辛酸-硫酸銨法純化單克隆抗體

辛酸-硫酸銨法純化單克隆抗體辛酸-硫酸銨法純化單克隆抗體辛酸-硫酸銨法純化單克隆抗體辛酸-硫酸銨法純化單克隆抗體編制僅供參考審核批準(zhǔn)生效日期地址：電話：傳真:郵編:辛酸-硫酸銨法純化單克隆抗體

辛酸-硫酸銨法純化單克隆抗體(一)原理蛋白質(zhì)在溶液中的溶解度取決于蛋白質(zhì)周圍親水基團(tuán)與水形成水化膜的程度,以及蛋白質(zhì)分子帶有的電荷。如改變這兩個因素,蛋白質(zhì)就容易沉淀折出。引起蛋白質(zhì)沉淀的主要方法有(1)鹽析,即加入大量中性鹽破壞蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性而使其析出,沉淀不同蛋白質(zhì)所需鹽濃度及pH值不同;(2)生物堿以及某些酸類,在pH值小于等電點(diǎn)時可以與蛋白質(zhì)形成不溶的鹽使其沉淀;(3)重金屬離子如隸、鉛、銅、銀等,在pH值大于等電點(diǎn)時可以與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶的鹽使其沉淀;(4)有機(jī)溶劑如酒精、甲醇、丙酮等,對水的親和力很大,能破壞蛋白質(zhì)水化膜,在等電點(diǎn)時使蛋白質(zhì)沉淀。辛酸(caprylicacid)在偏酸條件下能與血清或腹水中除IgG外的其他蛋白質(zhì)結(jié)合并將其沉淀下來,IgG則溶于上清液中,再用硫酸鍍鹽析,即可達(dá)到純化IgG的目的。辛酸-硫酸銨法是目前實(shí)驗(yàn)室中較常用的純化單克隆抗體的方法,利用該方法純化單克隆抗體,回收率和純度都可達(dá)80%以上。(二)試劑和器材1.試劑(1)小鼠腹水。(2)硫酸銨或飽和硫酸銨溶液。稱(NH4)2S04(AR)400~425克,以50℃~80℃蒸館水500ml溶解,攪拌2Omin,趁熱過濾。冷卻后以濃氨水(15MNH40H)調(diào)pH值至。配制好的飽和硫酸銨,瓶底應(yīng)有結(jié)晶析出。(3)pH醋酸鹽緩沖液。貯存液:A液,NaAc:無水加蒸館水至100mlB液,HAc:冰醋酸加蒸館水至100ml應(yīng)用液:取上述A液59ml與B液41ml昆合,用5MNaOH調(diào)pH值至.(4)pH磷酸鹽緩沖液(PBS).取Na2HP04·12H20,KH2P04,加蒸館水至100Om1(5)含137mMNaClKClEDTA的pH磷酸鹽緩沖液(PBS):取Na2HP0412H20KH2P04NaC1、KClEDTA,加蒸館水至100Oml2.器材普通冰箱、低溫離心機(jī)、電磁攪拌器,紫外分光光度計、天平;透析袋、塑料夾、精密pH試紙;燒杯、量桶、吸管、滴管、小瓶等。（三)操作步驟方案一(硫酸銨沉淀法)1.腹水4℃12000rpm離心15min,去除雜質(zhì)。2.取1份腹水與2份醋酸鹽緩沖液混合,室溫攪拌下逐滴加入正辛酸33μl/ml腹水。3.室溫混合30min4.4℃靜置2h以上,使其充分沉淀。5.4℃,12000rpm離心3Omin,棄沉淀。6.上清經(jīng)砂芯漏斗或125μm的尼龍網(wǎng)過濾后,加入1/10體積的pHPbs,用2MNaOH調(diào)pH值至.7.冰浴下于30min內(nèi)加入ml的硫酸銨,使成45％飽和度。8.4℃靜置1h以上。9.4℃,10000rpm離心30min,棄上清。10.沉淀用適量含137mMNaC1、KCl、EDTA的pHPBS溶解,于50~100倍體積的上述PBS中4℃透析過夜。11.取少量透析后樣品適當(dāng)稀釋后,以紫外分光光度計檢測蛋白含量,SDSPAGE檢測抗體純度。方案二(飽和硫酸銨溶液沉淀法)1~5同方案一。6.上清經(jīng)砂芯漏斗或125μm的尼龍網(wǎng)過濾后,于50倍體積的PBS中4℃透析6h7.在透析后的上清中加入等體積飽和硫酸銨溶液。8.4℃靜置1h以上0℃,10000rpm離心3Omin,棄上清。10.沉淀用適量含137mMNaCl、KC1、EDTA的溶解,于50~100倍體積的上述PBS中4℃透析過夜。11.取少量透析后樣品適當(dāng)稀釋后,以紫外分光光度計檢測蛋白含量,SDSPAGE檢測抗體純度。(四)注意事項(xiàng)1.無論是含有單克隆抗體的腹水還是細(xì)胞培養(yǎng)上清,均含有脂蛋白、脂質(zhì)、細(xì)胞碎片等雜質(zhì),必須預(yù)先去除。通常采用過濾的方法去除脂質(zhì)和大的顆粒,用離心的方法去除細(xì)胞碎片和大的蛋白聚合物;如果材料里含有大量脂質(zhì),還必須用二氧化硅粉或玻璃纖維吸附等將其去除。2.鹽析時,溶液中的蛋白濃度對沉淀有雙重影響。蛋白濃度愈高,沉淀所需的鹽飽和度極限愈低,但雜蛋白的共沉作用也隨之增加。因此,在鹽析時血清和腹水都應(yīng)作適當(dāng)稀釋,一般血清作倍比稀釋,腹水作2倍稀釋。3.辛酸-硫酸銨法還可以用來純化血清中的抗體,此時辛酸用量因抗體來源不同而稍有變化,人血清為70μ/ml,兔血清為75μ/ml,小鼠血清為40μ/ml。值對鹽析的影響:抗體的溶解度與pH值和鹽濃度有密切關(guān)系,選擇適當(dāng)?shù)膒H值可大大提高對單克隆抗體的沉淀效果。通常溶液的pH值與目標(biāo)蛋白的等電點(diǎn)相等時,沉淀效果最好,另外,硫酸銨在水中顯酸性,為防止對蛋白質(zhì)的破壞,應(yīng)將溶液的pH值調(diào)至中性。5.該法