BD流式分選的原理和應(yīng)用課件

BD流式分選的原理和應(yīng)用BD流式分選的原理和應(yīng)用流式細(xì)胞儀的原理流式細(xì)胞儀的應(yīng)用BDFACSJazz個(gè)人型流式細(xì)胞分選儀綱要綱要BD公司簡(jiǎn)介FairleghS.DickinsonMaxwellW.Becton美國BD公司是由MaxwellW.Becton和FairleighS.Dickinson于1897年在紐約創(chuàng)立的，總部設(shè)在新澤西州。全球500強(qiáng)企業(yè)之一1974年，BD與美國斯坦福大學(xué)合作研制出全球第一臺(tái)商用流式細(xì)胞分選儀，不斷推陳出新，在流式細(xì)胞領(lǐng)域始終保持領(lǐng)先地位。BD公司簡(jiǎn)介FairleghS.DickinsonMax市場(chǎng)情況BD是全球最大的流式細(xì)胞儀生產(chǎn)商和供應(yīng)商，在全球的占有率為85%，高端分選型流式細(xì)胞儀占有率大于90%。在全國各大醫(yī)院和科研院所，大部分為BD公司的儀器，總計(jì)數(shù)量已超過2000臺(tái)，如：清華大學(xué)，北京大學(xué)，中科院系統(tǒng)，軍科院系統(tǒng)，醫(yī)科院系統(tǒng)等等市場(chǎng)情況BD是全球最大的流式細(xì)胞儀生產(chǎn)商和供應(yīng)商，在全球的占BD公司流式細(xì)胞儀FACSJazzLSRFortessaFACSCantoIIAccuriC6FACSAriaIIInfluxBD公司流式細(xì)胞儀FACSJazzLSRFortessaFA什么是流式細(xì)胞儀？在流動(dòng)的狀態(tài)中檢測(cè)細(xì)胞各種物理及生物特征的一種儀器；InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid什么是流式細(xì)胞儀？在流動(dòng)的狀態(tài)中檢測(cè)細(xì)胞各種物理及生物特征的流式細(xì)胞儀特點(diǎn)及檢測(cè)標(biāo)本特異性強(qiáng)，靈敏度高，速度快，并能實(shí)現(xiàn)多參數(shù)分析；可檢測(cè)的樣本種類多樣(1)外周血，骨髓，細(xì)針穿刺，洗脫液，實(shí)體組織，培養(yǎng)細(xì)胞(2)血清、血漿、培養(yǎng)上清、細(xì)胞裂解液流式細(xì)胞儀特點(diǎn)及檢測(cè)標(biāo)本特異性強(qiáng)，靈敏度高，速度快，并能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成細(xì)胞功能大小細(xì)胞表面、胞漿、核特異性抗原粒度細(xì)胞活性DNA、RNA含量胞內(nèi)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)含量激素結(jié)合位點(diǎn)鈣離子、pH值、膜電位酶活性8檢測(cè)范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成細(xì)胞功能大小細(xì)胞表面、胞漿、核特異性抗原流式細(xì)胞儀能告訴我們什么？細(xì)胞的相對(duì)大小（前向角散射光信號(hào)，F(xiàn)SC）細(xì)胞的相對(duì)顆粒性及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性（側(cè)向散射光信號(hào)，SSC）相關(guān)的熒光強(qiáng)度流式細(xì)胞儀能告訴我們什么？細(xì)胞的相對(duì)大?。ㄇ跋蚪巧⑸涔庑盘?hào)，前向角散射光信號(hào)FSC前向角散射光信號(hào)FSC側(cè)向角散射光信號(hào)SSC側(cè)向角散射光信號(hào)SSC流式細(xì)胞儀的檢測(cè)信號(hào)-熒光激發(fā)光譜（Excitation，Ex）：是指能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光線，也稱為吸收光譜。吸收波峰（最大吸收波長(zhǎng)）：Ex-Max發(fā)射光譜（Emission，Em）：是指某一波長(zhǎng)激發(fā)光引起熒光素發(fā)射的一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的熒光發(fā)射波峰（最大發(fā)射波長(zhǎng)）：Em-Max488nm520nm異硫氰酸熒光素（FITC）熒光素分子利用激發(fā)光提供的能量激發(fā)熒光分子的初級(jí)電子躍遷到激發(fā)態(tài)，然后返回基態(tài)軌道釋放能量（也就是發(fā)射光）。12流式細(xì)胞儀的檢測(cè)信號(hào)-熒光激發(fā)光譜（Excitation，E流式細(xì)胞儀的檢測(cè)信號(hào)-熒光使用不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量常用的熒光素：PE，F(xiàn)ITC，APC等13流式細(xì)胞儀的檢測(cè)信號(hào)-熒光使用不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，流式對(duì)照的設(shè)置流式對(duì)照的設(shè)置對(duì)照的設(shè)置流式細(xì)胞術(shù)顯示的熒光強(qiáng)度是相對(duì)的、可調(diào)節(jié)的，所以需要設(shè)置一系列對(duì)照來確定細(xì)胞是否陽性。陰性對(duì)照陽性對(duì)照單染對(duì)照（補(bǔ)償對(duì)照）15對(duì)照的設(shè)置流式細(xì)胞術(shù)顯示的熒光強(qiáng)度是相對(duì)的、可調(diào)節(jié)的，所以需對(duì)照的設(shè)置-陰性對(duì)照空白對(duì)照：即不進(jìn)行任何標(biāo)記的細(xì)胞。主要用于確定待測(cè)標(biāo)本的自發(fā)熒光同型對(duì)照：即用同型抗體作平行實(shí)驗(yàn)。同型抗體為沒有特異性、與熒光抗體亞型一致的免疫球蛋白（即Fc段相同，F(xiàn)ab段不同）。用于確認(rèn)細(xì)胞是否為抗原特異性染色，排除非特異染色。16對(duì)照的設(shè)置-陰性對(duì)照空白對(duì)照：即不進(jìn)行任何標(biāo)記的細(xì)胞。主要用對(duì)照的設(shè)置-陽性對(duì)照陽性對(duì)照即應(yīng)用已知表達(dá)某種抗原的細(xì)胞（陽性細(xì)胞）進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。通常用于檢測(cè)抗體是否有問題或確定實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性。與陰性對(duì)照一起判斷測(cè)試樣品是否為特異性染色。17對(duì)照的設(shè)置-陽性對(duì)照陽性對(duì)照即應(yīng)用已知表達(dá)某種抗原的細(xì)胞（陽對(duì)照的設(shè)置-單染對(duì)照（補(bǔ)償對(duì)照）補(bǔ)償對(duì)照-多色熒光分析會(huì)有光譜交叉，需要熒光補(bǔ)償幾色分析需要設(shè)置幾個(gè)補(bǔ)償對(duì)照18對(duì)照的設(shè)置-單染對(duì)照（補(bǔ)償對(duì)照）補(bǔ)償對(duì)照-多色熒光分析會(huì)有光單染對(duì)照（補(bǔ)償對(duì)照）-熒光補(bǔ)償方法530/400580/30FITCPE19單染對(duì)照（補(bǔ)償對(duì)照）-熒光補(bǔ)償方法530/400580/30流式細(xì)胞儀如何得到細(xì)胞20分選細(xì)胞從復(fù)雜的細(xì)胞群體中得到高純度的靶細(xì)胞，進(jìn)一步深入研究流式細(xì)胞儀如何得到細(xì)胞20分選細(xì)胞高速分選原理21分選時(shí)，液流自驅(qū)動(dòng)力的作用下斷成高度均一的液滴。在噴嘴下的幾毫米處，液滴從液流斷開。從顆粒被檢測(cè)到液滴斷開的時(shí)間稱為液滴延遲時(shí)間，由BD專利的Accudrop技術(shù)直接計(jì)算符合分選條件的顆粒一旦被檢測(cè)到，包含該顆粒的液滴將要從液流斷開時(shí)，液流被充電。斷開后的液滴仍然帶電，帶電的液滴通過被充電的偏轉(zhuǎn)板。受靜電吸引或排斥，帶電液滴將向左或向右偏轉(zhuǎn)。不帶電的液滴不偏轉(zhuǎn)而流入廢液槽。高速分選原理21分選時(shí)，液流自驅(qū)動(dòng)力的作用下斷成高度均一的液22部分應(yīng)用實(shí)例科學(xué)是復(fù)雜的，工具是簡(jiǎn)單的22部分應(yīng)用實(shí)例科學(xué)是復(fù)雜的，工具是簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白GFP細(xì)胞的分選23用帶GFP(綠色熒光蛋白)標(biāo)記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在488nm激光激發(fā)下，表達(dá)GFP的細(xì)胞發(fā)綠色熒光。本實(shí)驗(yàn)為U937細(xì)胞轉(zhuǎn)染GFP和目的基因，用BDFACSAriaIII分選高表達(dá)GFP目的基因的細(xì)胞。本案例用BDFACSAriaIII分選GFP陽性細(xì)胞，該樣本GFP陽性的目標(biāo)細(xì)胞含量?jī)H為1.9%，分選后回測(cè)，目的細(xì)胞純度高達(dá)99%。轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白GFP細(xì)胞的分選23用帶GFP(綠色熒光蛋轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白GFP細(xì)胞的分選24分選后細(xì)胞在顯微鏡白光視野下可見，細(xì)胞膜清晰，狀態(tài)很好，在熒光顯微鏡下GFP所發(fā)綠光清晰可見，充分說明FACSAriaIII分選低表達(dá)細(xì)胞的高純度和高活性。轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白GFP細(xì)胞的分選24分選后細(xì)胞在顯微鏡白光視DNA含量檢測(cè)常用DNA染料：Hoechst33342、Hoechst33258、DAPI、色霉素A3（CA3）、吖啶橙（AO）、碘化丙啶（PI）、7-AAD、DRAQ5、EB等。結(jié)合位點(diǎn)不同染色方法不同激發(fā)波長(zhǎng)不同PI在DNA檢測(cè)中應(yīng)用最廣泛DNA染色過程中一定不要洗滌25DNA含量檢測(cè)常用DNA染料：Hoechst33342、HoDNA含量檢測(cè)細(xì)胞周期細(xì)胞凋亡染色體分選腫瘤干細(xì)胞分選26DNA含量檢測(cè)細(xì)胞周期26細(xì)胞周期G2MG0G1s

200400

600

8001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量細(xì)胞數(shù)量2N4N

DNA含量檢測(cè)27細(xì)胞周期細(xì)胞周期G2MG0G1s20040060080010小鼠精原細(xì)胞倍性分析分選28本實(shí)驗(yàn)取小鼠睪丸細(xì)胞，用Hochest33342進(jìn)行染色，BDFACSAriaSORP倍性分析后分選其中的初級(jí)精母細(xì)胞（4N），分選出的初級(jí)精母細(xì)胞后續(xù)用來抽提RNA。小鼠精原細(xì)胞倍性分析分選28本實(shí)驗(yàn)取小鼠睪丸細(xì)胞，用Hoc小鼠精原細(xì)胞倍性分析分選29小鼠睪丸細(xì)胞倍性分析，可清楚看到各倍體細(xì)胞群：N、2N、4N。本案例用BDFACSAriaSORP的UV激光光進(jìn)行Hochest33342染色的小鼠睪丸精原細(xì)胞倍體分析分選，從單參數(shù)直方圖可見，單倍體（N）峰、二倍體（2N）峰、四倍體（4N）峰區(qū)分很開，說明本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)精度高，CV值低。

小鼠精原細(xì)胞倍性分析分選29小鼠睪丸細(xì)胞倍性分析，可清楚看腫瘤細(xì)胞的非整倍體分析二倍體異倍體四倍體正常細(xì)胞DNA量相同，癌變細(xì)胞的DNA指數(shù)發(fā)生變化，非整倍體出現(xiàn)概率很高。用流式DNA峰圖鑒別細(xì)胞的倍體在病理學(xué)上是一種快速、直接的檢測(cè)方法。30腫瘤細(xì)胞的非整倍體分析二倍體異倍體四倍體正常細(xì)胞DNA量相同植物倍體的分析植物細(xì)胞的倍體非常復(fù)雜，常以多倍體形式存在。檢測(cè)時(shí)多采用對(duì)數(shù)形式。植物的倍性鑒定是多倍體研究的重要內(nèi)容之一。流式細(xì)胞術(shù)已應(yīng)用于玉米、向日葵、甘薯、木薯、獼猴桃、葡萄、棉花和李子的倍性鑒定。這將有利于果樹和農(nóng)作物的培植和育種。31植物倍體的分析植物細(xì)胞的倍體非常復(fù)雜，常以多倍體形式存在。3細(xì)胞凋亡凋亡后期，細(xì)胞膜通透性增大，DNA降解，降解產(chǎn)生的DNA核小體片段從細(xì)胞中釋放，因此，凋亡細(xì)胞比活細(xì)胞含有更少的DNA。凋亡細(xì)胞的DNA峰會(huì)出現(xiàn)在正常細(xì)胞G0/G1峰之前，稱為sub-G1峰。Sub-G1峰的出現(xiàn)被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之一。32細(xì)胞凋亡凋亡后期，細(xì)胞膜通透性增大，DNA降解，降解產(chǎn)生的D腫瘤細(xì)胞凋亡檢測(cè)33方法：Jurkat細(xì)胞分別用DMSO（對(duì)照；<2%）或HU-331（一種誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的大麻素；CaymanChemicalCompany）處理6小時(shí)。然后用AccuriCellCyclePhaseDeterminationKit(KR-300)固定細(xì)胞并染色。腫瘤細(xì)胞凋亡檢測(cè)33方法：Jurkat細(xì)胞分別用DMSO（對(duì)細(xì)胞凋亡-AnnexinⅤ/PI雙標(biāo)記法細(xì)胞凋亡時(shí)會(huì)發(fā)生一系列形態(tài)學(xué)改變。質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine,PS）重新分布，由胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到胞膜外側(cè)，可以通過膜聯(lián)蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）來檢測(cè)。為了區(qū)分凋亡和壞死兩種不同情況下的PS外翻，AnnexinⅤ常與鑒定細(xì)胞死活的染料（PI或7-AAD）聯(lián)合使用。細(xì)胞凋亡的PS與AnnexinⅤ結(jié)合，呈AnnexinⅤ陽性，同時(shí)凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜是完整的，PI不能進(jìn)入，因此，凋亡細(xì)胞是AnnexinⅤ+/PI-。死細(xì)胞的PS與AnnexinⅤ結(jié)合也呈陽性，但死細(xì)胞的膜已經(jīng)破裂，PI能夠進(jìn)入，所以死細(xì)胞是AnnexinⅤ+/PI+。34細(xì)胞凋亡-AnnexinⅤ/PI雙標(biāo)記法細(xì)胞凋亡時(shí)會(huì)發(fā)生一FITCAnnexinV/PI染色和流式細(xì)胞儀分析。Jurkat細(xì)胞（人T細(xì)胞白血?。┯?μM的喜樹堿或0.1%DMSO（陰性對(duì)照）4小時(shí)，引導(dǎo)凋亡。細(xì)胞根據(jù)AnnexinV-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒的染色指南，用FITCAnnexinV和碘化丙啶（PI）染色。與DMSO對(duì)照組相比，喜樹堿處理會(huì)增加細(xì)胞的早期凋亡（PI陰性，AnnexinV陽性），即圖中綠色部分。死細(xì)胞（PI陽性，紅色部分）和活細(xì)胞（AnnexinV和PI陰性，黑色部分）群體很容易辨別。圖中的數(shù)據(jù)來自BDAccuriC6流式細(xì)胞的BDCFlow?Plus。35細(xì)胞凋亡-AnnexinⅤ/PI雙標(biāo)記法FITCAnnexinV/PI染色和流式細(xì)胞儀分析。Ju染色體分選36染色體分選36腫瘤干細(xì)胞分選37腫瘤細(xì)胞株的SP細(xì)胞。人HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞使用Hoechst33342染色，裝有375nm激光器的BDFACSAriaⅢ上采集數(shù)據(jù)（左側(cè)散點(diǎn)圖）。作為對(duì)照樣品，SP表達(dá)被抑制（右側(cè)散點(diǎn)圖。）腫瘤干細(xì)胞分選37腫瘤細(xì)胞株的SP細(xì)胞。人HT-29結(jié)腸癌細(xì)BDFACSJazz個(gè)人型流式細(xì)胞分選儀可靠的性能，小巧的機(jī)身，實(shí)惠的價(jià)格開啟了細(xì)胞分選的新時(shí)代三激光8參數(shù)檢測(cè)個(gè)人分選精彩演繹BDFACSJazz個(gè)人型流式細(xì)胞分選儀可靠的性能，小巧BDFACSJazz配置及核心技術(shù)指標(biāo)（1）39光學(xué)系統(tǒng)原廠預(yù)優(yōu)化設(shè)置和直觀的操作

最高可達(dá)三激光6色，488nm激光器標(biāo)配，405nm、561nm、640nm激光器選配

支持多種熒光染料

簡(jiǎn)化的光路調(diào)節(jié)針孔攝像視頻窗口

檢測(cè)靈敏度：FITC<125MESF；PE<125MESFBDFACSJazz配置及核心技術(shù)指標(biāo)（1）39光學(xué)系統(tǒng)40液流系統(tǒng)

聲學(xué)耦合噴嘴裝置

新型液流控制臺(tái)和分選軟件

噴嘴裝置：噴嘴使用螺口與系統(tǒng)耦合，取下噴嘴清理時(shí)不會(huì)影響光路系統(tǒng)的校準(zhǔn)主要參數(shù)：

最小檢測(cè)大?。?um

最小上樣體積：200ul

分辨率：<3%CV

數(shù)據(jù)獲取速率：最高200,000事件/秒可更換液流管路BDFACSJazz配置及核心技術(shù)指標(biāo)（2）40液流系統(tǒng)主要參數(shù)：可更換液流管路BDFACSJazz配41分選參數(shù)：

專利的BDFACSAccudrop技術(shù)

可拆卸偏轉(zhuǎn)電極板

收集方式支持克隆及單細(xì)胞分析等多種應(yīng)用

分選倉內(nèi)情況清晰可見BDFACSJazz配置及核心技術(shù)指標(biāo)（3）41分選參數(shù)：BDFACSJazz配置及核心技術(shù)指標(biāo)（342軟件系統(tǒng)：

更好的操控性能

直觀的工作流程

強(qiáng)大的數(shù)據(jù)分析

索引分選讓克隆研究更加高效BDFACSJazz配置及核心技術(shù)指標(biāo)（4）42軟件系統(tǒng)：BDFACSJazz配置及核心技術(shù)指標(biāo)（443保護(hù)設(shè)施：

Baker定制生物安全柜，符合嚴(yán)格的國際行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

同時(shí)保護(hù)樣本、操作者和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境

完全符合生物安全標(biāo)準(zhǔn)

有效的氣流控制BDFACSJazz配置及核心技術(shù)指標(biāo)（5）43保護(hù)設(shè)施：BDFACSJazz配置及核心技術(shù)指標(biāo)（5定期維護(hù)保養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員定期的用戶交流會(huì)議各種形式及內(nèi)容的小型專業(yè)講座實(shí)際操作上機(jī)培訓(xùn)在線技術(shù)交流服務(wù)與支持定期維護(hù)保養(yǎng)服務(wù)與支持BD流式分選的原理和應(yīng)用BD流式分選的原理和應(yīng)用流式細(xì)胞儀的原理流式細(xì)胞儀的應(yīng)用BDFACSJazz個(gè)人型流式細(xì)胞分選儀綱要綱要BD公司簡(jiǎn)介FairleghS.DickinsonMaxwellW.Becton美國BD公司是由MaxwellW.Becton和FairleighS.Dickinson于1897年在紐約創(chuàng)立的，總部設(shè)在新澤西州。全球500強(qiáng)企業(yè)之一1974年，BD與美國斯坦福大學(xué)合作研制出全球第一臺(tái)商用流式細(xì)胞分選儀，不斷推陳出新，在流式細(xì)胞領(lǐng)域始終保持領(lǐng)先地位。BD公司簡(jiǎn)介FairleghS.DickinsonMax市場(chǎng)情況BD是全球最大的流式細(xì)胞儀生產(chǎn)商和供應(yīng)商，在全球的占有率為85%，高端分選型流式細(xì)胞儀占有率大于90%。在全國各大醫(yī)院和科研院所，大部分為BD公司的儀器，總計(jì)數(shù)量已超過2000臺(tái)，如：清華大學(xué)，北京大學(xué)，中科院系統(tǒng)，軍科院系統(tǒng)，醫(yī)科院系統(tǒng)等等市場(chǎng)情況BD是全球最大的流式細(xì)胞儀生產(chǎn)商和供應(yīng)商，在全球的占BD公司流式細(xì)胞儀FACSJazzLSRFortessaFACSCantoIIAccuriC6FACSAriaIIInfluxBD公司流式細(xì)胞儀FACSJazzLSRFortessaFA什么是流式細(xì)胞儀？在流動(dòng)的狀態(tài)中檢測(cè)細(xì)胞各種物理及生物特征的一種儀器；InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid什么是流式細(xì)胞儀？在流動(dòng)的狀態(tài)中檢測(cè)細(xì)胞各種物理及生物特征的流式細(xì)胞儀特點(diǎn)及檢測(cè)標(biāo)本特異性強(qiáng)，靈敏度高，速度快，并能實(shí)現(xiàn)多參數(shù)分析；可檢測(cè)的樣本種類多樣(1)外周血，骨髓，細(xì)針穿刺，洗脫液，實(shí)體組織，培養(yǎng)細(xì)胞(2)血清、血漿、培養(yǎng)上清、細(xì)胞裂解液流式細(xì)胞儀特點(diǎn)及檢測(cè)標(biāo)本特異性強(qiáng)，靈敏度高，速度快，并能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成細(xì)胞功能大小細(xì)胞表面、胞漿、核特異性抗原粒度細(xì)胞活性DNA、RNA含量胞內(nèi)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)含量激素結(jié)合位點(diǎn)鈣離子、pH值、膜電位酶活性52檢測(cè)范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成細(xì)胞功能大小細(xì)胞表面、胞漿、核特異性抗原流式細(xì)胞儀能告訴我們什么？細(xì)胞的相對(duì)大?。ㄇ跋蚪巧⑸涔庑盘?hào)，F(xiàn)SC）細(xì)胞的相對(duì)顆粒性及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性（側(cè)向散射光信號(hào)，SSC）相關(guān)的熒光強(qiáng)度流式細(xì)胞儀能告訴我們什么？細(xì)胞的相對(duì)大?。ㄇ跋蚪巧⑸涔庑盘?hào)，前向角散射光信號(hào)FSC前向角散射光信號(hào)FSC側(cè)向角散射光信號(hào)SSC側(cè)向角散射光信號(hào)SSC流式細(xì)胞儀的檢測(cè)信號(hào)-熒光激發(fā)光譜（Excitation，Ex）：是指能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光線，也稱為吸收光譜。吸收波峰（最大吸收波長(zhǎng)）：Ex-Max發(fā)射光譜（Emission，Em）：是指某一波長(zhǎng)激發(fā)光引起熒光素發(fā)射的一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的熒光發(fā)射波峰（最大發(fā)射波長(zhǎng)）：Em-Max488nm520nm異硫氰酸熒光素（FITC）熒光素分子利用激發(fā)光提供的能量激發(fā)熒光分子的初級(jí)電子躍遷到激發(fā)態(tài)，然后返回基態(tài)軌道釋放能量（也就是發(fā)射光）。56流式細(xì)胞儀的檢測(cè)信號(hào)-熒光激發(fā)光譜（Excitation，E流式細(xì)胞儀的檢測(cè)信號(hào)-熒光使用不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量常用的熒光素：PE，F(xiàn)ITC，APC等57流式細(xì)胞儀的檢測(cè)信號(hào)-熒光使用不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，流式對(duì)照的設(shè)置流式對(duì)照的設(shè)置對(duì)照的設(shè)置流式細(xì)胞術(shù)顯示的熒光強(qiáng)度是相對(duì)的、可調(diào)節(jié)的，所以需要設(shè)置一系列對(duì)照來確定細(xì)胞是否陽性。陰性對(duì)照陽性對(duì)照單染對(duì)照（補(bǔ)償對(duì)照）59對(duì)照的設(shè)置流式細(xì)胞術(shù)顯示的熒光強(qiáng)度是相對(duì)的、可調(diào)節(jié)的，所以需對(duì)照的設(shè)置-陰性對(duì)照空白對(duì)照：即不進(jìn)行任何標(biāo)記的細(xì)胞。主要用于確定待測(cè)標(biāo)本的自發(fā)熒光同型對(duì)照：即用同型抗體作平行實(shí)驗(yàn)。同型抗體為沒有特異性、與熒光抗體亞型一致的免疫球蛋白（即Fc段相同，F(xiàn)ab段不同）。用于確認(rèn)細(xì)胞是否為抗原特異性染色，排除非特異染色。60對(duì)照的設(shè)置-陰性對(duì)照空白對(duì)照：即不進(jìn)行任何標(biāo)記的細(xì)胞。主要用對(duì)照的設(shè)置-陽性對(duì)照陽性對(duì)照即應(yīng)用已知表達(dá)某種抗原的細(xì)胞（陽性細(xì)胞）進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。通常用于檢測(cè)抗體是否有問題或確定實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性。與陰性對(duì)照一起判斷測(cè)試樣品是否為特異性染色。61對(duì)照的設(shè)置-陽性對(duì)照陽性對(duì)照即應(yīng)用已知表達(dá)某種抗原的細(xì)胞（陽對(duì)照的設(shè)置-單染對(duì)照（補(bǔ)償對(duì)照）補(bǔ)償對(duì)照-多色熒光分析會(huì)有光譜交叉，需要熒光補(bǔ)償幾色分析需要設(shè)置幾個(gè)補(bǔ)償對(duì)照62對(duì)照的設(shè)置-單染對(duì)照（補(bǔ)償對(duì)照）補(bǔ)償對(duì)照-多色熒光分析會(huì)有光單染對(duì)照（補(bǔ)償對(duì)照）-熒光補(bǔ)償方法530/400580/30FITCPE63單染對(duì)照（補(bǔ)償對(duì)照）-熒光補(bǔ)償方法530/400580/30流式細(xì)胞儀如何得到細(xì)胞64分選細(xì)胞從復(fù)雜的細(xì)胞群體中得到高純度的靶細(xì)胞，進(jìn)一步深入研究流式細(xì)胞儀如何得到細(xì)胞20分選細(xì)胞高速分選原理65分選時(shí)，液流自驅(qū)動(dòng)力的作用下斷成高度均一的液滴。在噴嘴下的幾毫米處，液滴從液流斷開。從顆粒被檢測(cè)到液滴斷開的時(shí)間稱為液滴延遲時(shí)間，由BD專利的Accudrop技術(shù)直接計(jì)算符合分選條件的顆粒一旦被檢測(cè)到，包含該顆粒的液滴將要從液流斷開時(shí)，液流被充電。斷開后的液滴仍然帶電，帶電的液滴通過被充電的偏轉(zhuǎn)板。受靜電吸引或排斥，帶電液滴將向左或向右偏轉(zhuǎn)。不帶電的液滴不偏轉(zhuǎn)而流入廢液槽。高速分選原理21分選時(shí)，液流自驅(qū)動(dòng)力的作用下斷成高度均一的液66部分應(yīng)用實(shí)例科學(xué)是復(fù)雜的，工具是簡(jiǎn)單的22部分應(yīng)用實(shí)例科學(xué)是復(fù)雜的，工具是簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白GFP細(xì)胞的分選67用帶GFP(綠色熒光蛋白)標(biāo)記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在488nm激光激發(fā)下，表達(dá)GFP的細(xì)胞發(fā)綠色熒光。本實(shí)驗(yàn)為U937細(xì)胞轉(zhuǎn)染GFP和目的基因，用BDFACSAriaIII分選高表達(dá)GFP目的基因的細(xì)胞。本案例用BDFACSAriaIII分選GFP陽性細(xì)胞，該樣本GFP陽性的目標(biāo)細(xì)胞含量?jī)H為1.9%，分選后回測(cè)，目的細(xì)胞純度高達(dá)99%。轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白GFP細(xì)胞的分選23用帶GFP(綠色熒光蛋轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白GFP細(xì)胞的分選68分選后細(xì)胞在顯微鏡白光視野下可見，細(xì)胞膜清晰，狀態(tài)很好，在熒光顯微鏡下GFP所發(fā)綠光清晰可見，充分說明FACSAriaIII分選低表達(dá)細(xì)胞的高純度和高活性。轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白GFP細(xì)胞的分選24分選后細(xì)胞在顯微鏡白光視DNA含量檢測(cè)常用DNA染料：Hoechst33342、Hoechst33258、DAPI、色霉素A3（CA3）、吖啶橙（AO）、碘化丙啶（PI）、7-AAD、DRAQ5、EB等。結(jié)合位點(diǎn)不同染色方法不同激發(fā)波長(zhǎng)不同PI在DNA檢測(cè)中應(yīng)用最廣泛DNA染色過程中一定不要洗滌69DNA含量檢測(cè)常用DNA染料：Hoechst33342、HoDNA含量檢測(cè)細(xì)胞周期細(xì)胞凋亡染色體分選腫瘤干細(xì)胞分選70DNA含量檢測(cè)細(xì)胞周期26細(xì)胞周期G2MG0G1s

200400

600

8001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量細(xì)胞數(shù)量2N4N

DNA含量檢測(cè)71細(xì)胞周期細(xì)胞周期G2MG0G1s20040060080010小鼠精原細(xì)胞倍性分析分選72本實(shí)驗(yàn)取小鼠睪丸細(xì)胞，用Hochest33342進(jìn)行染色，BDFACSAriaSORP倍性分析后分選其中的初級(jí)精母細(xì)胞（4N），分選出的初級(jí)精母細(xì)胞后續(xù)用來抽提RNA。小鼠精原細(xì)胞倍性分析分選28本實(shí)驗(yàn)取小鼠睪丸細(xì)胞，用Hoc小鼠精原細(xì)胞倍性分析分選73小鼠睪丸細(xì)胞倍性分析，可清楚看到各倍體細(xì)胞群：N、2N、4N。本案例用BDFACSAriaSORP的UV激光光進(jìn)行Hochest33342染色的小鼠睪丸精原細(xì)胞倍體分析分選，從單參數(shù)直方圖可見，單倍體（N）峰、二倍體（2N）峰、四倍體（4N）峰區(qū)分很開，說明本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)精度高，CV值低。

小鼠精原細(xì)胞倍性分析分選29小鼠睪丸細(xì)胞倍性分析，可清楚看腫瘤細(xì)胞的非整倍體分析二倍體異倍體四倍體正常細(xì)胞DNA量相同，癌變細(xì)胞的DNA指數(shù)發(fā)生變化，非整倍體出現(xiàn)概率很高。用流式DNA峰圖鑒別細(xì)胞的倍體在病理學(xué)上是一種快速、直接的檢測(cè)方法。74腫瘤細(xì)胞的非整倍體分析二倍體異倍體四倍體正常細(xì)胞DNA量相同植物倍體的分析植物細(xì)胞的倍體非常復(fù)雜，常以多倍體形式存在。檢測(cè)時(shí)多采用對(duì)數(shù)形式。植物的倍性鑒定是多倍體研究的重要內(nèi)容之一。流式細(xì)胞術(shù)已應(yīng)用于玉米、向日葵、甘薯、木薯、獼猴桃、葡萄、棉花和李子的倍性鑒定。這將有利于果樹和農(nóng)作物的培植和育種。75植物倍體的分析植物細(xì)胞的倍體非常復(fù)雜，常以多倍體形式存在。3細(xì)胞凋亡凋亡后期，細(xì)胞膜通透性增大，DNA降解，降解產(chǎn)生的DNA核小體片段從細(xì)胞中釋放，因此，凋亡細(xì)胞比活細(xì)胞含有更少的DNA。凋亡細(xì)胞的DNA峰會(huì)出現(xiàn)在正常細(xì)胞G0/G1峰之前，稱為sub-G1峰。Sub-G1峰的出現(xiàn)被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之一。76細(xì)胞凋亡凋亡后期，細(xì)胞膜通透性增大，DNA降解，降解產(chǎn)生的D腫瘤細(xì)胞凋亡檢測(cè)77方法：Jurkat細(xì)胞分別用DMSO（對(duì)照；<2%）或HU-331（一種誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的大麻素；CaymanChemicalCompany）處理6小時(shí)。然后用AccuriCellCyclePhaseDeterminationKit(KR-300)固定細(xì)胞并染色。腫瘤細(xì)胞凋亡檢測(cè)33方法：Jurkat細(xì)胞分別用DMSO（對(duì)細(xì)胞凋亡-AnnexinⅤ/PI雙標(biāo)記法細(xì)胞凋亡時(shí)會(huì)發(fā)生一系列形態(tài)學(xué)改變。質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine,PS）重新分布，由胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到胞膜外側(cè)，可以通過膜聯(lián)蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）來檢測(cè)。為了區(qū)分凋亡和壞死兩種不同情況下的PS外翻，AnnexinⅤ常與鑒定細(xì)胞死活的染料（PI或7-AAD）聯(lián)合使用。細(xì)胞凋亡的PS與AnnexinⅤ結(jié)合，呈AnnexinⅤ陽性，同時(shí)凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜是完整的，PI不能進(jìn)入，因此，凋亡細(xì)胞是AnnexinⅤ+/PI-。死細(xì)胞的PS與AnnexinⅤ結(jié)合也呈陽性，但死細(xì)胞的膜已經(jīng)破裂，PI能夠進(jìn)入，所以死細(xì)胞是AnnexinⅤ+/PI+。78細(xì)胞凋亡-AnnexinⅤ/PI雙標(biāo)記法細(xì)胞凋亡時(shí)會(huì)發(fā)生一FITCAnnexinV/PI染色和流式細(xì)胞儀分析。Jurkat細(xì)胞（人T細(xì)胞白血?。┯?μM的喜樹堿或0.1%DMSO（陰性對(duì)照）4小時(shí)，引導(dǎo)凋亡。細(xì)胞根據(jù)AnnexinV-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒的染色指南，用FITCAnnexinV和碘化丙啶（PI）染色。與DMSO對(duì)照組相比，喜樹堿處理會(huì)增加細(xì)胞的早期凋亡（PI陰性，AnnexinV陽性），即圖中綠色部分。死細(xì)胞（PI陽性，紅色部分）和活細(xì)胞（AnnexinV和PI陰性，黑色部分）群體很容易辨別。圖中的數(shù)據(jù)來自BDAccuri