單分子探測技術(shù)課件

單分子探測技術(shù)

報告人：韓潔

12/22/20221

單分子探測技術(shù)報告人單分子探測技術(shù)產(chǎn)生的原因單分子探測的主要基本技術(shù)單分子熒光檢測的物理基礎(chǔ)單分子熒光檢測技術(shù)應(yīng)用主要內(nèi)容單分子探測技術(shù)產(chǎn)生的原因主要內(nèi)容單分子探測技術(shù)的產(chǎn)生原因

通常對大量分子集合體的觀察測量只給出一個參數(shù)的整體平均值,單分子水平的測量則完全排除了這種平均效應(yīng)；單分子體系的變化過程與時間密切相關(guān)。采用分子集合體時不能觀察到這種時間相關(guān)的行為；觀察到未知領(lǐng)域中的新效應(yīng)。單分子探測技術(shù)的產(chǎn)生原因通常對大量分子集合體的觀察測量只給單分子檢測的基本技術(shù)

（singlemoleculesdetection,SMD)掃描探針顯微技術(shù)(SPM)光鑷技術(shù)熒光技術(shù)單分子檢測的基本技術(shù)

（singlemoleculesd單分子熒光檢測的物理基礎(chǔ)熒光壽命τ=1/(Kf+ΣK)熒光量子產(chǎn)率

φ=發(fā)射的光子數(shù)/吸收的光子數(shù)光漂白幾率單分子熒光檢測的物理基礎(chǔ)熒光壽命光漂白熒光分子在激發(fā)光的照射下,經(jīng)歷多次受激、退激過程后,往往造成分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆的變化,不能吸收更多的光子而進(jìn)一步發(fā)射熒光。光漂白幾率φd=1/分子在漂白前吸收的平均光子數(shù)光漂白熒光分子在激發(fā)光的照射下,經(jīng)歷多次受激、退激過程后提供了一種“遠(yuǎn)距離操作”的方法.在不喪失優(yōu)越的空間分辨率的情況下對樣品擾動很小。熒光技術(shù)特點(diǎn)

提供了一種“遠(yuǎn)距離操作”的方法.在不喪失優(yōu)越的空間分辨率的情單分子熒光特性量子跳躍特性取決于單分子的周圍環(huán)境和猝滅途徑熒光偏振特性單分子熒光分子具有唯一的固定吸收和發(fā)射偶極矩，因此在偏振激光的激發(fā)下，通過測量單個分子的吸收和熒光的偏振方向，可以完全確定單個熒光分子的空間取向。單分子熒光特性量子跳躍特性熒光偏振特性單個GFP分子的熒光on-off現(xiàn)象Off態(tài)主要來源于單個GFP分子的光化學(xué)誘導(dǎo)的長壽命的暗態(tài)單個GFP分子的熒光on-off現(xiàn)象Off態(tài)主要來源于單個單分子熒光探測的必須條件在被照射的體積中只有一個分子與激光發(fā)生相互作用確保單分子的信號大于背景干擾信號(有效減少拉曼散射、瑞利散射及其雜質(zhì)熒光所造成的干擾)單分子熒光探測的必須條件在被照射的體積中只有一個分子難點(diǎn)：雜散光背景比熒光信號大得多

Rayleigh散射光光學(xué)器件的散射光溶液雜質(zhì)的熒光溶液的Raman散射光光譜過濾減小靈敏體積時間門技術(shù)雜散光減小方法難點(diǎn)：雜散光背景比熒光信號大得多Rayleigh散射光光譜LIF的基本原理在激光的照射下,分子吸收光子而被激發(fā)到某一激發(fā)態(tài),在退激的過程中發(fā)射熒光。對于熒光量子產(chǎn)率較大的分子,其激發(fā)態(tài)的壽命為ns量級,而分子通過激光束的時間為ms量級,因此在連續(xù)或準(zhǔn)連續(xù)激光的激發(fā)下,一個分子在通過激光束的過程中,將被多次反復(fù)激發(fā)而發(fā)射出大量的熒光光子，即所謂的“光子爆發(fā)”（photonburst)LIF的基本原理在激光的照射下,分子吸收光子而被激發(fā)到某單個染料分子所能發(fā)出的熒光光子數(shù)目兩個假定：激光光束正好聚焦在探測靈敏區(qū)的中間染料分子通過探測靈敏區(qū)的中心P:激光束的平均功率ω:聚焦半徑λ:激光波長σ:光吸收截面v:樣品的流速h:普朗克常數(shù)

NA=EAλ/hc=0.76σPλ/ωvhc

單個染料分子所能發(fā)出的熒光光子數(shù)目兩個假定：激光光束正好聚焦激光功率對熒光強(qiáng)度的影響曲線激光功率對熒光強(qiáng)度的影響曲線共聚焦顯微鏡原理共聚焦顯微鏡原理昆蟲腦部雙重染色a.傳統(tǒng)的熒光顯微影像b.共聚焦顯微鏡影像昆蟲腦部雙重染色a.傳統(tǒng)的熒光顯微影像b.共聚焦顯微鏡影像單分子對熒光能量共振轉(zhuǎn)移

(spFRET

)

原理：標(biāo)記兩個不同的熒光基團(tuán),一個是供體Ｄ。另一個受體Ａ。受體的吸收光譜與供體的發(fā)射光譜相重疊。由于偶極-偶極相互作用,能量從供體傳遞到受體。通過探測能量轉(zhuǎn)移效率,可確定兩點(diǎn)間的距離,并且通過檢測能量轉(zhuǎn)移效率隨時間的變化來推測構(gòu)象的變化所引起的兩點(diǎn)間距離的變化。單分子對熒光能量共振轉(zhuǎn)移

(spFRET)

原理：單對Ｄ-Ａ體系標(biāo)記的單個無抑制劑蛋白的能量轉(zhuǎn)移過程單對Ｄ-Ａ體系標(biāo)記的單個無抑制劑蛋白的能量轉(zhuǎn)移過程展望

作為一門新興邊緣學(xué)科,單分子科學(xué)展現(xiàn)出蓬勃的生機(jī)。1.單分子實(shí)驗(yàn)方法還有待于進(jìn)一步開拓與改進(jìn)。如熒光技術(shù)中時間匹配(熒光漂白)。2.單分子理論還有大量工作可做。單分子實(shí)驗(yàn)方法的一個共同特點(diǎn)是信息量大,而有效地把這些信息從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中提取出來就需要強(qiáng)有力的理論指導(dǎo)。3.隨著單分子科學(xué)的發(fā)展,越來越多的新的物理效應(yīng)與各種應(yīng)用將被揭示出來。展望作為一門新興邊緣學(xué)科,單分子科學(xué)展現(xiàn)出蓬勃的生機(jī)Thankyou!Thankyou!

單分子探測技術(shù)

報告人：韓潔

12/22/202221

單分子探測技術(shù)報告人單分子探測技術(shù)產(chǎn)生的原因單分子探測的主要基本技術(shù)單分子熒光檢測的物理基礎(chǔ)單分子熒光檢測技術(shù)應(yīng)用主要內(nèi)容單分子探測技術(shù)產(chǎn)生的原因主要內(nèi)容單分子探測技術(shù)的產(chǎn)生原因

通常對大量分子集合體的觀察測量只給出一個參數(shù)的整體平均值,單分子水平的測量則完全排除了這種平均效應(yīng)；單分子體系的變化過程與時間密切相關(guān)。采用分子集合體時不能觀察到這種時間相關(guān)的行為；觀察到未知領(lǐng)域中的新效應(yīng)。單分子探測技術(shù)的產(chǎn)生原因通常對大量分子集合體的觀察測量只給單分子檢測的基本技術(shù)

（singlemoleculesdetection,SMD)掃描探針顯微技術(shù)(SPM)光鑷技術(shù)熒光技術(shù)單分子檢測的基本技術(shù)

（singlemoleculesd單分子熒光檢測的物理基礎(chǔ)熒光壽命τ=1/(Kf+ΣK)熒光量子產(chǎn)率

φ=發(fā)射的光子數(shù)/吸收的光子數(shù)光漂白幾率單分子熒光檢測的物理基礎(chǔ)熒光壽命光漂白熒光分子在激發(fā)光的照射下,經(jīng)歷多次受激、退激過程后,往往造成分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆的變化,不能吸收更多的光子而進(jìn)一步發(fā)射熒光。光漂白幾率φd=1/分子在漂白前吸收的平均光子數(shù)光漂白熒光分子在激發(fā)光的照射下,經(jīng)歷多次受激、退激過程后提供了一種“遠(yuǎn)距離操作”的方法.在不喪失優(yōu)越的空間分辨率的情況下對樣品擾動很小。熒光技術(shù)特點(diǎn)

提供了一種“遠(yuǎn)距離操作”的方法.在不喪失優(yōu)越的空間分辨率的情單分子熒光特性量子跳躍特性取決于單分子的周圍環(huán)境和猝滅途徑熒光偏振特性單分子熒光分子具有唯一的固定吸收和發(fā)射偶極矩，因此在偏振激光的激發(fā)下，通過測量單個分子的吸收和熒光的偏振方向，可以完全確定單個熒光分子的空間取向。單分子熒光特性量子跳躍特性熒光偏振特性單個GFP分子的熒光on-off現(xiàn)象Off態(tài)主要來源于單個GFP分子的光化學(xué)誘導(dǎo)的長壽命的暗態(tài)單個GFP分子的熒光on-off現(xiàn)象Off態(tài)主要來源于單個單分子熒光探測的必須條件在被照射的體積中只有一個分子與激光發(fā)生相互作用確保單分子的信號大于背景干擾信號(有效減少拉曼散射、瑞利散射及其雜質(zhì)熒光所造成的干擾)單分子熒光探測的必須條件在被照射的體積中只有一個分子難點(diǎn)：雜散光背景比熒光信號大得多

Rayleigh散射光光學(xué)器件的散射光溶液雜質(zhì)的熒光溶液的Raman散射光光譜過濾減小靈敏體積時間門技術(shù)雜散光減小方法難點(diǎn)：雜散光背景比熒光信號大得多Rayleigh散射光光譜LIF的基本原理在激光的照射下,分子吸收光子而被激發(fā)到某一激發(fā)態(tài),在退激的過程中發(fā)射熒光。對于熒光量子產(chǎn)率較大的分子,其激發(fā)態(tài)的壽命為ns量級,而分子通過激光束的時間為ms量級,因此在連續(xù)或準(zhǔn)連續(xù)激光的激發(fā)下,一個分子在通過激光束的過程中,將被多次反復(fù)激發(fā)而發(fā)射出大量的熒光光子，即所謂的“光子爆發(fā)”（photonburst)LIF的基本原理在激光的照射下,分子吸收光子而被激發(fā)到某單個染料分子所能發(fā)出的熒光光子數(shù)目兩個假定：激光光束正好聚焦在探測靈敏區(qū)的中間染料分子通過探測靈敏區(qū)的中心P:激光束的平均功率ω:聚焦半徑λ:激光波長σ:光吸收截面v:樣品的流速h:普朗克常數(shù)

NA=EAλ/hc=0.76σPλ/ωvhc

單個染料分子所能發(fā)出的熒光光子數(shù)目兩個假定：激光光束正好聚焦激光功率對熒光強(qiáng)度的影響曲線激光功率對熒光強(qiáng)度的影響曲線共聚焦顯微鏡原理共聚焦顯微鏡原理昆蟲腦部雙重染色a.傳統(tǒng)的熒光顯微影像b.共聚焦顯微鏡影像昆蟲腦部雙重染色a.傳統(tǒng)的熒光顯微影像b.共聚焦顯微鏡影像單分子對熒光能量共振轉(zhuǎn)移

(spFRET

)

原理：標(biāo)記兩個不同的熒光基團(tuán),一個是供體Ｄ。另一個受體Ａ。受體的吸收光譜與供體的發(fā)射光譜相重疊。由于偶極-偶極相互作用,能量從供體傳遞到受體。通過探測能量轉(zhuǎn)移效率,可確定兩點(diǎn)間的距離,并且通過檢測能量轉(zhuǎn)移效率隨時間的變化來推測構(gòu)象的變化所引起的兩點(diǎn)間距離的變化。單分子對熒光能量共振轉(zhuǎn)移

(spFRET)

原理：單對Ｄ-Ａ體系標(biāo)記的單個無抑制劑蛋白的能量轉(zhuǎn)移過程單對Ｄ-Ａ體系標(biāo)記的單個無抑制劑蛋白的能量轉(zhuǎn)移過程展望

作為一門新興邊緣