電針不同頻率對阿爾茨海默病大鼠海馬突觸傳遞功能影響研究課件

電針不同頻率對阿爾茨海默病大鼠海馬突觸傳遞功能影響研究

電針不同頻率對阿爾茨海默病大鼠海馬突觸傳遞功能影響研究

課題來源

電針不同頻率調控糖原合酶激酶3

β對阿爾茨海默病大鼠神經突觸可塑性影響及機制研究

（國家自然科學基金面上項目）課題來源報告內容

4123研究內容技術路線可行性分析目的意義立項依據(jù)研究方法預期結果研究進度報告內容4123研究內容技術路線可行性分析目的意義目的意義

阿爾茨海默病((Alzheimer.sdisease,AD)又稱老年癡呆是一種以進行性認知障礙和記憶力損害為主的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，以老年斑(SP)，神經元纖維纏結(NFT)和神經元丟失為主要病理改變。

目前全世界有2600萬人患AD，65歲以上的人AD的發(fā)病率為8.4%，我國老年癡呆患者約占世界的四分之一，達600萬-700萬人，發(fā)病率正以每年1.4%的速度上升,為威脅我國老年健康的主要疾病之一

臨床研究表明,針灸治療AD安全、有效,在治療效果和總有效率方面較藥物具有優(yōu)勢。本實驗以益腎調督為治則，選取百會和腎腧穴，借助神經電生理學檢測來觀察不同頻率電針對神經突觸可塑性的影響，從而研究針灸延緩衰老、防治AD的作用機制，為臨床治療AD提供新的實驗依據(jù)。目的意義阿爾茨海默病((Alzheimer.s立題依據(jù)AD病因及防治是一個非常復雜的問題,現(xiàn)代醫(yī)學對它的研究已深入到基因、分子水平，但仍不能揭示其確切的病因和發(fā)病機制。學習記憶障礙是AD的主要臨床表現(xiàn),而神經突觸可塑性被認為是學習與記憶的重要細胞學基礎。

突觸是兩個神經元間高度局限性、特異性的連接位點.在此點神經遞質由一個突觸前神經元軸突終末釋放，激活突觸后神經元上受體完成信息傳遞，突觸是神經傳輸、加工的樞紐，是受體、通道、蛋白的密集之地其變化是學習記憶形成的一個重要的形態(tài)學和功能學基礎突觸的喪失會中斷許多功能通路的聯(lián)系，引起多方面的功能障礙，尤其是嚴重的認知和記憶功能障礙從而導致癡呆立題依據(jù)AD病因及防治是一個非常復雜的問題,立題依據(jù)

突觸可塑性包括結構和功能兩方面,突觸形態(tài)結構的可塑性表現(xiàn)為突觸活性區(qū)數(shù)量與面積的改變、突觸間隙的變化以及各種亞細胞結構的改變等;突觸功能的可塑性主要表現(xiàn)為突觸傳遞功能的增強或減弱，而對機體活動造成直接影響的是突觸(信息傳遞)功能的可塑性。

長時程增強

(long-termpotentiation,LTP)和長時程抑制(long-termdepression,LTD)是表示突觸傳遞功能的兩個重要電生理指標,也是可塑性的重要表現(xiàn)形式，LTP作為突觸可塑性的實驗模型已經被神經科學家們廣泛地用于學習和記憶的研究中，現(xiàn)一般認為,LTP和LTD均為某些學習記憶活動的細胞水平的神經生物學基礎,LTP與記憶的形成和儲存有關,而LTD與記憶的整合、遺忘和恢復突觸產生LTP的能力(去飽和)等有關,兩者共同組成一個能學習的神經網絡突觸可塑性（LTP、LTD）學習記憶AD立題依據(jù)突觸可塑性包括結構和功能兩方面,突觸形立題依據(jù)AD病，在中醫(yī)學中，屬于神志病，病變在腦，腎為先天之本，藏精，主骨生髓，上通于腦,腦為元神之府，腦和神明有賴于髓之榮養(yǎng),腎精充足則腦髓充足，腦髓充足則神自旺,老年癡呆皆因至腎虧之年，腎氣已衰，精髓乏源，腦失所養(yǎng)，再加其他因素誘發(fā)而成。

百會位居頭之巔頂，又名三陽五會，是督脈與足太陽、手太陽、足少陽、足厥陰等經脈交會處，具有安神、補腦益智之功，是治療腦病的首選穴位。

針刺“百會”不但可以激發(fā)局部頭部經氣治療腦病，還可以激發(fā)諸經經氣治療十四經病，使機體陰陽平衡，氣血調和

腎腧穴位于背部屬于足太陽膀胱經，足太陽膀胱經與足少陰腎經為表里經，加上腎腧穴是腎的背腧穴，因此刺激腎腧穴可以起到調節(jié)腎經，滋補腎精的作用

由此可見，百會及腎俞二穴同用，可起到益腎調督，延緩腦生理老化，從而達到防治AD的目的。立題依據(jù)AD病，在中醫(yī)學中，屬于神志病研究內容觀察各組大鼠行為學的改變觀察AD模型大鼠海馬神經突觸傳遞功能電生理LTP和LTD的改變與學習記憶的關系電針不同頻率對AD模型大鼠神經元突觸可塑性的影響及與學習記憶的關系研究內容觀察各組大鼠行為學的改變觀察AD模型大鼠海馬神經突觸研究方法

4123實驗動物及分組主要實驗器材和藥品動物模型制備方法動物取材5誘發(fā)電位的記錄研究方法4123實驗動物及分組主要實驗器材和藥品動物模選用SPF級健康wistar雄性大鼠,3-4月齡,由湖北省實驗動物研究中心提供（許可證號：SCXK（鄂）

2008-0005）。大鼠適應性喂養(yǎng)，正常飲食，飲水，7天后進行Morris水迷宮測試，剔除不合格者（即反應過于遲鈍或靈敏者），保留合格大鼠50只，隨機分為正常組、模型組、假手術組、2Hz電針治療組、50Hz電針治療組，共5組，每組10只實驗動物及分組選用SPF級健康wistar雄性大鼠,3-4月齡,由湖北省實

（1）正常組：與其他治療組用同樣的方法進行抓取，但不予任何處理。

（2）模型組：即腦室內注射Aβ1-42建立AD大鼠模型(具體方法見下文)。造模成功后，不進行任何治療。與其他治療組用同樣的方法進行抓取。

（3）假手術組：制作方法同模型組，僅注射相同量的生理鹽水。與其他治療組用同樣的方法進行抓取。

（4）2Hz電針治療組：即在成功造模后立即開始施于電針刺激。針刺大鼠“百會”（頂骨正中）、“腎俞”（第二腰椎下兩旁）穴(穴位定位參照中國針灸學會實驗針灸分會制定的《動物針灸穴位圖譜》)，百會向前平刺3-5mm，腎俞穴稍向內斜刺5mm，接上海產G6805Ⅱ型電針治療儀，百會接負極，腎俞接正極，左右側腎俞每日交替使用。選用連續(xù)被，頻率2Hz，電壓2-4V，電流1-2mA，留針20min，每日1次，7日為1療程，療程間休息1日，共治療2個療程。

（5）50Hz電針治療組：電針選用連續(xù)波，頻率50Hz，電壓、電流、操作方法同2Hz電針治療

組。（1）正常組：與其他治療組用同樣的方法進行抓取，但不予任何主要實驗器材大鼠腦立體定位儀電針治療儀主要實驗器材大鼠腦立體定位儀電針治療儀主要實驗器材膜片鉗系統(tǒng)Morris水迷宮測試系統(tǒng)主要實驗器材膜片鉗系統(tǒng)Morris水迷宮測試系統(tǒng)主要實驗試劑試劑廠家Aβ1-42注射液Sigma青霉素國藥集團生理鹽水國藥集團4%多聚甲醛國藥集團10%水合氯醛國藥集團主要實驗試劑試劑廠家Aβ1-42注射液Sigma青霉素國藥集

實驗前將Aβ1-42用磷酸鹽緩沖液（PBS）配制成１ug/μl的溶液３７℃孵育7d，使其變成聚合狀態(tài)從而具有神經毒性；實驗用大鼠置于安靜清潔環(huán)境中，分籠喂養(yǎng)，溫度控制在（２４±２）℃，定時給予充足清潔飲水和定量大鼠專用飼料。適應性喂養(yǎng)１周后，無不良反應，飲食、飲水正常者，開始進行Morris水迷宮測試篩選，剔除不符合評定標準的大鼠動物模型制備方法實驗前將Aβ1-42用磷酸鹽緩沖液（PBS）評定后的合格大鼠進行稱重，用10%的水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀上保持前后囟在同一水平。無菌環(huán)境下，顱頂區(qū)備皮，剝開皮下筋膜暴露頂骨，進行手術區(qū)皮膚消毒，于兩側冠狀縫后鉆出小孔，取出碎骨屑，保持硬腦膜的完整。按照“大鼠腦立體定位圖譜”選擇大鼠海馬區(qū)域用微量注射器緩慢將藥物Aβ1-42（10μl）注入海馬（前囟后3.3mm，中線左右各旁開1.5mm，深度3mm），5min內注完，注射后留針5min，按1.0mm/min的速度緩慢出針，以免拔針時藥物溢出。術后牙托粉封固顱骨孔，縫合皮膚，３日內每日肌內注射青霉素Ｇ10萬Ｕ防止感染，并經Morris水迷宮進行模型評價，剔除不合格者。動物模型制備方法評定后的合格大鼠進行稱重，用10%的水合氯醛（300mg/k

動物取材

1、大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉(0.4ml/100g)下斷頭

在以

95%O2+5%CO2

混合氣飽和的

4℃人工腦脊液(artificialcerebrospinalfluid,ACSF)持續(xù)沖洗下,迅速取腦并置于預先用

ACSF濕潤的濾紙上,沿正中線切開兩大腦半球。2、

由腦腹內側沿皮層邊緣仔細分離出海馬,在通有混合氣的4℃ACSF中,用切片刀垂直于海馬長軸將其切成厚約400um的腦薄片,所有腦片置于

30～32℃ACSF中,并不斷通入

95%O2+5%CO2混合氣,孵育

1～2h待用。3、ACSF的成分為(mmol/L):NaCl124,KCl5.0,NaH2PO41.25,MgSO42.0,CaCl22.5,NaHCO322.0和葡萄糖

10.0。動物取材誘發(fā)電位記錄

1、LTP(或

LTD)中突觸可塑性改變程度用

HFS(或LFS)后

PS幅值與條件刺激

PS幅值均值之比表示。

2、取一個腦片置于記錄小室內,將雙極鎢絲電極置于

Schaffer側支通路,以內充

ACSF的兩根玻璃微電極(阻抗

5～15MΩ)分別置于

CA1區(qū)的輻射層和錐體細胞層,細胞外記錄群體峰電位（PS）,PS的幅值用第一個下降相最低點到兩個上升波峰連線中點距離來度量。

RecordingelectrodeRecordingelectrode誘發(fā)電位記錄1、LTP(技術路線技術路線預期結果1234電針對AD模型大鼠海馬神經元突觸傳遞功能存在影響圓滿完成實驗大鼠海馬部位注射Aβ1-42成功復制出AD模型電針不同頻率對AD模型大鼠海馬神經元突觸傳遞功能的影響不同5預期結果1234電針對AD模型大鼠海馬神經元突觸傳遞功能存在可行性分析

1.本課題立題依據(jù)可靠，目的明確。2.所選穴位合理。3.本課題所選擇AD模型是研究阿爾茨海默病的常用模型。4.整個實驗過程和操作熟練掌握，實驗在針灸重點科學實驗室進行，擁有先進膜片鉗系統(tǒng)，并有長期從事相關研究的專家教授親自指導。5.實驗指標LTP、LTD等已有相關研究可行性分析

研究進度安排時間內容2013年10月——2014年2月采購實驗大鼠，所需試劑，準備實驗所需器材。2014年3月——2014年5月模型制備，取材等2014年6月——2014年9月實驗結果及數(shù)據(jù)分析，準備開題報告及論文。研究進度安排時間內容20ThankYou!ThankYou!

電針不同頻率對阿爾茨海默病大鼠海馬突觸傳遞功能影響研究

電針不同頻率對阿爾茨海默病大鼠海馬突觸傳遞功能影響研究

課題來源

電針不同頻率調控糖原合酶激酶3

β對阿爾茨海默病大鼠神經突觸可塑性影響及機制研究

（國家自然科學基金面上項目）課題來源報告內容

4123研究內容技術路線可行性分析目的意義立項依據(jù)研究方法預期結果研究進度報告內容4123研究內容技術路線可行性分析目的意義目的意義

阿爾茨海默病((Alzheimer.sdisease,AD)又稱老年癡呆是一種以進行性認知障礙和記憶力損害為主的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，以老年斑(SP)，神經元纖維纏結(NFT)和神經元丟失為主要病理改變。

目前全世界有2600萬人患AD，65歲以上的人AD的發(fā)病率為8.4%，我國老年癡呆患者約占世界的四分之一，達600萬-700萬人，發(fā)病率正以每年1.4%的速度上升,為威脅我國老年健康的主要疾病之一

臨床研究表明,針灸治療AD安全、有效,在治療效果和總有效率方面較藥物具有優(yōu)勢。本實驗以益腎調督為治則，選取百會和腎腧穴，借助神經電生理學檢測來觀察不同頻率電針對神經突觸可塑性的影響，從而研究針灸延緩衰老、防治AD的作用機制，為臨床治療AD提供新的實驗依據(jù)。目的意義阿爾茨海默病((Alzheimer.s立題依據(jù)AD病因及防治是一個非常復雜的問題,現(xiàn)代醫(yī)學對它的研究已深入到基因、分子水平，但仍不能揭示其確切的病因和發(fā)病機制。學習記憶障礙是AD的主要臨床表現(xiàn),而神經突觸可塑性被認為是學習與記憶的重要細胞學基礎。

突觸是兩個神經元間高度局限性、特異性的連接位點.在此點神經遞質由一個突觸前神經元軸突終末釋放，激活突觸后神經元上受體完成信息傳遞，突觸是神經傳輸、加工的樞紐，是受體、通道、蛋白的密集之地其變化是學習記憶形成的一個重要的形態(tài)學和功能學基礎突觸的喪失會中斷許多功能通路的聯(lián)系，引起多方面的功能障礙，尤其是嚴重的認知和記憶功能障礙從而導致癡呆立題依據(jù)AD病因及防治是一個非常復雜的問題,立題依據(jù)

突觸可塑性包括結構和功能兩方面,突觸形態(tài)結構的可塑性表現(xiàn)為突觸活性區(qū)數(shù)量與面積的改變、突觸間隙的變化以及各種亞細胞結構的改變等;突觸功能的可塑性主要表現(xiàn)為突觸傳遞功能的增強或減弱，而對機體活動造成直接影響的是突觸(信息傳遞)功能的可塑性。

長時程增強

(long-termpotentiation,LTP)和長時程抑制(long-termdepression,LTD)是表示突觸傳遞功能的兩個重要電生理指標,也是可塑性的重要表現(xiàn)形式，LTP作為突觸可塑性的實驗模型已經被神經科學家們廣泛地用于學習和記憶的研究中，現(xiàn)一般認為,LTP和LTD均為某些學習記憶活動的細胞水平的神經生物學基礎,LTP與記憶的形成和儲存有關,而LTD與記憶的整合、遺忘和恢復突觸產生LTP的能力(去飽和)等有關,兩者共同組成一個能學習的神經網絡突觸可塑性（LTP、LTD）學習記憶AD立題依據(jù)突觸可塑性包括結構和功能兩方面,突觸形立題依據(jù)AD病，在中醫(yī)學中，屬于神志病，病變在腦，腎為先天之本，藏精，主骨生髓，上通于腦,腦為元神之府，腦和神明有賴于髓之榮養(yǎng),腎精充足則腦髓充足，腦髓充足則神自旺,老年癡呆皆因至腎虧之年，腎氣已衰，精髓乏源，腦失所養(yǎng)，再加其他因素誘發(fā)而成。

百會位居頭之巔頂，又名三陽五會，是督脈與足太陽、手太陽、足少陽、足厥陰等經脈交會處，具有安神、補腦益智之功，是治療腦病的首選穴位。

針刺“百會”不但可以激發(fā)局部頭部經氣治療腦病，還可以激發(fā)諸經經氣治療十四經病，使機體陰陽平衡，氣血調和

腎腧穴位于背部屬于足太陽膀胱經，足太陽膀胱經與足少陰腎經為表里經，加上腎腧穴是腎的背腧穴，因此刺激腎腧穴可以起到調節(jié)腎經，滋補腎精的作用

由此可見，百會及腎俞二穴同用，可起到益腎調督，延緩腦生理老化，從而達到防治AD的目的。立題依據(jù)AD病，在中醫(yī)學中，屬于神志病研究內容觀察各組大鼠行為學的改變觀察AD模型大鼠海馬神經突觸傳遞功能電生理LTP和LTD的改變與學習記憶的關系電針不同頻率對AD模型大鼠神經元突觸可塑性的影響及與學習記憶的關系研究內容觀察各組大鼠行為學的改變觀察AD模型大鼠海馬神經突觸研究方法

4123實驗動物及分組主要實驗器材和藥品動物模型制備方法動物取材5誘發(fā)電位的記錄研究方法4123實驗動物及分組主要實驗器材和藥品動物模選用SPF級健康wistar雄性大鼠,3-4月齡,由湖北省實驗動物研究中心提供（許可證號：SCXK（鄂）

2008-0005）。大鼠適應性喂養(yǎng)，正常飲食，飲水，7天后進行Morris水迷宮測試，剔除不合格者（即反應過于遲鈍或靈敏者），保留合格大鼠50只，隨機分為正常組、模型組、假手術組、2Hz電針治療組、50Hz電針治療組，共5組，每組10只實驗動物及分組選用SPF級健康wistar雄性大鼠,3-4月齡,由湖北省實

（1）正常組：與其他治療組用同樣的方法進行抓取，但不予任何處理。

（2）模型組：即腦室內注射Aβ1-42建立AD大鼠模型(具體方法見下文)。造模成功后，不進行任何治療。與其他治療組用同樣的方法進行抓取。

（3）假手術組：制作方法同模型組，僅注射相同量的生理鹽水。與其他治療組用同樣的方法進行抓取。

（4）2Hz電針治療組：即在成功造模后立即開始施于電針刺激。針刺大鼠“百會”（頂骨正中）、“腎俞”（第二腰椎下兩旁）穴(穴位定位參照中國針灸學會實驗針灸分會制定的《動物針灸穴位圖譜》)，百會向前平刺3-5mm，腎俞穴稍向內斜刺5mm，接上海產G6805Ⅱ型電針治療儀，百會接負極，腎俞接正極，左右側腎俞每日交替使用。選用連續(xù)被，頻率2Hz，電壓2-4V，電流1-2mA，留針20min，每日1次，7日為1療程，療程間休息1日，共治療2個療程。

（5）50Hz電針治療組：電針選用連續(xù)波，頻率50Hz，電壓、電流、操作方法同2Hz電針治療

組。（1）正常組：與其他治療組用同樣的方法進行抓取，但不予任何主要實驗器材大鼠腦立體定位儀電針治療儀主要實驗器材大鼠腦立體定位儀電針治療儀主要實驗器材膜片鉗系統(tǒng)Morris水迷宮測試系統(tǒng)主要實驗器材膜片鉗系統(tǒng)Morris水迷宮測試系統(tǒng)主要實驗試劑試劑廠家Aβ1-42注射液Sigma青霉素國藥集團生理鹽水國藥集團4%多聚甲醛國藥集團10%水合氯醛國藥集團主要實驗試劑試劑廠家Aβ1-42注射液Sigma青霉素國藥集

實驗前將Aβ1-42用磷酸鹽緩沖液（PBS）配制成１ug/μl的溶液３７℃孵育7d，使其變成聚合狀態(tài)從而具有神經毒性；實驗用大鼠置于安靜清潔環(huán)境中，分籠喂養(yǎng)，溫度控制在（２４±２）℃，定時給予充足清潔飲水和定量大鼠專用飼料。適應性喂養(yǎng)１周后，無不良反應，飲食、飲水正常者，開始進行Morris水迷宮測試篩選，剔除不符合評定標準的大鼠動物模型制備方法實驗前將Aβ1-42用磷酸鹽緩沖液（PBS）評定后的合格大鼠進行稱重，用10%的水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀上保持前后囟在同一水平。無菌環(huán)境下，顱頂區(qū)備皮，剝開皮下筋膜暴露頂骨，進行手術區(qū)皮膚消毒，于兩側冠狀縫后鉆出小孔，取出碎骨屑，保持硬腦膜的完整。按照“大鼠腦立體定位圖譜”選擇大鼠海馬區(qū)域用微量注射器緩慢將藥物Aβ1-42（10μl）注入海馬（前囟后3.3mm，中線左右各旁開1.5mm，深度3mm），5min內注完，注射后留針5min，按1.0mm/min的速度緩慢出針，以免拔針時藥物溢出。術后牙托粉封固顱骨孔，縫合皮膚，３日內每日肌內注射青霉素Ｇ10萬Ｕ防止感染，并經Morris水迷宮進行模型評價，剔除不合格者。動物模型制備方法評定后的合格大鼠進行稱重，用10%的水合氯醛（300mg/k

動物取材

1、大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉(0.4ml/100g)下斷頭

在以

95%O2+5%CO2

混合氣飽和的

4℃人工腦脊液(artificialcerebrospinalfluid,ACSF)持續(xù)沖洗下,迅速取腦并置于預先用

ACSF濕潤的濾紙上,沿正中線切開兩大腦半球。2、

由腦腹內側沿皮層邊緣仔細分離出海馬,在通有混合氣的4℃ACSF中,用切片刀垂直于海馬長軸將其切成厚約400um的腦薄片,所有腦片置于

30～32℃ACSF中,并不斷通入

95%O2+5%CO2混合氣,孵育

1～2h待用。3