兩個相同嘧啶堿基能形成二聚體。6.5自由基與衰老自由基的損傷作用3.膠原蛋白的變化膠原蛋白是結(jié)締組織和細胞外間質(zhì)的主要成分，它的溶解度隨著年齡增加而降低，老年時膠原蛋白多肽鏈間共價交聯(lián)（由賴氨酸氧化酶引起）程度增加，各種氧自由基水平升高易促使交聯(lián)，進而導(dǎo)致結(jié)締組織理化性質(zhì)改變并影響其機能。6.5自由基與衰老防衰老1.抗氧化能力與衰老和壽命關(guān)系根據(jù)實驗發(fā)現(xiàn)，不同的哺乳動物血清的過氧化物生成量隨可期壽命的增大而降低；不經(jīng)溫育直接測量不同哺乳動物的血清的過氧化物含量，其量與可期壽命呈強負關(guān)系。由此說明，不同物種其抗氧化能力越強則壽命越長。6.5自由基與衰老防衰老2.防衰老

生物組織總抗氧化能力是一種可代償?shù)姆€(wěn)態(tài)，不受個別抗氧化劑的消長的影響。降低代謝能減緩衰老，延長壽命。包括人類在內(nèi)的許多動物總是雌性壽命較長。X染色體帶有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因，該酶在生成NADPH中起關(guān)鍵作用。NADPH可使自由基清除劑GSH維持在還原型。6.5自由基與衰老防衰老2.防衰老

限食是延長壽命最有效的手段之一。在保證營養(yǎng)下，從幼年起即減少2/3左右的食量，可明顯延長哺乳動物壽命，使體重和代謝下降，肝、腎細胞體積變小，單位重量細胞數(shù)增多，每個細胞耗氧量減少，故而活性氧也變少，線粒體少受到活性氧攻擊，生物膜過氧化反應(yīng)減弱。6.6自由基與其他疾病

自由基還與不少疾病有關(guān)，比如：老年性白內(nèi)障、自身免疫性疾病、缺血-重灌流損傷、精神病等有關(guān)。6.7自由基與植物逆境生理植物產(chǎn)生O2·-的方式有二：①氧化酶催化反應(yīng)中伴生O2·-。這類酶有硝基丙烷雙氧化酶、半乳糖氧化酶、過氧化物酶類等。②還原態(tài)化合物與氧氣作用生成O2·-。這類化合物有黃素、鐵氧還蛋白、二元酚、喋啶等。光合作用也產(chǎn)生還原態(tài)物質(zhì)。這是植物體內(nèi)產(chǎn)生O2·-的重要途徑。6.7自由基與植物逆境生理植物體防御自由基系統(tǒng)既有抗氧化酶系（如SOD、CAT等），又有自由基清除劑（如GSH、Vc、Ve等）。此外有些生理反應(yīng)也有利于防止自由基產(chǎn)生，如光呼吸可通過消耗NADPH，有利于還原態(tài)鐵氧還蛋白將電子傳給NADP+，而不利于生成O2·-。植物處于逆境（如強光、干旱等），體內(nèi)會產(chǎn)生過量的氧自由基，如不能及時清除則對機體產(chǎn)生損傷。6.7自由基與植物逆境生理SO2的損傷作用

SO2是空氣中的主要污染物之一。它能侵入植物產(chǎn)生多種自由基損傷機體。高濃度的SO2使植物發(fā)生缺綠病、壞死或過早脫葉。過氧化酶是對SO2最敏感的酶之一。其活性的增加是植物對SO2脅迫的保護反應(yīng)，因為它可使毒性較高的SO32-氧化成毒性較低的SO42-。6.7自由基與植物逆境生理光氧化作用一個分子吸收光能后躍遷成短壽命的單線激發(fā)態(tài)，壽命為10-9-10-6s，在這極短時間內(nèi)或釋放激發(fā)能弛豫成基態(tài)S0，或經(jīng)能量系統(tǒng)間轉(zhuǎn)換變成壽命較長的三線態(tài)3S(10-3-101s).6.7自由基與植物逆境生理光氧化作用

3S壽命較長，來得及在弛豫前與分子作用，可使附近的分子A變成半還原態(tài)A+·，A+·極易被氧化：

3S+A→S-·+A+·A+·+O2→AO2S-·+O2→S0+O2·-

A+·+O2·-

→AO23S+O2→S-·+O2·-S-·+A→S0+A+·

光敏反應(yīng)中也產(chǎn)生1O2，它同樣能氧化基質(zhì)：3S+O2→S0+1O21O2+A→AO26.7自由基與植物逆境生理光氧化作用

概括的說，生物系統(tǒng)或細胞在染料和氧氣的參與下，受特定波長光照射后產(chǎn)生損傷或死亡，此反應(yīng)稱為光敏反應(yīng)。必要條件：氧、敏化劑和能被敏化劑是吸收的光天然敏色素有葉綠素、海棠素、卟啉、香豆素。植物生理學(xué)中的光氧化作用就是光敏作用，指的是植物綠色組織在強光下，形成過量的O2·-和1O2，超出了葉綠體防御系統(tǒng)的負荷，誘發(fā)了脂質(zhì)過氧化，對膜系統(tǒng)造成傷害。6.7自由基與植物逆境生理干旱

耐旱植物在干旱時能提高SOD和CAT活性，抑制脂質(zhì)過氧化，防止膜損傷；而干旱敏感植物不能控制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使得膜損傷并導(dǎo)致細胞死亡?？梢娭参锏哪秃的芰εc抗氧化性酶的活性及對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的控制能力密切相關(guān)。6.7自由基與植物逆境生理綜上，當植物處于逆境條件下，體內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除的平衡遭到破壞，過量的自由基可使膜脂質(zhì)過氧化而損傷膜功能，表現(xiàn)為膜通透性增大，離子泄漏；同時也可使葉綠素、蛋白質(zhì)等氧化；嚴重時可造成植株死亡。在輕微逆境條件下生長的植物有一定的適應(yīng)作用，表現(xiàn)為一些防御性酶活性增高，自由基清除劑含量增多。因此，常用自由基防御性酶活性高低做為對逆境耐受力的指標或抗性鍛煉的指標。6.8一氧化氮自由基NO·的性質(zhì)在NO分子軌道上含有一個未配對電子，所以它是自由基，故特采用NO·表示。

物性：氣體，難溶于水（1mmol/L），具脂溶性

化性：活潑，與Fe2+有很高親和力，能與Cu、Mg發(fā)生反應(yīng)。與O2極易生成NO2(也是自由基)。NO·可與O2·-生成過氧亞硝基陰離子（ONOO·）質(zhì)子化后很快分解成·OH和NO2。還可相互作用生成一系列有重要生物功能的自由基和硝基化合物。6.8一氧化氮自由基體內(nèi)NO·的生成及代謝

（1）在體內(nèi)NO·主要通過NO·合成酶（NOS）催化才能生成。NOS是以L-精氨酸（L-Arg）和O2為底物，NADPH做為輔助因子提供電子，由FMN、FAD或四氫喋呤傳遞電子，催化L-精氨酸末端胍基中的一個氮原子和氧分子反應(yīng)，生成中間體對羥基L-Arg，最終形成NO·和L-胍氨酸(L-Cit)。6.8一氧化氮自由基體內(nèi)NO·的生成及代謝

（2）黃嘌呤氧化酶黃嘌呤氧化酶具有硝酸還原酶的活性，可以將硝酸還原成NO·。6.8一氧化氮自由基體內(nèi)NO·的生成及代謝

（3）硝基血管舒張劑，如硝普鈉，硝基甘油都可以產(chǎn)生NO·。6.8一氧化氮自由基體內(nèi)NO·的生成及代謝

結(jié)構(gòu)型NOS:單體酶，催化活性需要鈣調(diào)素/鈣離子(CaM/Ca2+)、NADPH、FAD/FMN。還是一種高度可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，能被cAMP和Ca2+依賴性蛋白激酶（蛋白激酶A和C）磷酸化，結(jié)果使不同的信息傳遞過程緊密聯(lián)系起來。主要分布在神經(jīng)系統(tǒng)等處，在受到物理刺激或受體被激活后此酶迅速被激活，合成并釋放NO·去發(fā)揮信使分子作用。6.8一氧化氮自由基體內(nèi)NO·的生成及代謝

誘導(dǎo)型NOS:在巨噬細胞等被激活后，在其細胞核內(nèi)表達合成的。它主要受細胞因子的作用，如在腫瘤壞死因子作用下，要經(jīng)過幾個小時后才出現(xiàn)酶活性增強，反應(yīng)緩慢。它的活性不依賴CaM/Ca2+，而需要四氫喋呤等輔助因子。它一旦產(chǎn)生就會長期合成NO·。6.8一氧化氮自由基NO·的測定方法NO·的半壽期很短，難以直接檢測。一般可通過測定NO·的生理功能、cGMP含量、NOS活性和硝酸鹽、亞硝酸鹽含量等來反映組織細胞NO·的含量。目前常用的方法是測定NO·的終末代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽含量及測定NOS活性來反映組織細胞NO·的含量。6.8一氧化氮自由基NO·的測定方法1.化學(xué)發(fā)光法

原理是生物樣品通過酸化或加入還原劑可使樣品中的亞硝酸鹽釋放NO·，NO·與O3反應(yīng)生成NO2的同時釋放光子，測定光子的量，代表組織細胞NO·的含量。此法敏感，但是測得的NO·量并不完全代表組織細胞實際的NO·含量。6.8一氧化氮自由基NO·的測定方法2.微盤測定法

原理是NO·氧化生成硝酸鹽和亞硝酸鹽，硝酸鹽通過鎘柱還原為亞硝酸鹽，后者與Greiss試劑在微盤中反應(yīng)生成粉紅色化合物，應(yīng)用酶標儀在550nm波長下測其吸光度，亞硝酸鈉做為標準。6.8一氧化氮自由基NO·的測定方法3.放射強度測定法

原理是等摩爾量Arg在NOS催化下生成NO·的同時會產(chǎn)生等摩爾量的Cit。應(yīng)用液體閃爍劑計數(shù)儀測定同位素標記的Arg生成同位素標記的Cit的量來代表NOS的活性。6.8一氧化氮自由基NO·的測定方法4.分光光度法

原理是NOS催化生成的NO·可與氧合血紅蛋白反應(yīng)生成高鐵血紅蛋白并且吸光度發(fā)生變化。應(yīng)用雙波長分光光度計在401和421nm波長下測定吸光度差異的變化代表NOS的含量。此法的干擾因素較多。6.8一氧化氮自由基NO·的生理功能NO·在脊椎動物體內(nèi)廣泛分布，它是一種新型的細胞信使分子，在調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫功能方面起著重要作用。NO·作為信使分子的最大特點是，它不需要任何中介機制而快速擴散通過生物膜，將一個細胞產(chǎn)生的信息傳遞到它周圍的細胞中去。6.8一氧化氮自由基NO·的生理功能1.在心血管系統(tǒng)中心的調(diào)節(jié)作用NO·就是EDRF(內(nèi)皮舒張因子)。在心血管系統(tǒng)中，NO·釋放作為血管內(nèi)皮對環(huán)境變化的一般適應(yīng)機制，通過對血管平滑肌的作用調(diào)節(jié)血流和血壓。給人和動物施用NOS抑制劑后，血壓迅速升高，高血壓及其它血壓不正?？赡芘c此機制有關(guān)。血小板中的NO·可能是一種內(nèi)源性抗血栓劑，可通過cGMP抑制血小板的凝聚和粘附，形成一種自體分泌負反饋系統(tǒng)。6.8一氧化氮自由基NO·的生理功能NO·在大腦血循環(huán)調(diào)節(jié)中似乎也起關(guān)鍵作用。實驗表明，GC(鳥苷酸環(huán)化酶)存在于腦部微血管中，能受SNP作用調(diào)節(jié)血腦屏障通透性。腦的能量代謝乃至認知活動與腦部血液循環(huán)密切相關(guān)，NO·對腦血流循環(huán)的調(diào)節(jié)意義更為重大。6.8一氧化氮自由基NO·的生理功能2.免疫系統(tǒng)中的功能當內(nèi)毒或T細胞激活巨噬細胞時，會和成誘導(dǎo)NOS。NOS催化生成大量NO·，同時巨噬細胞也大量釋放O2·-。O2·

-可通過H-W反應(yīng)產(chǎn)生·OH，·OH可殺傷入侵微生物和腫瘤細胞及在炎癥損傷方面起重要作用。同時O2·-和NO·反應(yīng)生成ONOO·，ONOO·堿性條件下十分穩(wěn)定，酸化則立即分解成更強氧化劑·OH和NO2·。這兩種自由基具有很大的細胞毒性，對于殺傷外來微生物和腫瘤細胞很有意義。6.8一氧化氮自由基NO·的生理功能3.在神經(jīng)系統(tǒng)信息傳遞和發(fā)育中的作用(1)NO·可能在哺乳動物類消化、生殖、呼吸和循環(huán)四個系統(tǒng)的自主神經(jīng)調(diào)節(jié)中起重要作用，可能是其中一些神經(jīng)元的新遞質(zhì)。NO·在感覺傳入和神經(jīng)內(nèi)分泌中也起重要作用。(2)NO·可能在成體中興奮性氨基酸引起的短期突觸可塑性效應(yīng)和神經(jīng)發(fā)育、學(xué)習、記憶等長期效應(yīng)中都有重要作用。6.8一氧化氮自由基NO·的毒性作用

谷氨酸能使神經(jīng)元參與腦缺血時的神經(jīng)毒性作用。許多實驗表明，NO·介導(dǎo)谷氨酸的神經(jīng)細胞毒性作用。在正常情況下，神經(jīng)元合成并釋放出適量的NO·并不產(chǎn)生毒性作用。但有過量谷氨酸時，神經(jīng)元和小膠質(zhì)細胞就產(chǎn)生過多的NO·，足以致死周圍的神經(jīng)細胞。6.8一氧化氮自由基NO·的毒性作用

免疫刺激產(chǎn)生的NO·對那些表達NOS的細胞自身及其附近細胞也有毒性作用，一些與免疫系統(tǒng)有關(guān)的局部或系統(tǒng)組織損傷，病態(tài)血管擴張等可能與NO·釋放有關(guān)。6.9

自由基與人體健康1、自由基摧毀細胞膜，導(dǎo)致細胞膜發(fā)生變性，使得細胞不能從外部吸收營養(yǎng)，也排泄不出細胞體內(nèi)的代謝廢物,并喪失了對細菌和病毒的抵御能力，從而使人體免疫力低下、疲勞和器官病變。如果導(dǎo)致細胞死亡或細胞內(nèi)雜質(zhì)無法代謝就會形成色素沉積，產(chǎn)生黃褐斑、蝴蝶斑、老年斑等。2、自由基攻擊正在復(fù)制中的基因，造成基因突變，誘發(fā)癌癥發(fā)生。

3、自由基激活人體免疫系統(tǒng)，使人體表現(xiàn)出過敏反應(yīng)，如過敏性鼻炎，過敏性哮喘、過敏性皮炎、花粉過敏、食物過敏等，紅斑狼瘡等的自體免疫疾病4、自由基作用于人體內(nèi)分泌系統(tǒng)，導(dǎo)致膠原蛋白酶和硬彈性蛋白酶的釋放，這些酶作用于皮膚中的膠原蛋白酶和硬彈性蛋白并使這兩種蛋白產(chǎn)生過度交聯(lián)并降解，結(jié)果使皮膚失去彈性，出現(xiàn)皺紋及囊泡。6.9

自由基與人體健康

5、與4相類似的作用使體內(nèi)毛細血管脆性增加，使血管容易破裂，這可導(dǎo)致靜脈曲張、水腫等與血管通透性升高有關(guān)的疾病的發(fā)生。

6、自由基侵蝕腦細胞使人易患老年性癡呆癥。

7、自由基侵蝕機體組織，可激發(fā)人體釋放各種炎癥因子，導(dǎo)致出各種非菌性炎癥。

6.9

自由基與人體健康8、自由基氧化血液中的脂蛋白造成膽固醇向血管壁的沉積，引起心臟病和中風，動脈粥樣硬化，腦血栓，腦溢血，偏癱，高血壓等心腦血管病癥。9、自由基引起關(guān)節(jié)膜及關(guān)節(jié)滑液的降解，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎。

10、自由基侵蝕胰臟細胞引起糖尿病。

11、自由基損傷肝臟器官導(dǎo)致肝炎。6.9

自由基與人體健康早衰癥是人體衰老中的一種病癥6.9.1細胞凋亡與自由基

死亡是生命的普遍現(xiàn)象，但細胞死亡并非與機體死亡同步。正常的組織中，經(jīng)常發(fā)生“正?！钡募毎劳觯蔷S持組織機能和形態(tài)所必需的。（一）細胞