分子生物學(xué)教程課件

核酸的生物化學(xué)

核酸是一類生物信息高分子化合物。核酸自它首次被從細(xì)胞中分離出來(lái)，經(jīng)歷了大約100年的歷史，直至20世紀(jì)中期以后科學(xué)家們對(duì)核酸結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識(shí)才取得了飛躍的發(fā)展。1953年Watson和Crick提出了脫氧核糖核酸（DNA）雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，極大地推動(dòng)了核酸生物化學(xué)、分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)各類生命學(xué)科的發(fā)展。這些學(xué)科的發(fā)展為未來(lái)醫(yī)學(xué)和工農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)革命奠定了基礎(chǔ)。例如，近年來(lái)迅速興起的分子生物學(xué)及其領(lǐng)域內(nèi)的各項(xiàng)技術(shù)，如基因工程等正是在現(xiàn)代生物化學(xué)（核酸和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究）基礎(chǔ)上發(fā)生和發(fā)展的，分子生物學(xué)的崛起為人類揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)、健康與疾病的關(guān)系，為未來(lái)分子醫(yī)學(xué)和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展提供了嶄新的技術(shù)手段，并為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展開(kāi)辟了新的領(lǐng)域。

這就是基因表達(dá)?；虮磉_(dá)是在復(fù)雜機(jī)制控制下進(jìn)行的，基因表達(dá)調(diào)控已成為當(dāng)前生命科學(xué)研究的熱門(mén)領(lǐng)域。由于篇幅所限，本章只介紹與核酸生物化學(xué)直接相關(guān)的內(nèi)容，包括核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其合成代謝（復(fù)制和轉(zhuǎn)錄），關(guān)于蛋白質(zhì)翻譯及基因表達(dá)調(diào)控內(nèi)容不在此討論。第一節(jié)核酸概述

一、核酸的發(fā)現(xiàn)

1869年瑞士青年學(xué)者FriedrickMiescher首次從膿細(xì)胞核中分離出一種含磷化合物，并命名為“核素”(nuclein)。后來(lái)證明“核素”屬酸性化合物，故更名“核酸”（nucleicacid）。20世紀(jì)頭十年研究揭示，核酸和蛋白質(zhì)一樣也是多聚化合物，核苷酸（nucleotide）是組成核酸的單體。因此，核酸又稱為多聚核苷酸(polynucleotide)。核酸是動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的共同組成成分，甚至比單細(xì)胞還小的病毒顆粒都含有核酸。在真核生物中，核酸在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)共同存在。以前認(rèn)為，細(xì)胞間質(zhì)或細(xì)胞外液中沒(méi)有核酸存在，但近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外液（包括血漿）也有少量寡聚核苷酸存在。無(wú)論是存在于真核還是原核細(xì)胞中的核酸，只有小部分以游離狀態(tài)存在，大部分與蛋白質(zhì)或氨基酸結(jié)合成復(fù)合物；至于無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的病毒，則是由核酸和蛋白質(zhì)組成的核蛋白顆粒。只是病毒不同，所含核酸不同。

在真核細(xì)胞，98%以上的DNA與組蛋白組成染色質(zhì)，存在于細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的DNA主要存在于線粒體中，RNA則僅10%存在于細(xì)胞核，90%存在于細(xì)胞質(zhì)中。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和功能不同，RNA又可分為核糖體RNA（ribosomalRNA,rRNA）、信使RNA（messengerRNA,mRNA)和運(yùn)轉(zhuǎn)RNA(transterRNA,tRNA)三種主要類型和其它類型和其它種類RNA（如小核RNA）。

三、核酸的功能

遺傳是生物界的普遍現(xiàn)象和生命的基本特征之一。繼20世紀(jì)30年代FrederickGriffith發(fā)現(xiàn)“轉(zhuǎn)化”現(xiàn)象，1944年OswaldAcery及其同事首次證明，基因（gene）就是由只有轉(zhuǎn)化功能的DNA組成。1952年，AlfredHershey和MarthaChase采用同位素示蹤的技術(shù)直接證明了Avery等的發(fā)現(xiàn)—DNA是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)。第二節(jié)核酸的分子組成

一、元素組成

核酸（DNA和RNA）分子除含有C、H、O、N四種元素外，還含有大量P，P的含量約為9%~10%。由于各種核酸分子中的P含量比較接近或恒定，故在測(cè)定組織中的核酸含量時(shí)通過(guò)測(cè)定P的含量來(lái)計(jì)算生物組織核酸的含量。

二、核酸的基本結(jié)構(gòu)單位——核苷酸

將核酸逐步水解，可得到多種產(chǎn)物。首先得到的是單核苷酸（nucleotide），后者可進(jìn)一步水解成核苷（nucleoside）和磷酸，核苷還可以水解成戊糖（核糖和脫氧核糖）和含氮堿（嘌呤堿和嘧啶堿）基?，F(xiàn)將兩類核酸水解的主要最終產(chǎn)物列于表P3。

(一)含氮堿

核酸分子中的堿基為嘌呤堿（purine）和嘧啶堿（pyrimcidine）的衍生物。核酸分子中的嘌呤堿主要是腺嘌呤（adenine,A）和鳥(niǎo)嘌呤（puanine,G）兩種。核酸中的嘧啶堿主要是胞嘧啶（cytosine,C）、尿嘧啶（uracil,U）和胸腺嘧啶（thymine,T）三種。T主要存在DNA分子中，U則只存在RNA分子中。兩類核酸所含有的嘌呤類和嘧啶類化合物的結(jié)構(gòu)式及數(shù)字標(biāo)號(hào)如圖1-1所示

嘌呤和嘧啶均可發(fā)生酮—醇式互變異結(jié)構(gòu)現(xiàn)象，生理PH環(huán)境下以酮式為主。兩類堿基中均含有共軛雙鍵，故對(duì)250~280nm紫外線有較強(qiáng)的吸收作用，在260nm吸收最強(qiáng)。

核酸分子中除常見(jiàn)的A、G、C、U和T等堿基外，在某些RNA分子、特別是tRNA中還含有少量其它堿基，稱為“稀有堿基”或“微量堿基”，如甲基腺嘌呤、甲基鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤和二氫尿嘧啶等

(三)核苷

堿基與戊糖縮合后生成的化合物為核苷。嘌呤N—9與核糖C—1，，以糖苷鍵相連，形成嘌呤核苷，如腺嘌呤苷（adenosine,AR）和鳥(niǎo)嘌呤苷（guanosine,GR）。嘧啶N—1與核糖C—1，，以糖苷鍵相連，形成嘧啶核苷，如尿嘧啶苷（uridinge,UR）和胞嘧啶苷（cytidine,CR）。嘌呤或嘧啶在同樣部位、同樣方式與脫氧核糖以N —C糖苷鍵連接形成各種脫氧核苷，如脫氧腺苷（deoxyadenosine,AdR）和脫氧胸苷（deoxythimidine,TdR）等，圖1-3是部分核苷的結(jié)構(gòu)。

由“稀有堿基”形成的核苷稱“稀有核苷”，如次黃嘌呤苷等。還有一種假尿嘧啶苷（pseudouridine,Ф）是尿嘧啶C—5與核糖C—1，，以C—C糖苷鍵連接而成。

現(xiàn)擇幾種核苷酸的結(jié)構(gòu)式列于圖

５’核苷酸組成方式為堿基—核糖—磷酸，稱一磷酸核苷或核苷一磷酸（nucleosidemonophosphate,NMP），如一磷酸腺苷（AMP）、一磷酸鳥(niǎo)苷（GMP）、一磷酸胞苷（CMP）和一磷酸尿苷（UMP）等，如果5，—核苷酸中的戊糖被脫氧核糖取代，組成方式為堿基—脫氧核糖—磷酸，那么在核苷酸命名時(shí)在核苷名稱前面加上“脫氧”二字，如一磷酸脫氧腺苷（dAMP）、一磷酸脫氧鳥(niǎo)苷（dGMP）、一磷酸脫氧胞苷（dCMP）和一磷酸（脫氧）胸苷（dTMP或TMP）。核糖核苷酸呈構(gòu)成RNA的基本單位，脫氧核糖核苷酸是構(gòu)成DNA的基本單位。

一磷酸核苷除組成核酸外，在體內(nèi)也有以游離形式存在的，此外，體內(nèi)還有多磷酸核苷酸，如二磷酸核苷（NDP）和二磷酸脫氧核苷（dNDP），三磷酸核苷（NTP）和三磷酸脫氧核苷（dNTP）?，F(xiàn)以腺苷和脫氧腺苷為例，表示其多磷酸化合物結(jié)構(gòu)圖。

第三節(jié)核酸的分子結(jié)構(gòu)

一、核酸中核苷酸的連接

單核苷酸通過(guò)3，、5，磷酸二酯鍵，即一個(gè)單核苷酸的戊糖C—5，上的磷酸以磷脂鍵與另一核苷酸戊糖的C—3，相連，形成多聚核苷酸鏈（polynucleotide），其結(jié)構(gòu)如圖所示

在多聚核苷酸鏈中，鏈的骨架由戊糖基和磷酸基構(gòu)成。核苷酸鏈一端核苷酸戊糖的5，磷酸不再與其它核苷酸相連，稱為5，磷酸端，或5，末端。同樣核苷酸鏈一端核苷酸戊糖3，羥基也是游離的，稱為3，羥基端，或3，末端。因此，核苷酸鏈?zhǔn)怯蟹较蛐缘?。DNA分子是由方向相反、堿基互補(bǔ)的兩條多核苷酸鏈組成，RNA分子則是由一條多核苷酸鏈組成，因此，核酸分子也是有方向性的。

核酸分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)就是指多核苷酸鏈中從5，端到3，端核苷酸的排列順序，通常稱核苷酸序列（sequence）。DNA分子由兩條多核苷酸鏈組成，通常文獻(xiàn)公布的DNA序列往往是編碼鏈(codingstrand)，即與模板鏈（templatestrand）互補(bǔ)的多核苷酸鏈的序列。表示一個(gè)核酸或多核苷酸序列的方法有很多種。二、DNA分子結(jié)構(gòu)

DNA分子巨大，含核苷酸數(shù)量極多，要分離完整的DNA分子并測(cè)定（+）其一級(jí)結(jié)構(gòu)的全部核苷酸序列極其困難。由于生物遺傳信息儲(chǔ)存于DNA的核苷酸序列之中，如果能搞清楚各種生物體的DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，人們對(duì)生命活動(dòng)本質(zhì)的認(rèn)識(shí)將大大前進(jìn)一步。近年來(lái)由于重組DNA工藝學(xué)（recombinantDNAtechnology）的發(fā)展和人類基因組規(guī)劃（humangenomeproject）的實(shí)施，目前已分離出上萬(wàn)個(gè)基因（DNA片段）和編碼序列的分子克?。―NA和cDNA克?。?，并完成其序列分析。

(一)DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)

組成DNA的核苷酸只有dAMP、dGMP、dCMP和dTMP四種。DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)就是指DNA的多聚核苷酸鏈中脫氧核糖核苷酸的排列順序。

DNA的堿基組成DNA由4種主要的堿基A、G、C和T組成。個(gè)別來(lái)源的DNA分子含有少量堿基。20世紀(jì)50年代初，ErwinChargaff對(duì)多種來(lái)源的DNA堿基組成進(jìn)行了定量分析，發(fā)現(xiàn)如下歸律。

１、所有DNA分子小，腺嘌呤與胸腺嘧啶的分子數(shù)相等，鳥(niǎo)嘌呤與胞嘧啶的分子數(shù)相等，即[A]=[T]，[G]=[C]。由此可引出下述規(guī)律：

（1）[A]/[T]=[G]/[C]

（2）[A]+[G]=[T]+[C]

（3）[A]+[C]=[T]+[G]

２、DNA的堿基組成具有種屬特異性，即不同生物種屬的DNA具有各自特異的堿基組成。如人、牛、鼠和大腸桿菌的DNA堿基組成不完全一樣。

３、DNA的堿基組成無(wú)組織或器官特異性，即同一生物的各種組織或器官的DNA堿基組成相同。

４、生物體內(nèi)的堿基組成不受年齡、生長(zhǎng)狀況、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和環(huán)境條件等的影響。這就是說(shuō)，每種生物的DNA堿基組成特異性只與生物遺傳有關(guān)。

上述DNA堿基組成特點(diǎn)稱為Chargaff法則。這個(gè)自然法則不但對(duì)我們認(rèn)識(shí)生物的系統(tǒng)發(fā)生和進(jìn)化過(guò)程，而且對(duì)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的提出均具有指導(dǎo)意義。

(二)DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)

1953年，JamesWatson和FrancisCrick根據(jù)Chargaff法則和RosalindFranklin,MauriceWilkins關(guān)于DNA的X線衍射分析結(jié)果,提出了DNA雙螺旋模型,這就是DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu).DAN雙螺旋模型結(jié)構(gòu)的要點(diǎn)如下:

１、在DNA分子中,兩股DNA鏈圍繞一假象的共同軸心形成一右手雙螺旋結(jié)構(gòu),雙螺旋的螺距為3.4nm,直徑為2.0nm.螺旋每上升一圈約含10個(gè)堿基對(duì)(basepair,bp)。

２、鏈的骨架由交替出現(xiàn)的、親水脫氧核糖基和磷酸基構(gòu)成，位于雙螺旋的外側(cè)。

３、堿基位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，兩股鏈中的嘌呤和嘧啶堿基以其疏水、近乎平面的環(huán)形結(jié)構(gòu)彼此密切接近，堿基平面與雙螺旋的長(zhǎng)軸垂直。一股鏈中的嘌呤堿基與另一股鏈中位于同一平面的嘧啶堿基之間相互成對(duì)、并以氫鍵相連。堿基對(duì)總是A—T，G—C配伍，前者間形成兩個(gè)氫鍵，后者間形成三個(gè)氫鍵。這種堿基配對(duì)（basepairing）又稱堿基互補(bǔ)，具有堿基互補(bǔ)的多核苷酸鏈則為互補(bǔ)鏈。

４、DNA雙螺旋中的兩股鏈走行是反平行的，即一股鏈?zhǔn)?，—3，、另一股鏈則是3，—5，走向。兩股鏈之間在空間上形成一條大溝和一條小溝。

Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)屬B型雙螺旋結(jié)構(gòu)，它隨機(jī)序列DNA分子在水性環(huán)境和生理?xiàng)l件下最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。除B型結(jié)構(gòu)外，還發(fā)現(xiàn)A型和Z型雙螺旋結(jié)構(gòu)，后兩型雙螺旋結(jié)構(gòu)與B型雙螺旋結(jié)構(gòu)的主要特征基本相同，如兩股鏈互補(bǔ)、走向相反和堿基配對(duì)等。

(三)DAN三級(jí)結(jié)構(gòu)

DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)是指雙螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)一步盤(pán)旋或扭曲所形成的構(gòu)象。雙螺旋多數(shù)為線形，也有為環(huán)形的。環(huán)形DNA分子可進(jìn)一步扭曲形成超螺旋（supercoil）.

環(huán)形DNA分子見(jiàn)于細(xì)菌的基因組DNA（genomicDNA），以及真核生物的線粒體和葉綠體DNA。非環(huán)形DNA分子在一定條件下局部也可形成這種超螺旋三級(jí)結(jié)構(gòu)。DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的另一種形式見(jiàn)于真核細(xì)胞的基因組DNA。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)由DNA與一組為組蛋白（histone）的蛋白質(zhì)共同構(gòu)成所謂的核小體(nucleosome)。在核小體中，由組蛋白H2A、H2B、H3和H4各兩分子組成核小體的核心顆粒，DNA雙螺旋纏繞其上1又3/4圈，跨長(zhǎng)約有146個(gè)堿基對(duì)；組蛋白H1與數(shù)十個(gè)堿基對(duì)的NDA片段形成連接區(qū)。由核心顆粒與連接區(qū)構(gòu)成的核小體彼此串聯(lián)，沿染色質(zhì)纖維的縱軸排列成串珠狀結(jié)構(gòu)。這種串珠狀結(jié)構(gòu)再進(jìn)一步卷曲，形成超螺旋筒結(jié)構(gòu)，即染色質(zhì)纖維。染色質(zhì)纖維進(jìn)一步折疊，形成染色（單）體?？梢?jiàn)，染色單體是由一條連續(xù)的DNA分子的長(zhǎng)鏈經(jīng)過(guò)逐級(jí)盤(pán)旋折疊而形成的。

三、RNA的分子結(jié)構(gòu)

與DNA不同，RNA的基本組成單位是AMP、GMP、CMP和UMP。有的核苷酸含有稀有堿基，如假尿嘧啶和甲基化堿基等。除少數(shù)病毒外，RNA分子均為單鏈結(jié)構(gòu)，但局部區(qū)域由于自身回折，遇有互補(bǔ)結(jié)構(gòu)時(shí)也可形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，雙鏈部位的堿基也是通過(guò)氫間相互配對(duì)，即A—U、G—C配對(duì)；不參加配對(duì)的堿基所在的單鏈則被排斥在雙鏈之外，形成環(huán)形突起。

（一）核糖體RNA的結(jié)構(gòu)

核糖體RNA（）參與蛋白質(zhì)合成機(jī)器—核糖體的組成。核糖體由大小亞基組成，真核生物核糖體小亞基只含有一種rRNA,即18SrRNA、大亞基中含右28S、5.8S和5S三種rRNA，rRNA與蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定構(gòu)象核糖體，參與蛋白質(zhì)生物合成。RRNA有特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在各種生物核蛋白體小亞基中的rRNA具有相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)分布。

（二）信使RNA結(jié)構(gòu)

遺傳信息從DNA分子抄錄到RNA分子的過(guò)程成為轉(zhuǎn)錄（transcription）。在真核生物中，最初轉(zhuǎn)錄牲畜的RNA稱為非均一核RNA（beterogenousnuclearRNA,hnRNA），它是信使（messengerRNA,mRNA）未成熟前體。mRNA前體經(jīng)過(guò)加工過(guò)程（processing）,變成熟mRNA。成熟的mRNA分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是，絕大多數(shù)真核mRNA的3，末端有一段多聚腺苷酸（polyA）其長(zhǎng)度為30-200個(gè)腺苷酸，稱為mRNA的“尾”；在mRNA分子的5，端接有7—甲基鳥(niǎo)嘌呤核苷—3，—三磷酸（m7Gppp），這種結(jié)構(gòu)稱為“帽”。在mRNA分子中有編碼區(qū)和非編碼區(qū)。編碼區(qū)的核苷酸序列中相鄰的三個(gè)核苷酸組成一個(gè)為氨基酸編碼的三聯(lián)體密碼（codon），這些三聯(lián)體密碼決定蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。非編碼區(qū)與蛋白質(zhì)生物合成的調(diào)空有關(guān)。

（三）轉(zhuǎn)運(yùn)RNA結(jié)構(gòu)

轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transterRNA,tRNA）分子較小，一般長(zhǎng)度為70~120個(gè)核苷酸。tRNA有數(shù)十種，各可攜帶一種特異氨基酸，將其轉(zhuǎn)運(yùn)到核糖體，供作蛋白質(zhì)生物合成的原料。各種tRNA無(wú)論在一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)上均有一些共同特點(diǎn)。例如在一級(jí)結(jié)構(gòu)上tRNA含有大量稀有堿基，如甲基化的嘌呤mA、mG等，雙氫尿嘧啶（DHU）、次黃嘌呤（Ⅰ）等；此外，tRNA還含有一些稀有核苷，如胸腺嘧啶核糖核苷、假尿嘧啶核苷（ψ）等。雖然各個(gè)tRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)互不相同，但它們均有三葉草樣的二級(jí)結(jié)構(gòu)。由于分子內(nèi)有較多的雙螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)，故三葉草樣結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。三葉草結(jié)構(gòu)具有下達(dá)特點(diǎn)圖。

１、氨基酸臂由數(shù)個(gè)堿基對(duì)組成。所有tRNA的3，末端均含有相同的CCA—OH結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可與活化的氨基酸結(jié)合。

２、DHU環(huán)又稱D環(huán)，從5，末端起的第一個(gè)環(huán)因含有二氫尿嘧啶，故而得名。

３、反密碼環(huán)其環(huán)頂部的連續(xù)三個(gè)堿基可與mRNA中的三聯(lián)體密碼子形成堿基互補(bǔ)配對(duì)，構(gòu)成所謂的反密碼子（），在蛋白質(zhì)合成中起解讀密碼子、將對(duì)應(yīng)氨基酸引入合成位點(diǎn)的作用。次黃嘌呤（Ⅰ）常出現(xiàn)在反密碼環(huán)中。

４、TΦC環(huán)以含胸腺嘧啶核苷和假尿嘧啶核苷為特征。

５、可變環(huán)在反密碼環(huán)和TΦC環(huán)之間有一個(gè)攀，含數(shù)個(gè)乃至二十多個(gè)核苷酸。不同的tRNA分類的標(biāo)志。

所有tRNA都有明確的、相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)形式—倒“L”型，其中3，端含CCA—OH的氨基酸臂位于倒L型的一端，反密碼環(huán)位于另一端，DHU環(huán)和TΦC環(huán)在空間上相互接近，構(gòu)成“L”型的拐角。所有tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)均呈現(xiàn)L型，提示這種空間構(gòu)象與tRNA功能有關(guān)。

（四）其他RNA

小核RNA（smallnuclearRNA,snRNA）存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，是一類稱為小核核糖體復(fù)合體的組成成分，有u1、u2、u3、u4、u5和u6snRNA等，均為小分子核糖核酸，含約有106—189個(gè)核苷酸，其功能是在huRNA加工轉(zhuǎn)變?yōu)閙RNA的過(guò)程參與RNA的剪接，并在mRNA從細(xì)胞核向細(xì)胞漿中，是蛋白質(zhì)在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上定位合成所需要的信號(hào)識(shí)別的組成成分。

小胞漿RNA(smallcytosolRNA,scRNA)又稱7SLRNA，長(zhǎng)約300個(gè)核苷酸，主要存在于細(xì)胞漿中，是蛋白質(zhì)在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上定位合成所需要的信號(hào)識(shí)別體的組成成分。第四節(jié)核酸的理化性質(zhì)

一、核酸的酸堿性質(zhì)

無(wú)論是DNA還是RNA，在其多核苷酸鏈內(nèi)既有酸性的磷酸基又有堿性的含氮雜環(huán)堿，因此核酸與蛋白質(zhì)一樣，也是兩性電解質(zhì)。因磷酸基的酸性較強(qiáng)，故通常核酸表現(xiàn)為酸性。在中性或堿性溶液中，核酸帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向陽(yáng)極移動(dòng)。利用核酸這一性質(zhì)?？蓪⒎肿恿看笮〔煌暮怂岱蛛x。

帶負(fù)電荷的核酸可與金屬離子成鹽。當(dāng)向核酸溶液中加入適當(dāng)鹽溶液后，帶正電荷的金屬離子即可將核酸的負(fù)離子中和，在有乙醇或異丙醇存在時(shí)核酸即可從溶液中沉淀析出。制備核酸時(shí)常用的鹽溶液有氯化鈉、醋酸鈉、醋酸鉀或醋酸銨。

二、核酸的高分子性質(zhì)

核酸是分子量很大的高分子化合物，因此核酸溶液具有較大的粘性。高分子溶液的粘性與溶液分子的不對(duì)稱性有關(guān)，分子不對(duì)稱性愈大，其粘度也就愈大，不規(guī)則分子比球形分子溶液的粘度大，線性分子溶液的粘度的更大。DNA分子的長(zhǎng)度與其直徑之比可達(dá)107，因此即使極稀的DNA溶液也有較大的粘度。RNA溶液的粘度較DNA小。當(dāng)核酸溶液受熱或酸堿等因素作用下發(fā)生變性時(shí)，分子長(zhǎng)度與直徑比例減小，分子不對(duì)稱性變小，溶液粘度下降。粘度測(cè)定可用作DNA變性的指標(biāo)。

不同種類核酸分子的大小不同。核酸分子大小表示方法有以下幾種：即千道爾頓（kD）、堿基對(duì)（bp）或千堿基對(duì)（kb）數(shù)目、離心沉降常數(shù)（s）。離心沉降常數(shù)是利用高分子的核酸分子大小不同，分子形狀不同，在超離心力場(chǎng)作用下的沉降行為也各不相同而測(cè)得。如真核生物核糖體小亞基中含有的rRNA分子大小為18S，大亞基中的rRNA28S、5S和5.8S三種分子。高分子的核酸還表現(xiàn)為特異的凝膠過(guò)濾（如葡聚糖凝膠）洗脫行為，洗脫時(shí)分子量大的先被洗出，分子量小的后洗出。

三、核酸的紫外吸收

由于核酸分子所含的堿基中都有共扼雙鍵，故具有吸收紫外線的性質(zhì)；核酸的最大紫外吸收波長(zhǎng)在260nm而蛋白質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)280nm。利用這一特性可鑒別核酸樣品中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)，對(duì)核酸進(jìn)行定性、定量分子。因?yàn)楹怂岬淖畲笞贤馕帐芊肿又虚g結(jié)構(gòu)影響極大，所以利用這一特性可研究核酸的的變性。

四、核酸的變性和復(fù)性

在極端的pH值和受熱條件下核酸分子中的氫鍵斷裂、雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)，這就是核酸的變性（denaturation）。因?yàn)樽冃詴r(shí)堿基對(duì)之間的氫鍵斷開(kāi)，堆積力也受到破壞，但不拌有共價(jià)鍵的斷裂，所以變性后的核酸在260nm的光吸收增強(qiáng)，稱為高色效應(yīng)（hyperchromiceffect）。在核酸變性中，以DNA變性最多見(jiàn)，由加熱引起的DNA熱變性意義最大。當(dāng)DNA溶液加熱至一定溫度時(shí)，溶液的紫外光吸收開(kāi)始增強(qiáng)；繼續(xù)升溫，光吸收達(dá)到一最大值。由于加熱引起雙螺旋結(jié)構(gòu)解體，所以DNA的熱變性過(guò)程中，紫外光吸收增值達(dá)到最大值50%時(shí)的溫度稱謂核酸的解鏈溫度，又稱融解溫度（meltingtemperature,Tm）。特定核酸的Tm值大小與其分子G+C所占總堿基數(shù)的百分比成正相關(guān)，G+C含量愈高、核酸的Tm值愈大，這是因?yàn)镚—C配對(duì)間有三個(gè)氫鍵，其穩(wěn)定性比A—T配對(duì)更大。在一定條件下，Tm大小還與核酸分子長(zhǎng)度（bp數(shù)目）有關(guān)，分子愈長(zhǎng)，Tm愈大。

在一定條件下核酸的變性是可逆的。熱變性的DNA溶液經(jīng)冷卻，可使解開(kāi)的兩條互補(bǔ)單鏈重新締合而形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，即退火（annealing）。變性核酸經(jīng)退火恢復(fù)原狀的過(guò)程稱變性DNA的復(fù)性。如果將熱變性的DNA溶液聚然冷卻至低溫，則變性的DNA很難復(fù)性。伴隨復(fù)性會(huì)出現(xiàn)核酸溶液紫外光吸收減弱的現(xiàn)象，稱為核酸的低色效應(yīng)（hypochromiceffect）.

核酸分子雜交就是DNA熱變性、復(fù)性原理在分子生物學(xué)中的應(yīng)用。不同來(lái)源的核酸分子變形后合并在一起進(jìn)行復(fù)性，這時(shí)只要這些核酸分子含有可形成堿基互補(bǔ)配對(duì)的片段，彼此之間即可形成局部雙鏈。復(fù)性發(fā)生不同來(lái)源的核酸分子之間，形成所謂雜化雙鏈分子，這一過(guò)程分子雜交（hybridization）。在核酸雜交基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種研究和診斷的新技術(shù)稱為探針技術(shù)。采用一小段已知序列的單鏈（含數(shù)十至數(shù)百個(gè)核苷酸）核酸，經(jīng)同位素或其它發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記其末端或全鏈，即為核酸探針（probe）。在適當(dāng)條件或環(huán)境中與待測(cè)核酸樣品雜交，通過(guò)放射性同位素或發(fā)光物質(zhì)測(cè)定，判斷待測(cè)的核酸分子是否喊有探針同源的核酸序列。探針技術(shù)已廣泛用于分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)基因分析及臨床醫(yī)學(xué)診斷，后者已發(fā)展為一門(mén)獨(dú)立的新型學(xué)科—DNA診斷學(xué)，俗稱基因診斷。第五節(jié)DNA生物合成

一、DNA生物合成的概念

DNA分子在生物體內(nèi)通過(guò)酶促聚合反應(yīng)合成，即DNA的生物合成。DNA的生物合成有DNA指導(dǎo)的DNA合成（DNA—dependentsynthesisof）、RNA指導(dǎo)的DNA合成（RNA—depndentsynthesisofDNA）以及修復(fù)合成三種方式。DNA指導(dǎo)的DNA合成是以DNA為模板，合成新的、與親代模板完全一樣的DNA分子，故稱這種DNA合成為DNA的復(fù)制。它是細(xì)胞內(nèi)DNA合成的最主要方式。RNA指導(dǎo)的DNA合成是以RNA為模板，合成與RNA核苷酸序列一致的DNA分子，因其過(guò)程與遺傳信息流動(dòng)時(shí)的轉(zhuǎn)錄過(guò)程方向相反，故稱反轉(zhuǎn)錄合成。反轉(zhuǎn)錄作用廣泛存在于生物界，在RNA病毒感染宿主的致病過(guò)程有重要意義。在某些物理、化學(xué)或生物學(xué)（病毒）因素可導(dǎo)致DNA分子的損傷，生物體細(xì)胞內(nèi)存在DNA修復(fù)合成體系，可使損傷的DNA分子得以修復(fù)，即修復(fù)合成。

二、DNA的復(fù)制合成

DNA合成進(jìn)行時(shí)，以兩條親代DNA鏈中的每一條鏈為模板，在DNA指導(dǎo)下的DNA聚合酶催化下，按A與T、G與C堿基配對(duì)原則合成子代DNA的過(guò)程稱DNA的復(fù)制（replication）。由于復(fù)制合成的子代DNA兩條脫氧核糖核苷酸鏈中有一條來(lái)自親代DNA，另一條是以前者為模板新合成的子代DNA鏈，所以DNA的這種合成作用又稱半保留復(fù)制（semiconservativereplication）。

（一）復(fù)制的起始點(diǎn)與方向

DNA復(fù)制從分子特定部位開(kāi)始，此特定部位稱為復(fù)制起始點(diǎn)（originofreplication,ori）。在原核生物中復(fù)制起始點(diǎn)常位于染色體的一個(gè)特定部位，即只有一個(gè)ori位點(diǎn)。例如，E.coli染色體是一個(gè)含有4*106堿基對(duì)(basepair,bp)的DNA分子，其中右一段250bp的片段覆蓋復(fù)制起始點(diǎn)oriC。與原核生物不同，真核生物染色體具有多個(gè)ori位點(diǎn)。例如，酵母s.cerevlslae的第17號(hào)染色體中約有400個(gè)拓?fù)洚悩?gòu)位點(diǎn)。在酵母的ori位點(diǎn)中至少有約100—200bp與復(fù)制功能有關(guān)。

DNA分子復(fù)制時(shí)，在親代分子ori位點(diǎn)所在區(qū)域內(nèi)雙鏈打開(kāi)，復(fù)制起始點(diǎn)處呈一叉形或Y形，稱為復(fù)制叉（replicationfok）；隨之以兩股鏈為模板復(fù)制生成兩個(gè)子代DNA雙鏈分子。從ori位點(diǎn)開(kāi)始復(fù)制DNA鏈的延伸方向有三種不同的機(jī)制。其一是從兩個(gè)起始點(diǎn)開(kāi)始，各以相反的單一方向生長(zhǎng)出一條新鏈，形成兩個(gè)復(fù)制叉（如腺病毒DNA的復(fù)制）。其二是從一個(gè)ori位點(diǎn)開(kāi)始，以同一方向生長(zhǎng)出兩條鏈，形成一個(gè)復(fù)制叉（如質(zhì)粒ColEIDNA的復(fù)制）。其三是從一個(gè)ori位點(diǎn)開(kāi)始，沿兩個(gè)相反方向各生長(zhǎng)出兩條鏈，形成兩個(gè)復(fù)制叉、這種方式最常見(jiàn)，因此也是最重要的雙向復(fù)制。

（二）參與復(fù)制的酶類和蛋白因子

DNA的復(fù)制是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，有多種酶類和蛋白質(zhì)因子參與，它們各自起著不同的作用。

１、拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase,Topo）是一類可改變DNA拓?fù)湫再|(zhì)的酶。DNA復(fù)制時(shí)，復(fù)制行進(jìn)的前方DNA分子部分產(chǎn)生有正超螺旋，拓?fù)涿缚伤沙诔菪?，有利于?fù)制叉的行進(jìn)及DNA合成。在復(fù)制完畢后，該酶又可將超螺旋引入DNA分子，有利于DNA的纏繞、折疊以形成染色質(zhì)，DNA拓?fù)涿赣卸喾N，主要有Topo和TopoⅡ兩型，它們廣泛存在于原核生物和真核生物中。TopoⅠ的主要作用是將環(huán)狀雙鏈DNA的一條鏈切開(kāi)一個(gè)切口。切口處的末端饒螺旋軸按照松超螺旋的方向轉(zhuǎn)動(dòng)，然后再將切口密封。TopoⅠ在松超螺旋時(shí)不需ATP參與。E.coli的TopoⅠ在松超螺旋的作用中對(duì)負(fù)超螺旋的作用大于正超螺旋的作用；真核生物的TopoⅠ則對(duì)于去除正超螺旋和負(fù)超螺旋均有作用。除松弛超螺旋作用。TopoⅠ還有對(duì)環(huán)狀單鏈DNA的打結(jié)或解結(jié)作用，對(duì)環(huán)狀雙鏈DNA分子的環(huán)連或結(jié)環(huán)連的作用，以及促使環(huán)狀單鏈DNA形成環(huán)狀雙鏈。

TopoⅡ是在E.coli發(fā)現(xiàn)的。曾被稱為旋轉(zhuǎn)酶（gyrase）它的作用特點(diǎn)是切開(kāi)環(huán)狀雙鏈DNA的兩條鏈，分子中的一部分經(jīng)切口穿過(guò)而旋轉(zhuǎn)，然后封閉切口。TopoⅡ在ATP的參與下，DNA分子從松弛狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋；TopoⅡ還可使DNA分子從超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)樗沙跔顟B(tài)，此反應(yīng)則不需ATP參與。TopoⅡ也有環(huán)連或解環(huán)連以及大結(jié)或解結(jié)的拓?fù)洚悩?gòu)化活性。

２、解鏈酶DNA復(fù)制進(jìn)行時(shí)，首先要在ori處解開(kāi)雙鏈，反應(yīng)是在一類解鏈酶（helicase）的催化進(jìn)行的，該反應(yīng)需ATP的參與。大部分解鏈酶在復(fù)制叉的行進(jìn)中連續(xù)地解開(kāi)雙鏈，他們與隨從鏈（laggingstrand）的模板相結(jié)合，沿著模板的5，—3，方向隨著復(fù)制叉的行進(jìn)而移動(dòng)，例如解鏈酶Ⅱ、Ⅲ等。只有rep蛋白（一種解鏈酶）是結(jié)合在前導(dǎo)鏈（leadingstrand）的摸班上，沿模板的3，—5，方向移動(dòng)。所以在DNA復(fù)制時(shí)，一些解鏈酶和rep蛋白是分別在DNA母鏈上協(xié)同發(fā)揮作用，以解開(kāi)雙鏈。

３、單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)合蛋白(singlestrandbindingprotein,SSB)又稱DNA結(jié)合蛋白(DNAbindingprotein,DBP).它可與單鏈DNA緊密結(jié)合、覆蓋DNA單鏈上7~10個(gè)核苷酸。SSB與解開(kāi)的DNA單鏈相結(jié)合，可穩(wěn)定此單鏈以利于其發(fā)揮模板作用；它也可與新生的單鏈相結(jié)合，保護(hù)其免被核酸酶水解。.

４、引發(fā)酶和引發(fā)前體引發(fā)酶（primase）又稱引物酶，在E.coli中又稱DnaG蛋白。它是一種特殊的RNA聚合酶（RNApolymeraseRNApol），可催化RNA短片段的合成。反應(yīng)是以DNA為模板、氨堿基配對(duì)（A—U/T—A、G—C）規(guī)律、沿5，—3，方向合成RNA片段，稱為RNA引物（primer）。RNA引物的3，末端為—OH。不同生物中RNA引物核苷酸長(zhǎng)短不同，原核生物的較長(zhǎng)，動(dòng)物細(xì)胞中的RNA引物大約由10個(gè)核苷酸組成。引發(fā)酶發(fā)揮其作用還需要其它蛋白因子的促進(jìn)，即需要有引發(fā)前體（preprimosome）的存在。

引發(fā)前體包含有多種蛋白質(zhì)因子。ΦX174DNA復(fù)制時(shí)的引發(fā)前體至少由PriA、PriB、PriC、DnaB、DnaC及DnaT等6種因子組成。在引發(fā)酶的作用下，引發(fā)前體與引發(fā)酶聯(lián)合裝配成引發(fā)體，繼而兩者又可解離。引發(fā)前體沿隨從鏈、順復(fù)制叉的行進(jìn)方向移動(dòng)，與引發(fā)酶連續(xù)、交替地結(jié)合與解離，從而在不同部位引導(dǎo)引發(fā)酶催化合成RNA引物，為在引物的3，—OH末端進(jìn)行DNA片段（岡奇片段）合成準(zhǔn)備了條件。除引發(fā)前體外，E.coliDNA復(fù)制的引發(fā)過(guò)程還需要有DnaA蛋白參與。

５、DNA聚合酶以親代DNA為模板，DNA聚合酶催化四種dNTP通過(guò)與模板鏈的堿基互補(bǔ)配對(duì)，合成子代DNA鏈，故該酶稱作DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶（DNAdirectedDNApolymerase,DDDP），簡(jiǎn)稱DNA聚合酶（DNApolymeraseDNApol）。DNApol催化的反應(yīng)如下：

DNApol不能自行從頭合成DNA鏈，必須有一段多核苷酸鏈作為引物，在此引物的3，—OH端催化dNTP與3，—OH作用，形成3，、5，—磷酸二酯鍵，從而逐步合成ＤＮＡ鏈。由此可見(jiàn)，ＤＮＡ鏈合成是有方向性的，即從5，—3，方向進(jìn)行合成。

無(wú)論在原核細(xì)胞還是真核細(xì)胞中，均存在著多種DNApol，它們的性質(zhì)和功能不完全相同。在E.coli有３種DNApol，其中DNApolⅢ和DNApolⅠ為DNA復(fù)制所必需；在真核細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)有5腫DNA聚合酶，即DNApolα、β、γ、δ和ε。真核生物的DNA復(fù)制是在DNAα和δ互相配合下進(jìn)行的。

６、DNA連接酶因?yàn)閺?fù)制過(guò)程中DNA的合成只能按5，—3，方向進(jìn)行，因此其中有一條新鏈（隨從鏈）的合成是不連續(xù)的，即合成產(chǎn)物先是一些短鏈的DNA片段—岡奇片段。這些片段須在DNA連接酶的催化下，首尾相連，才能成為一條完整的DNA長(zhǎng)鏈。DNA連接酶是催化一段DNA鏈的3，羥基端與另一段DNA鏈的5，磷酸端反應(yīng)、生成3，、5，—磷酸二酯鍵，將兩個(gè)DNA片段共價(jià)連接起來(lái)。

（三）DNA復(fù)制的過(guò)程

DNA復(fù)制的研究最初是在原核生物中進(jìn)行的。真核生物的DNA復(fù)制過(guò)程與原核基本相似，有些機(jī)理尚不十分清楚。根據(jù)目前認(rèn)識(shí)，可將E.coliDNA復(fù)制過(guò)程分為以下階段。

１、螺旋的松弛和解鏈在ori所在起始部位首先起作用的是DNATopo和解鏈酶，它們松弛DNA超螺旋結(jié)構(gòu)，解開(kāi)一段雙鏈，并由SSB保護(hù)和溫度DNA單鏈，形成復(fù)制電。這個(gè)復(fù)制電的形狀象個(gè)叉子，即復(fù)制叉，將模板展示出來(lái)。

２、引物RNA的合成當(dāng)兩股單鏈暴露出足夠數(shù)量的堿基對(duì)時(shí)，DNA復(fù)制即進(jìn)入引發(fā)階段，主要由引發(fā)酶和進(jìn)發(fā)前體參與合成RNA引物。前導(dǎo)鏈的引發(fā)較簡(jiǎn)單，在引發(fā)酶催化下合成一個(gè)短的RNA引物（10~60nt），繼而從DNA引物的3，末端開(kāi)始連續(xù)地進(jìn)行DNA鏈的合成。隨從鏈引物的合成則是在引發(fā)酶和引發(fā)前體以及DnaA蛋白聯(lián)合作用下合成的，繼而在引物的3，—OH端進(jìn)行岡奇片段的合成。

３、DNA鏈的延長(zhǎng)DNA鏈的延長(zhǎng)是在DNApol催化下，以四種三磷酸脫氧核苷（dNTP）即dATP、dGTP、dCTP和drTTP為原料進(jìn)行的聚合反應(yīng)。反應(yīng)體系中有DNA模塊、引物即Mg2+的存在（見(jiàn)前）。聚合作用是自引物的3，—OH端上開(kāi)始，沿DNA5，—3，方向逐個(gè)加入脫氧核苷酸dNMP，而脫下焦磷酸PPi，使DNA鏈得以延長(zhǎng)。復(fù)制時(shí)DNA的兩條均可作為模板，分別合成兩條子代DNA鏈。由于DNA的兩條鏈?zhǔn)欠雌叫械模匆粭l鏈?zhǔn)?，—3，，而另一條鏈?zhǔn)?，—5，方向，但是DNApol催化DNA鏈的合成只能沿著5，—3，方向進(jìn)行，因此解開(kāi)雙鏈后在3，—5，方向的模板是可以順利地按5，—3，方向合成新的DNA鏈，即前導(dǎo)鏈；而以5，—3，方向鏈為模板，仍然按5，—3，方向合成，只能是不連續(xù)的短DNA片段（岡奇片段）。合成岡奇片段的反應(yīng)直到下一個(gè)引物的5，端為止。在原核細(xì)胞中，每個(gè)岡奇片段約含1000~2000個(gè)核苷酸，真核細(xì)胞的約含100~200個(gè)核苷酸。

DNA鏈的延長(zhǎng)速度是很快的，在E.coli中是以每秒500個(gè)脫氧核苷酸聚合速度進(jìn)行的。

４、終止DNA片段合成至一定長(zhǎng)度后，鏈中的RNA引物被核酸酶水解而切掉。此時(shí)出現(xiàn)的缺口由DNA的繼續(xù)延長(zhǎng)而填補(bǔ)，然后由DNA連接酶將這些片段再連接起來(lái)，形成完整的DNA鏈。

DNA復(fù)制完畢后，DNATopo將DNA分子引入超螺旋結(jié)構(gòu)，進(jìn)行進(jìn)一步的裝配。

真核生物DNA的復(fù)制與E.coli基本相似，但是還有一些特點(diǎn)，入真核生物復(fù)制速度約為50nt/s，其ori位點(diǎn)有多個(gè)，岡奇片段的長(zhǎng)度小于原核生物，DNA聚合酶也不同等。對(duì)真核生物DNA復(fù)制過(guò)程的研究，包括復(fù)制的調(diào)節(jié)、復(fù)制與細(xì)胞周期的關(guān)系等尚待進(jìn)一步深入。

三、反轉(zhuǎn)錄合成

反轉(zhuǎn)錄活稱逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）是RNA指導(dǎo)下的DNA合成作用，即以RNA為模板，由dNTP聚合生成DNA的作用。因?yàn)榇薘NA指導(dǎo)的DNA合成作用恰好與轉(zhuǎn)錄（見(jiàn)本章第六節(jié)）作用中遺傳信息的流程呈相反方向進(jìn)行，所以稱為反轉(zhuǎn)錄作用。催化此反應(yīng)的酶為反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）或逆轉(zhuǎn)錄酶。反（逆）轉(zhuǎn)錄酶由HowardTemin和DavidBaltimore在1970年分別從Rous肉瘤病毒（一種能引發(fā)禽類肉瘤的RNA病毒）中發(fā)現(xiàn)，后來(lái)證明各種致癌RNA病毒都有反（逆）轉(zhuǎn)錄酶存在，其作用與這類病毒的致癌性有關(guān)。

反轉(zhuǎn)錄酶具有三種酶活性，即可催化RNA指導(dǎo)DNA合成反應(yīng)、RNA的水解反應(yīng)和DNA指導(dǎo)的DNA聚合反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄合成DNA的過(guò)程首先是以病毒基因組RNA為模板，催化合成一條RNA互補(bǔ)的單鏈DNA（complementaryDNA,cDNA），產(chǎn)物與模板形成DNA—RAN雜交分子。雜交分子中的RNA被水解后，再以單鏈DNA為模板，合成另一條互補(bǔ)DNA鏈，產(chǎn)生雙鏈DNA分子。反轉(zhuǎn)錄酶催化的DNA合成反應(yīng)也是按5，—3，方向進(jìn)行；在DNA開(kāi)始合成時(shí)也需要引物，在引物為存在于病毒顆粒中的tRNA。反轉(zhuǎn)錄新生成的DNA分子中存在原有病毒RNA的信息。一旦反轉(zhuǎn)錄合成的雙鏈互補(bǔ)DNA分子整合到宿主染色體的基因組中，可導(dǎo)致宿主DNA結(jié)構(gòu)和功能變化，致宿主主細(xì)胞發(fā)生癌變。

反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)對(duì)重組DNA技術(shù)的發(fā)展具有重要意義，它被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，催化以mRNA為模板，合成cDNA，繼而構(gòu)建cDNA文庫(kù)(Cdnalibrary),從中篩選出為特異蛋白質(zhì)編碼的核苷酸序列。

反轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）是一類RNA病毒，因含反轉(zhuǎn)錄酶而得名。許多反轉(zhuǎn)錄病毒有致癌作用，即通過(guò)其病毒癌基因（viresoncogene,v-onc）使細(xì)胞癌變。與病毒癌基因類似的基因也存在于脊椎類動(dòng)物的正?；蚪M中，稱為細(xì)胞癌基因（celloncogene,c-noe）。這些癌基因的即或可導(dǎo)致細(xì)胞的癌變。人類免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus,HIV）也是一種反轉(zhuǎn)錄病毒，它感染人和T細(xì)胞，導(dǎo)致人體免疫缺陷，患者因喪失免疫力而死于廣泛的感染。

四、DNA的修復(fù)合成

DNA復(fù)制可能因堿基對(duì)錯(cuò)配而發(fā)生自發(fā)突變；在某些理、化或生物學(xué)因素（如電離輻射、紫外線、化學(xué)誘變劑或致癌變病毒等）作用下，?？梢餌NA鏈的損傷或突變。根據(jù)DNA分子的變化，DNA損傷可有DNA的斷鏈、鏈內(nèi)交聯(lián)和鏈間交鏈等；DNA的突變可分為點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變和置換突變。上述DNA分子結(jié)構(gòu)變化稱DNA損傷(damage)。如果這些DNA的復(fù)制錯(cuò)誤或損傷不被校正，則會(huì)影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能；某些突變可引起生物體的變異。然而，生物體內(nèi)存在著DNA修復(fù)(repair)系統(tǒng)，可保證DNA復(fù)制的高度準(zhǔn)確性和損傷的修復(fù)。盡管如此，DNA的損傷也不能全部修復(fù)，否則就不存在變異，生物也就不能進(jìn)化。

細(xì)胞修復(fù)DNA損傷是通過(guò)一系列酶來(lái)完成的，這些酶可以除去DNA分子上的損傷，恢復(fù)DNA的正常結(jié)構(gòu)。修復(fù)有多種方式，如切除修復(fù)(excisionrepair)、重組修復(fù)(recombinationalrepair)和SOS修復(fù)。下面以切除修復(fù)為例略述如下。切除修復(fù)可分為4個(gè)步驟；由特異的核酸內(nèi)切酶識(shí)別損傷部位，并將損傷的DNA單鏈切斷；在切口處由DNA聚合酶作用，以另一條正常的DNA鏈為模板進(jìn)行修復(fù)合成；在酶的作用下切除損傷的片段；由DNA連接酶將新合成的DNA鏈與原來(lái)的DNA鏈連接而成正常的DNA。第六節(jié)RNA生物合成

一、RNA生物合成的概念

在生物體內(nèi)通過(guò)酶促聚合反應(yīng)合成RNA分子的過(guò)程稱RNA生物合成。同DNA生物合成一樣，RNA的生物合成也有以DNA和RNA為模板兩種方式。以DNA為模板進(jìn)行的聚合反應(yīng)生成與DNA分子的脫氧核苷酸序列一致的RNA分子，這樣儲(chǔ)存于DNA分子的遺傳信息被抄錄到RNA分子上，所以稱這種RNA合成為DNA指導(dǎo)的RNA合成（DNA-dependentsynthesisofRNA）,通常稱轉(zhuǎn)錄(transcription)。以RNA為模板合成與模板RNA一樣的RNA分子稱RNA指導(dǎo)的RNA合成(RNA-dependentsythesisofRNA)，又稱RNA的復(fù)制。轉(zhuǎn)錄作用廣泛在于生物界，RNA復(fù)制見(jiàn)于一些RNA病毒基因組的復(fù)制過(guò)程。

二、轉(zhuǎn)錄體系的組成

RNA合成需要多種成分參與，包括：DNA模板、4種三磷酸核苷酸（NTP）、RNA聚合酶、一些蛋白質(zhì)因子和必要的無(wú)機(jī)離子等，共同組成轉(zhuǎn)錄體系。這里重點(diǎn)介紹DNA模板和RNA聚合酶。

（一）DNA模板

轉(zhuǎn)錄作用需要DNA作為模板，根據(jù)堿基配對(duì)規(guī)律（A—U/T—A、G—C）、按照DNA模板的脫氧核苷酸序列合成相應(yīng)序列的RNA分子。因此模板DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定著RNA結(jié)構(gòu)，從而將DNA儲(chǔ)存的遺傳信息傳遞給RNA（mRNA）。

在體外，DNA的兩條鏈均可分別作模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。但在體內(nèi)，DNA分子中只有一條鏈可以作為模板指導(dǎo)RNA的合成，此鏈稱為模板鏈（templatestrand）；模板鏈的互補(bǔ)鏈因與轉(zhuǎn)錄合成的RNA鏈的核苷酸序列基本相同，只是互補(bǔ)鏈上的T對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)錄本RNA上為U，故稱該鏈為編碼鏈（codingstrand）。由此可見(jiàn)，RNA的轉(zhuǎn)錄是不對(duì)稱的，在一個(gè)包含多個(gè)基因雙鏈分子中，各個(gè)基因的模板鏈并不全在同一個(gè)條鏈上，在某個(gè)基因節(jié)段以這條鏈為模板，而在另一個(gè)基因節(jié)段可能以另一條為模板。

轉(zhuǎn)錄是在DNA模板鏈的特殊部位開(kāi)始的。轉(zhuǎn)錄起始部位稱轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)（transcriptionstartsite,或者initiationsite）。轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)（文獻(xiàn)通常在模板鏈對(duì)應(yīng)的編碼鏈位置標(biāo)以“+1”表示）及其之前（編碼鏈+1位置的3，側(cè)翼序列，通常稱上游序列，用負(fù)數(shù)表示）的一段核苷酸序列是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，稱啟動(dòng)子或啟動(dòng)序列（promoter）。啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)中起重要作用。原核生物和真核生物的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)有相似之處，但又各有特點(diǎn)。從轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)開(kāi)始、編碼鏈+1的位置開(kāi)始向模板鏈的5，方向（編碼鏈的3，方向）進(jìn)行的。

在指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄作用的DNA分子中，除啟動(dòng)子外還有停止轉(zhuǎn)錄作用的部位，稱為終止信號(hào)或終止子（terminator）。轉(zhuǎn)錄到此即終止。此外，在原核基因啟動(dòng)子的上游還有操縱基因和調(diào)節(jié)因等結(jié)構(gòu)，這些調(diào)節(jié)序列與位于啟動(dòng)子下游的、成簇串聯(lián)的編碼序列共同組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位—操縱子（operon）。與原核基因不同，真核生物絕大多數(shù)基因分散在染色體基因組中。每個(gè)編碼基因的上游除有自己的啟動(dòng)子外，還含有增強(qiáng)子（enhancer）和/或抑制子（silencer）調(diào)節(jié)序列，可被特異的蛋白質(zhì)因子識(shí)別并結(jié)合，分別起轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)和轉(zhuǎn)錄抑制作用。啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和抑制子結(jié)構(gòu)中可被特異蛋白質(zhì)因子識(shí)別、結(jié)合的特異DNA序列通常被稱為順式作用元件（cis-actingelements），結(jié)合特異DNA序列的蛋白質(zhì)因子都是一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通常稱為反式作用因子（trans-actingelements）。順式作用元件與反式作用因子的互相作用（DNA—蛋白質(zhì)互相作用）的決定RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合、形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的重要機(jī)制，這方面的研究已經(jīng)成為當(dāng)前分子生物學(xué)的熱門(mén)領(lǐng)域—基因表達(dá)調(diào)控（regulationoggeneexpression）的重要內(nèi)容之一。有關(guān)基因轉(zhuǎn)錄激活的機(jī)制請(qǐng)參見(jiàn)專門(mén)論著，這里不再敘述。

（二）RNA聚合酶

催化轉(zhuǎn)錄作用的BNA聚合酶（RNApolymerase,RNApol）全稱為DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶（DNAdependentRANpolymerase,DDRP）。原核生物RNApol高度保守，在組成和功能上都很相似。E.coli的RNApol全酶由5個(gè)亞基組成，即α2ββ，σ。全酶去除亞基（又稱因子）后，稱為核心酶。因子可辨認(rèn)DNA模板上的啟動(dòng)子，決定轉(zhuǎn)錄特異性。核心酶缺少因子不能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，但可使已開(kāi)始合成的BNA鏈延長(zhǎng)（見(jiàn)合成過(guò)程）。在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)4種RNApol，即RNApolⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Mt，它們專一地轉(zhuǎn)錄不同的基因，催化不同種類的RNA聚合反應(yīng)；它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的定位機(jī)及性質(zhì)也不相同。真核RNApol也是由多種亞基組成。

三、轉(zhuǎn)錄過(guò)程

RNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程可分為三個(gè)階段：起始、延長(zhǎng)和終止?，F(xiàn)對(duì)了解較多的E.coli轉(zhuǎn)錄過(guò)程介紹如下。

（一）起始

首先由σ因子辨認(rèn)DNA的啟動(dòng)子部位，帶動(dòng)RNApol核心酶與啟動(dòng)子結(jié)合，形成復(fù)合物，同時(shí)使DNA分子的局部構(gòu)象改變，結(jié)構(gòu)松弛，解開(kāi)異端DNA雙鏈（約17bp），暴露出DNA模板鏈。前已述及，DNA復(fù)制需要酶的作用對(duì)DNA進(jìn)行解旋、解鏈。轉(zhuǎn)錄時(shí)DNA如何解旋、解鏈？有人認(rèn)為，RNApol可以“擠”入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)之間，同時(shí)起到解鏈的作用，而不需要其它輔助因子。最近研究表明，RNApolⅡ也可能參與轉(zhuǎn)錄過(guò)程，其詳細(xì)作用機(jī)理尚不清楚。當(dāng)DNA模板鏈暴露后，RNApol進(jìn)入轉(zhuǎn)錄泡（DNA解鏈處），開(kāi)始RNA鏈的合成。以4種核糖核苷酸（NTP）為原料，按堿基配對(duì)原則（A—U/T—A、G—C），與模板鏈上的相應(yīng)堿基配對(duì)，分別結(jié)合到DNA模板鏈上。在RNApol催化下，開(kāi)始點(diǎn)處相鄰的前兩個(gè)NTP以3，5，—磷酸二酯鍵相連接。其中第一個(gè)核苷酸為腺苷酸或鳥(niǎo)苷酸，而以鳥(niǎo)苷酸居多。當(dāng)RNA鏈開(kāi)始合成后，σ因子從復(fù)合物上脫落，并與另一核心酶結(jié)合成RNApol全酶，啟動(dòng)另一個(gè)轉(zhuǎn)錄過(guò)程。

轉(zhuǎn)錄起始，即轉(zhuǎn)錄激活過(guò)程是基因表達(dá)調(diào)節(jié)的核心環(huán)節(jié)。

（二）延長(zhǎng)

RNA鏈的延長(zhǎng)過(guò)程是由核心酶催化的。核心酶向模板鏈的下游方向滑動(dòng)，每移動(dòng)一個(gè)核苷酸的距離，則有一個(gè)核苷酸按DNA模板鏈的堿基互補(bǔ)關(guān)系加入延長(zhǎng)的RNA鏈、并與前一個(gè)核苷酸形成磷酸二酯鍵連接。如此進(jìn)行下去，RNA鏈逐漸延長(zhǎng)。與DNA復(fù)制一樣，RNA的鏈的合成也是有方向性的，即沿5，—3，方向進(jìn)行。RNApol移動(dòng)前進(jìn)，其后面的DNA鏈即恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)。

（三）終止

當(dāng)核心酶移動(dòng)DNA模板的轉(zhuǎn)錄終止部位時(shí)，轉(zhuǎn)錄停止。關(guān)于轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)理有兩種機(jī)制。