DB32∕T 3762.17-2021 新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范 第17部分：核酸檢測(cè)用假病毒陽性質(zhì)控品

ICS13.100C50DB32江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)DB32/T3762.17—2021新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范第17部分：核酸檢測(cè)用假病毒陽性質(zhì)控品TechnicalspecificationsforSARS-CoV-2detectionPart17:Pseudoviruspositivecontrolmaterialfornucleicaciddetection2021-12-09發(fā)布2022-01-09實(shí)施DB32/T3762.17—2021目次前123456789言............................................................................................................................................................II范圍..............................................................................................................................................................1規(guī)范性引用文件..........................................................................................................................................1術(shù)語和定義..................................................................................................................................................1縮略語..........................................................................................................................................................2技術(shù)要求......................................................................................................................................................2試劑和材料..................................................................................................................................................3儀器和設(shè)備..................................................................................................................................................3假病毒原液的技術(shù)要求..............................................................................................................................3質(zhì)控品的制備..............................................................................................................................................510質(zhì)控品的技術(shù)要求......................................................................................................................................5IDB32/T3762.17—2021前言DB32/T3762《新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》目前分為以下部分：——第1部分：生物樣本采集、運(yùn)輸和保存；——第2部分：病毒分離與鑒定；——第3部分：核酸熒光PCR檢測(cè)程序；——第4部分：重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增程序；——第5部分：血清IgM和IgG抗體酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)程序；——第6部分：血清IgM和IgG抗體膠體金免疫層析檢測(cè)程序；——第7部分：空氣樣本檢測(cè)與評(píng)估；——第8部分：物體表面檢測(cè)與評(píng)估；——第9部分：醫(yī)務(wù)人員職業(yè)暴露檢測(cè)與評(píng)估；——第10部分：微量血清中和試驗(yàn)；——第11部分：全基因組高通量測(cè)序；——第12部分：藥物體外抗病毒效果測(cè)定；——第13部分：疊氮溴化丙錠-熒光PCR檢測(cè)程序；——第14部分：N亞基因組熒光PCR檢測(cè)程序；——第15部分：血清/血漿IgM和IgG抗體磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)程序；——第16部分：核酸數(shù)字PCR法；——第17部分：核酸檢測(cè)用假病毒陽性質(zhì)控品；——第18部分：規(guī)模化核酸檢測(cè)程序。本文件為DB32/T3762的第17部分。本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。IIDB32/T3762.17—2021新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范第17部分：核酸檢測(cè)用假病毒陽性質(zhì)控品1范圍本文件規(guī)定了新型冠狀病毒核酸檢測(cè)用假病毒類弱陽性質(zhì)控品的術(shù)語和定義、縮略語、試劑和材料、儀器和設(shè)備、假病毒原液的技術(shù)要求、質(zhì)控品的制備和質(zhì)控品的技術(shù)要求。本文件適用于新型冠狀病毒核酸檢測(cè)用假病毒類弱陽性質(zhì)控品的技術(shù)要求以及評(píng)價(jià)方法。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法JJF1006一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范JJF1343標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1質(zhì)控品controlmaterial用于體外診斷的質(zhì)量控制物質(zhì)，是一種旨在用于醫(yī)學(xué)用途的檢測(cè)系統(tǒng)中使用的物質(zhì)、材料、物品或設(shè)備，其目的是評(píng)價(jià)或驗(yàn)證測(cè)量精密度、測(cè)量準(zhǔn)確度、由于試劑或分析儀器的變化檢測(cè)系統(tǒng)可能產(chǎn)生的分析偏差等性能特征，可用于能力驗(yàn)證、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制。3.2假病毒pseudovirus一種具有病毒擬似的物理結(jié)構(gòu)和特異性核酸序列的病毒樣粒子，其分析特性與真實(shí)病毒相似，但不具備自我復(fù)制和感染的能力。3.3假病毒質(zhì)控品pseudoviruscontrolmaterial由假病毒原料定量分裝后制成，能夠參與到病毒檢測(cè)從提取到擴(kuò)增的全過程；具有生物安全性的同時(shí)可作為測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)，用于病毒核酸定性和定量測(cè)量方法的驗(yàn)證評(píng)價(jià)以及實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制。3.4計(jì)量溯源性metrologicaltraceability1

DB32/T3762.17—2021通過一條具有規(guī)定不確定度的不間斷的比較鏈，使測(cè)量結(jié)果或測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)的值能夠與規(guī)定的參考標(biāo)準(zhǔn)（通常是與國家測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)或國際測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)）聯(lián)系起來的特性。3.5同源性homology兩個(gè)核酸分子的核苷酸序列間的相似程度。本文指假病毒質(zhì)控品中目的基因序列與相應(yīng)的真實(shí)病毒參考毒株序列的一致性。3.6均勻性u(píng)niformity同一批次生產(chǎn)的假病毒質(zhì)控品，每個(gè)最小包裝單元含有等量的目標(biāo)假病毒的狀態(tài)。通過測(cè)量取自不同包裝單元或取自同一包裝單元的、特定量的樣品，定量測(cè)量結(jié)果落在規(guī)定不確定度范圍內(nèi)，則可認(rèn)為質(zhì)控品所含目標(biāo)假病毒的量是均勻的。3.7穩(wěn)定性stability假病毒質(zhì)控品在特定的保存條件和保存時(shí)間內(nèi)，假病毒的量保持在規(guī)定范圍內(nèi)的能力。4縮略語下列縮略語適用于本文件。DMEM：Dulbecco改良培養(yǎng)基（Dulbecco’smodifiedeagle’smedium）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）qPCR：熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitativepolymerasechainreaction）RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reversetranscriptionpolymerasechainreaction）RT-qPCR：逆轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reversetranscriptionquantitativepolymerasechainreaction）RNase：核糖核酸酶（ribonuclease）5技術(shù)要求5.1假病毒質(zhì)控品的技術(shù)要求主要分為兩個(gè)方面，包含對(duì)假病毒原液的技術(shù)要求，如假病毒內(nèi)靶標(biāo)RNA序列的同源性、假病毒原液的雜質(zhì)殘留等；還包含對(duì)質(zhì)控品成品的技術(shù)要求，如靶標(biāo)RNA定值、均勻性、穩(wěn)定性等。5.2假病毒質(zhì)控品必須同時(shí)滿足以下8點(diǎn)技術(shù)要求，才能作為新型冠狀病毒核酸檢測(cè)用的弱陽性質(zhì)控品：a)用于制備質(zhì)控品的原料假病毒含有與新冠核酸檢測(cè)的靶標(biāo)RNA序列一致的RNA；用于制備質(zhì)控品的假病毒原液不含有cDNA雜質(zhì)；b)c)d)用于制備質(zhì)控品的假病毒原液無菌；質(zhì)控品的靶標(biāo)RNA濃度為試劑盒檢出限的1.5-3倍左右，且定值結(jié)果具有計(jì)量溯源性；2DB32/T3762.17—2021e)f)質(zhì)控品同批次均勻性合格；質(zhì)控品短期、長期及極端環(huán)境下穩(wěn)定性合格；質(zhì)控品適用于至少8款獲批上市的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒。g)6試劑和材料6.16.26.36.46.56.6無酶水：GB/T6682中的一級(jí)水，應(yīng)為無RNA酶的水。PCR、RT-PCR、RT-qPCR、數(shù)字PCR相關(guān)試劑：商品化試劑。PCR引物、探針：參照權(quán)威機(jī)構(gòu)公布的序列或自行設(shè)計(jì)。RNase：商品化試劑。無RNA酶的各型號(hào)槍頭、EP管、PCR管、離心管、試管：商品化耗材。本文件中所有的化學(xué)試劑，除特別說明外，全部為分析純級(jí)別試劑。7儀器和設(shè)備7.17.27.37.47.57.67.77.87.9生物安全柜。普通離心機(jī)、冷凍離心機(jī)。恒溫水浴鍋。PCR儀。核酸電泳儀。凝膠成像系統(tǒng)。熒光定量PCR儀。數(shù)字PCR系統(tǒng)。各型號(hào)移液器。7.10培養(yǎng)箱。8假病毒原液的技術(shù)要求8.1靶標(biāo)RNA序列同源性的檢測(cè)8.1.1檢測(cè)方法8.1.1.1RT-PCR檢測(cè)提取假病毒的RNA作為模板。選用中國疾病預(yù)防控制中心或世界衛(wèi)生組織推薦的（見表1）或根據(jù)靶標(biāo)RNA自行設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。設(shè)置以水為模板的陰性對(duì)照，以含靶標(biāo)RNA的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為模板的陽性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離、回收反應(yīng)產(chǎn)物。3

DB32/T3762.17—2021表1中國疾病預(yù)防控制中心、世界衛(wèi)生組織推薦的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)引物和探針序列目標(biāo)基因引物/探針序列（5’—3’）FRPFRPFRPCCCTGTGGGTTTTACACTTAAORF1abACGATTGTGCATCAGCTGA5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'GGGGAACTTCTCCTGCTAGAATNECAGACATTTTGCTCTCAAGCTG5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTATATTGCAGCAGTACGCACACA5'-FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BBQ-3'8.1.1.2測(cè)序及溯源性分析將8.1.1.1的產(chǎn)物測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與相應(yīng)的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)靶標(biāo)RNA的參考序列進(jìn)行比對(duì)。8.1.2結(jié)果判定在RT-PCR陰性對(duì)照和陽性對(duì)照都成立的情況下：a)b)若滿足假病毒RNA的RT-PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果為陽性且測(cè)序結(jié)果比對(duì)一致，則為合格；若假病毒RNART-PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果為陰性，則表明假病毒未包裹病毒RNA，或假病毒核酸提取失敗，應(yīng)重新制備假病毒或提取核酸。8.2cDNA雜質(zhì)的檢測(cè)8.2.1檢測(cè)方法分別以未做核酸提取的假病毒原液和假病毒中提取的RNA為模板，使用推薦的或自行設(shè)計(jì)的引物和探針或商品化試劑盒進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。設(shè)置以水為模板的陰性對(duì)照，以重組質(zhì)粒為模板的陽性對(duì)照。8.2.2結(jié)果判定在陰性對(duì)照和陽性對(duì)照都成立的情況下：a)若未提取的假病毒原液和/或假病毒提取的RNA的qPCR結(jié)果為陽性，即出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線或依據(jù)試劑盒說明書判定，則表明原液中或假病毒內(nèi)含有cDNA雜質(zhì)，即為不合格，應(yīng)重新消化去除cDNA雜質(zhì)。b)若未提取的假病毒原液和假病毒提取的RNA的qPCR結(jié)果為陰性，即未起峰或依據(jù)試劑盒說明書判定，說明無cDNA，即為合格。8.39無菌檢測(cè)用DMEM培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)假病毒原液24h，溶液澄清，無菌生長，即為合格。質(zhì)控品的制備4DB32/T3762.17—2021對(duì)結(jié)果判定為合格的假病毒原液，根據(jù)需要使用適當(dāng)?shù)娜軇?duì)假病毒原料進(jìn)行稀釋后，分裝至凍存管，直接或凍干后-20℃保存。具體制備過程本文件不作贅述。10質(zhì)控品的技術(shù)要求10.1新型冠狀病毒靶標(biāo)RNA的定量10.1.1基本要求采用核酸提取方法提取假病毒質(zhì)控品的RNA，采用RT-qPCR法或數(shù)字PCR法對(duì)靶標(biāo)RNA的濃度進(jìn)行定值。使用推薦的或自行設(shè)計(jì)的引物和探針或商品化試劑盒進(jìn)行定值。核酸提取方法和靶標(biāo)RNA濃度的定值方法均應(yīng)通過適宜的國家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的驗(yàn)證方可采用。10.1.2RT-qPCR定量法10.1.2.1使用RT-qPCR法進(jìn)行定量時(shí)，所使用的具體方法應(yīng)為針對(duì)新型冠狀病毒靶標(biāo)RNA片段設(shè)計(jì)建立的方法。10.1.2.2重組質(zhì)粒。10.1.2.3標(biāo)準(zhǔn)品可以為拷貝數(shù)已知的新型冠狀病毒RNA或cDNA，或含有相關(guān)目的DNA片段的將標(biāo)準(zhǔn)品以10倍進(jìn)行梯度稀釋至少5個(gè)梯度，分別以每個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為模板，進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，根據(jù)各梯度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值和濃度制定標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式。10.1.2.4根據(jù)質(zhì)控品RNA的Ct值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式計(jì)算出質(zhì)控品中新型冠狀病毒靶標(biāo)RNA的濃度。10.1.3數(shù)字PCR定量法10.1.3.1使用數(shù)字PCR法進(jìn)行定量時(shí)，所使用的具體方法應(yīng)為針對(duì)新型冠狀病毒靶標(biāo)RNA片段設(shè)計(jì)建立的方法。10.1.3.2提取假病毒RNA，上樣至數(shù)字PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行數(shù)字PCR反應(yīng)。按照式（1）計(jì)算質(zhì)控品RNA的濃度。CC1A（1）BC—質(zhì)控品中靶標(biāo)RNA的原始濃度，單位為拷貝每微升；C1—數(shù)字PCR檢測(cè)結(jié)果所示的靶標(biāo)RNA的濃度，單位為拷貝每微升；A—數(shù)字PCR反應(yīng)體系中靶標(biāo)RNA的稀釋倍數(shù)；B—核酸提取時(shí)靶標(biāo)RNA的濃縮倍數(shù)。10.1.4靶標(biāo)RNA濃度的計(jì)算定值結(jié)果采取10.1.2或10.1.3所述的方法進(jìn)行靶標(biāo)RNA的濃度計(jì)算，質(zhì)控品濃度為新冠核酸檢測(cè)試劑盒檢出限的1.5-3倍左右即為合格。10.2均勻性檢測(cè)10.2.1檢測(cè)方法5DB32/T3762.17—2021按照J(rèn)JF1006和JJF1343的要求，依據(jù)每一批次質(zhì)控品的制備數(shù)量，隨機(jī)抽樣選擇不同數(shù)量的包裝單元進(jìn)行均勻性檢測(cè)。對(duì)質(zhì)控品進(jìn)行核酸提取后，按10.1.2或10.1.3的方法進(jìn)行靶標(biāo)RNA濃度測(cè)定，計(jì)算每一個(gè)包裝單元靶標(biāo)RNA的濃度。10.2.2均勻性判定對(duì)所得數(shù)據(jù)按照J(rèn)JF1006和JJF1343的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求進(jìn)行檢驗(yàn)，若結(jié)果無顯著性差異，則