分子生物學基因工程與基因體外表達課件

分子生物學基因工程與基因體外表達課件分子生物學基因工程與基因體外表達課件1第十三章基因工程與基因體外表達GeneEngineeringandGeneExpression第十三章基因工程與基因體外表達GeneEngineerin2目的與意義1.獲得感興趣的目的基因2.研究基因結(jié)構(gòu)特征3.表達基因產(chǎn)物4.研究基因功能目的與意義1.獲得感興趣的目的基因2.研究基因結(jié)構(gòu)特征3.表3基本要素1.目的基因(targetgenes)2.工具酶(toolenzymes)3.載體(vectors)4.宿主細胞(hostcells)基本要素1.目的基因(targetgenes)2.工4Maincontents

工具酶DNA載體基因克隆過程真核細胞基因轉(zhuǎn)染基因改造克隆基因表達電子克隆基本概念及背景Maincontents工具酶DNA載體基因克隆過程真5ForExample

如何從植物中克隆法呢基焦磷酸合酶(FPS)?1.查資料認識FPS2.設(shè)計實驗方案3.可行性分析ForExample如何從植物中克隆法呢基焦磷酸合酶(6ForExample

ForExample7FPS克隆：RT-PCR，3'-RACE，5'-RACE改進的異硫氰酸胍一步法提取三七根部總RNART-PCR擴增fps部分保守序列3’-RACE及克隆測序5’-RACE及克隆測序序列拼接FPS克隆：RT-PCR，3'-RACE，5'-RA8mRNA:5’AAAAAA3’TTTTTTT-接頭cDNA:OligodT接頭基因特異性引物3’FullRACE原理圖mRNA:5’95’FullRACE原理圖(1)P5’-端磷酸化RT-Primer未知區(qū)域已知序列TargetmRNAAAAAAAAA-----5’AAAAAAAA-----5’P未知區(qū)域逆轉(zhuǎn)錄RNA分解P未知區(qū)域未知區(qū)域S1A1S2A21stPCRprimers2ndPCRprimers用RNAligase進行環(huán)化或形成首尾連接物未知區(qū)域1stand2ndPCR5’-端磷酸化RTprimer部位包含未知的5‘上游區(qū)域的擴增產(chǎn)物(2)(3)(4)5’FullRACE原理圖(1)P5’-端磷酸化RT-10ThankYouThankYou11DNA重組DNArecombinationSomeconcernedconcepts:DNA重組技術(shù)DNArecombinationtechnique分子克隆Molecularcloning基因工程Geneticengineering克隆CloningDNA重組DNArecombinationSom12分子生物學基因工程與基因體外表達課件13三大理論基礎(chǔ)1953年，Watson和Crick揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制原理，解決了基因的自我復(fù)制和傳遞的過程。40年代，O.T.Avery等通過肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗發(fā)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的攜帶者是DNA而不是蛋白質(zhì)50年代末到60年代初，相繼提出了“中心法則”和操縱子學說，成功破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流向和表達問題。三大理論基礎(chǔ)1953年，Watson和Crick揭示了DN14三大技術(shù)發(fā)明DNA分子的體外切割與連接技術(shù)

1970年Smith,Wilcox流感嗜血桿菌(Haemopbilusinfluenzae)HindII1972年BoyerEcoRI“GAATTC”1967年世界上5個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了DNAligase1970年T4DNAligase大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立----復(fù)制工廠基因工程載體的使用：plasmid,phage,viruses三大技術(shù)發(fā)明DNA分子的體外切割與連接技術(shù)大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系151978年Nobel醫(yī)學與生理學獎TheNobelPrizeinMedicinewasawarded,in1978,toDanielNathans,WernerArber,andHamiltonSmithforthediscoveryofrestrictionendonucleases.TheirdiscoveryleadtothedevelopmentofrecombinantDNAtechnologythatallowed,forexample,thelargescaleproductionofhumaninsulinfordiabeticsusingE.colibacteria.Over3000restrictionenzymeshavebeenstudiedindetail,andmorethan600oftheseareavailablecommerciallyandareroutinelyusedforDNAmodificationandmanipulationinlaboratories.1978年Nobel醫(yī)學與生理學獎TheNobelPr16分子生物學基因工程與基因體外表達課件17DNAligaserepairingchromosomaldamage.ligaseI,DNA,ATP-dependentDNAligaserepairingchromosom18第一節(jié)基因克隆是利用工具酶進行操作工具酶(Toolenzymes)----用于對DNA分子進行定點切割、連接、擴增、標記等操作的特殊酶類，已被純化并商品化進行應(yīng)用一、限制酶(RE,restrictionendonuclease)二、其他工具酶(othertoolenzymes)第一節(jié)基因克隆是利用工具酶進行操作工具酶(Toolen19一、RE在基因克隆中用于切割DNARE(restrictionenzyme,restrictionendonuclease)----限制性核酸內(nèi)切酶，限制酶，能識別DNA雙鏈內(nèi)特異位點并水解磷酸二酯鍵，產(chǎn)生特定末端的酶一、RE在基因克隆中用于切割DNARE(restricti20RestrictionenzymeFunctions:能識別DNA內(nèi)部特異位點并且裂解磷酸二酯鍵(1)Sortingofrestrictionenzyme有三型，但最重要的是II型酶(2)NamingofRE細菌屬名細菌種名細菌菌株編號EscherichiacoliRY13I屬—Genus,種--species,菌株--strainEcoRIRestrictionenzymeFunctions:細21Twocatalyticmanganeseions(onefromeachmonomer)areshownasmagentaspheresandareadjacenttothecleavedsitesintheDNAmadebytheenzyme(depictedasgapsintheDNAbackbone).StructureofthehomodimericrestrictionenzymeEcoRI(cyanandgreencartoondiagram)boundtodoublestrandedDNA(browntubes)basedonthePDB1QPSX-raycrystallographiccoordinates.Twocatalyticmanganeseions(22(3)限制酶的識別和切割位點Characters:通常識別4~6個堿基，少數(shù)識別8個所識別的序列一般為回文結(jié)構(gòu)(palindrome)在特異位點內(nèi)切割DNA雙鏈，產(chǎn)生兩種末端粘性末端平端5’-粘性末端3’-粘性末端5’-CCCGGG…-3’3’-GGGCCC…5’5’-CCCGGG…-3’3’-GGGCCC…-5’+平端切割(bluntend,suchasSmaI)Goto109(3)限制酶的識別和切割位點粘性末端平端5’-粘性末端3235’-GGTGAATTCAGC…-3’3’-CCACTTAAGTCG…5’5’-TTGCTGCAGAAG…-3’3’-AACGACGTCTTC…5’5’-粘性末端(EcoRI)3’-粘性末端(PstI)5’-GGTGAATTCAGC…-3’3’-CCACTTAAGTCG…5’+5’-TTGCTGCAGAAG…-3’3’-AACGACGTCTTC…5’+5’-GGTGAATTCAGC…-3’5’-TTGCTGCA24(4)同工異源酶(isoschizomers)

來源不同，但能識別和切割同一位點的RE

例：BamHI&BstI(G↓GATCC)XhoI&PaeR7(C↓TCGAG)(5)同尾酶(isoaudamers)

識別序列不同，但產(chǎn)生相同粘性末端的RE

例：BamHI(G↓GATCC)Sau3AI(N↓GATCN)RE作用的條件：一定的鹽溶度；Mg2+;不需ATPRE識別序列長度與切點數(shù)：對同一DNA，識別序列短的，切點數(shù)多，片段較短；反之則反之(4)同工異源酶(isoschizomers)25二、基因克隆需要具有不同功能的工具酶其他工具酶----用于對DNA分子進行多種操作，也叫修飾酶作用：剪切、補平、連接、化學修飾等二、基因克隆需要具有不同功能的工具酶其他工具酶----用于對26常用：(1)DNApolymeraseI，KlenowFragment(2)Reversetranscriptase(3)T4DNAligase(4)Alkalinephosphatase(5)Terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT(6)TaqDNApolymeraseSoon常用：27(1)DNApolymeraseIActivities：5’→3’聚合活性，5’→3’及3’→5’外切活性Functions：在生物體內(nèi)，填補引物切除后留下的空缺，修復(fù)在生物體外，缺口平移制備探針DNApolymeraseIKlenowfragment(76KD)Anothersmallfragment

枯草桿菌蛋白酶(1)DNApolymeraseIDNApolym28Klenow片段35kD76kDNCE.coliDNApolI5’→3’外切酶5’→3’聚合酶3’→5’外切酶用枯草桿菌蛋白酶裂解全酶5’→3’聚合酶3’→5’外切酶76kDCKlenowfragment用途：1)補齊雙鏈DNA的3’-末端2)通過補齊3’端使3’端標記3)在cDNA克隆中，第二股鏈的合成4)DNA序列分析Klenow片段35kD76kDNCE.coliDNA29常用的reversetranscriptase:禽類成骨細胞性白血病病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶(2)Reversetranscriptase用途：合成cDNA，構(gòu)建cDNA文庫Moloney小鼠白血病病毒(MMLV)逆轉(zhuǎn)錄酶常用的reversetranscriptase:禽類成骨細30第二節(jié)基因克隆需要特定的DNA載體基因克隆為什么需要載體？載體的類型----克隆載體，表達載體載體的來源細菌質(zhì)粒噬菌體DNA(λDNA,M13DNA)病毒DNA人工載體(cosmid)等第二節(jié)基因克隆需要特定的DNA載體基因克隆為什么需要載體31DNA載體(vector)----能與DNA片段連接，構(gòu)建成新的重組DNA分子，并可攜帶該外源DNA片段進入一定宿主細胞，在宿主中擴增甚至表達，并有遺傳標記進行篩選載體的概念DNA載體(vector)----能與DNA片段連接，構(gòu)建成32Cloningvector——能夠攜帶感興趣的外源DNA（targetDNA）進入宿主細胞，并將外源DNA在宿主內(nèi)進行克隆和擴增，而采用的一些DNA分子稱為Cloningvector。CloningvectorclassesPlasmidDNA(質(zhì)粒DNA)PhageDNA(噬菌體DNA)VirusDNA(病毒DNA)Expressionvector————能使外源基因在宿主中表達的載體Cloningvector——能夠攜帶感興趣的外源DNA33Expressionvector:含表達調(diào)控有關(guān)的元件WhenEcoliisusedashostcell,plasmid,λphage,cosmid,M13phagecanusuallybeusedasvectors載體的本質(zhì)是什么？Vectorcharacters(cloningvector):能在宿主細胞中自我復(fù)制、自我表達分子相對較小，在宿主細胞中有高拷貝具有遺傳標志有多個限制性酶單一酶切位點(多克隆位點)易與宿主DNA相分離Expressionvector:含表達調(diào)控有關(guān)的元件W34一、常用克隆載體主要來自質(zhì)粒和病毒(一)質(zhì)粒是常用的克隆載體Examples:pBR322pUCCharacters:Smallmolecularweight,highcopiesMorethanonegeneticmarkMultiplecloningsites,MCS一、常用克隆載體主要來自質(zhì)粒和病毒(一)質(zhì)粒是常用的克隆載體35pBR322Turnto64pBR322Turnto6436pUC19pUC1937(二)噬菌體經(jīng)過重組也可以攜帶外源DNAExamples:λbacteriophage,phage;M13phageItisakindofviruswhichcaninfectbacteriaλbacteriophagesincommonuse:EMBLspectrumλgtspectrumCharonspectrum(二)噬菌體經(jīng)過重組也可以攜帶外源DNAExamples38λbacteriophage,phageλ噬菌體是侵犯細菌的病毒。在菌體內(nèi)為環(huán)狀DNA分子；分離產(chǎn)物為雙鏈線狀DNA分子，有天然的粘性末端（稱COS位點），進入宿主菌后可自行環(huán)合?；蚪MDNA長約為,共有66個基因，較復(fù)雜。Character：1、其生長必需的序列位于左右二臂上，中部約30%為生長非必需；2、成熟需要包裝（大小為原來的75-105%時）Twokindsofvectors：置換型載體；插入型載體λbacteriophage,phageCharacte39置換型λ噬菌體載體：用限制酶切除中央片段供目的基因替代，目的基因與左、右載體兩臂結(jié)合。替代片段可達9~23Kb。左臂中央片段右臂酶切點酶切點切除后用目的基因取代COS位點COS位點（12bp)置換型λ噬菌體載體：用限制酶切除中央片段供目的基因替代，目的40Thelifeperiodofλphage(噬菌體的生活周期):Lysogenicpathway(溶原生長途徑)Lysispathway(溶菌生長途徑)Thelifeperiodofλphage(噬菌體41溶原生長溶菌生長溶原轉(zhuǎn)溶菌生長以噬菌體為媒介的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用溶原生長溶菌生長溶原轉(zhuǎn)溶菌生長以噬菌體為媒介的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用42λgt10:insertionvector;multiplecloningsite:CIThepositivemarksofscreening:Whethertherecombinantvectorcanbewrapped(IfnoextraneousDNAreplaced,thevectorwouldbetoosmalltobewrapped)Withinsertion,CIactivitylost,tobetransparentspots;Withoutinsertion,CIkeepsintact,tobeturbidspotsλgt11：insertionvector;MCS:lacZ；expressedWithinsertionintolaczofλgt11,whitespotsOtherwisebluespotsλgt10:insertionvector;multi43(四)粘性質(zhì)粒適合克隆較大的DNA片段粘性質(zhì)粒(cosmid)由λDNA的cos區(qū)與質(zhì)粒重新構(gòu)建的載體，具有與質(zhì)粒相同的結(jié)構(gòu)特點，為雙鏈環(huán)狀DNA。ItisconstructedwiththecosregionofλDNAandplasmid,whichisdoublecycleDNAwithbiggercontentforcloning(40~50kb)(四)粘性質(zhì)粒適合克隆較大的DNA片段粘性質(zhì)粒(cosmi44Characters:1)Withantibioticsmarksandreplicationelementitself2)Withcosregionofλphage,canbewrapped3)Withoneormorecloningsites4)Smallmolecularweight5)non-recombinationcosmidtoosmalltobewrapped,soitisscreenedeasilyCharacters:45(三)M13噬菌體適合制備單鏈DNAM13bacteriophage:ItisakindofEcoliphage,thegenome6.5kb,acycleDNAcontainingsinglestrandDNATwoforms:Wildform;Replicationform(RF)Themostmerit:Canbereleasedfromhostassinglestrand(三)M13噬菌體適合制備單鏈DNAM13bacteri46M13phageCharacters:Invivo,doublestrandsDNA(canbereplicated)Invitro,singlestrandDNA(canbeusedastemplateforDNAsequencing,ormakeDNAprobesforhybridization)Afterenteringhostcells,itisreplicatedtodoublestrandsDNAandbecomesreplicationalformDNA(RFDNA)whichcanbeusedascloningvectorM13phageCharacters:Invivo,47(五)病毒載體可將外源DNA帶入哺乳動物細胞Virusvectorsincommonuse:逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺相關(guān)病毒，EB病毒等病毒載體，可將外源基因?qū)胧荏w細胞Characters:多數(shù)均已質(zhì)?；刹《締幼?、包裝元件、選擇性遺傳標記及pBR322復(fù)制起始點組成Othervectors:YAC,yeastartificialchromosome(0.5~2Mb)BAC,bacterialartificialchromosome(~0.4Mb)(五)病毒載體可將外源DNA帶入哺乳動物細胞Virusv48二、表達載體將外源基因帶入宿主并表達ExpressionvectorsConcept:Theconditionsforexpressionvector:WithexpressionstructuresexceptforthecharactersofcloningvectorsThevectorswhichcanmaketheextraneousDNAbeexpressedinhostcellsaretermedasexpressionvectors.二、表達載體將外源基因帶入宿主并表達Expressionv49Sorts:ExpressionvectorsofEcoli(prokaryote)ExpressionvectorsofeukaryoteExpressionvectorsofmammalanimalsSorts:ExpressionvectorsofE50(一)原核表達載體適于原核細胞表達外源基因ExpressionvectorsofEcoli:除克隆所需成分外，還含有啟動子，核糖體結(jié)合位點，轉(zhuǎn)錄終止序列等表達元件(一)原核表達載體適于原核細胞表達外源基因Expressi51Trp-lacpromoter(ortacpromoter)Inducer:IPTGStrains:RB791,XL-1-blue,SB221,JM1091.PromoterT7ofT7phageItisahigheffectiveexpressionpromoterStrain:JM109(DE3)PLofλ-phage(temperatureinducepromoter)ControlledbycIts857(sensitivetotemperature),clts857為溫度敏感阻抑物Strain:M5219Trp-lacpromoter(ortacprom52原核生物mRNA與核蛋白體小亞基結(jié)合的分子機制AUUCCUCCACUAGG核蛋白體小亞基的16S-rRNA5’AGGAPuPuUUUPuPuAUG3’mRNARps辨認序列SD序列Ribosome-bindingsite,RBS

IncludingAUG,SDsequence

2.核糖體結(jié)合位點(RBS)原核生物mRNA與核蛋白體小亞基結(jié)合的分子機制AUUC53作用：

3.轉(zhuǎn)錄終止序列保證外源基因在宿主中的高效表達使讀碼框架能夠正確轉(zhuǎn)錄作用：3.轉(zhuǎn)錄終止序列保證外源基因在宿主中的高效表達使讀54(二)真核表達載體適于真核細胞表達外源基因Eukaryoteexpressionvectors:含有一定的原核序列：Ecoli中的ori位點；antibacterialsite含有一定的真核序列：真核細胞中的藥物抗性基因；真核表達組件，如真核復(fù)制起點，啟動子/增強子，克隆位點，加尾信號等(二)真核表達載體適于真核細胞表達外源基因Eukaryot55ExpressionvectorsofmammalanimalIfageneneedstobeexpressedinmammalanimalcells,theeukaryoteexpressionvectormustbeused.Theessentialelementsincluding:Replicaorigin,antibioticssites,eukaryotepromoter,enhancer,cloningsites,terminationsignal,polyAsignalExpressionvectorsofmammal56第三節(jié)基因克隆過程包括五個基本部分Genecloningprocess(1)制備目的基因及相關(guān)載體(2)將目的基因與載體進行連接(3)將重組DNA導(dǎo)入受體細胞(4)DNA重組體的篩選與鑒定(5)DNA重組體擴增、表達及其他研究分切接篩轉(zhuǎn)第三節(jié)基因克隆過程包括五個基本部分Geneclonin57一、采用不同方法獲取目的基因Methodstogetatargetgene:(1)Topreparegenomiclibrary(2)TopreparecDNAlibraryorcDNA(3)ToPCR(4)TosynthesizetheDNAfragmentbychemicalmethod一、采用不同方法獲取目的基因Methodstogeta58(一)從基因組文庫中獲得目的基因Genomiclibrary:指含有一個機體基因組DNA的全套重組DNA分子的克隆群體用于構(gòu)建基因組文庫的載體：λ-噬菌體(λ-phage)，粘性質(zhì)粒(cosmid)(一)從基因組文庫中獲得目的基因Genomiclibra59Genomiclibraryconstruction:分離高分子量DNA分離回收15~25kb的DNA片段部分消化，以切成一定大小片段回收片段與適當載體連接所有重組DNA分子轉(zhuǎn)入宿主細胞并擴增基因組文庫Genomiclibraryconstruction:分60隨機文庫克隆數(shù)目計算隨機文庫指代表基因組各部分DNA的摩爾數(shù)相等。對于隨機文庫，有：ln(1-P)N=ln(1-)xyN:克隆數(shù)目P:設(shè)定的概率值(如：0.99)x:插入片段平均大小(15~20kb)y:植物基因組大小(以kb計)▲如果插入片段平均大小為20kb，某植物基因組大小為4x108bp，時，根據(jù)上式，N≈1X105。含1X105個克隆的基因文庫相當覆蓋了5倍的基因組，在片段隨機分布時，從文庫中找到任一序列的概率不低于。隨機文庫克隆數(shù)目計算隨機文庫指代表基因組各部分DNA的摩爾數(shù)61植物基因組大小及克隆文庫所需噬菌斑數(shù)植物種類基因組大小(bp)a

重組噬菌斑數(shù)b擬南芥74大豆85菜豆95碧東茄95煙草96玉米96小麥106a，基因組大小引自Rogers和Bendich;b.假設(shè)插入片段為17kb,概率為。植物基因組大小及克隆文庫所需噬菌斑數(shù)植物種類62(二)從cDNA文庫中獲得目的基因cDNAlibrary:指含有一個機體某種特定細胞或特定狀態(tài)下表達基因的全部cDNA克隆的群體cDNAlibrarycharacters:不含內(nèi)含子，用mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建cDNAlibraryvectors:λ-gt10;λ-gt11;λZiploxetal(二)從cDNA文庫中獲得目的基因cDNAlibrary63cDNAlibraryconstruction:分離mRNARNaseH水解去掉mRNA以oligo(dT)為引物，合成cDNA第一鏈隨機引物，DNApolI合成第二鏈修齊兩端，加人工接頭，與載體連接，得到cDNA重組體，所有cDNA重組體均轉(zhuǎn)入宿主擴增cDNA文庫cDNAlibraryconstruction:分離mR64(三)利用PCR技術(shù)獲得目的基因采用T載體(AT克隆)：pGEM-Tvector;pMD18-TVector

合成長度有限可人工設(shè)計相應(yīng)的序列，不必使用天然模板(四)人工合成目的基因(三)利用PCR技術(shù)獲得目的基因采用T載體(AT克隆)：p65分子生物學基因工程與基因體外表達課件66PlasmidλphagecosmidM13phageCapacity<10kb<22kb40~50kb<1kbofcloninggDNAlibrary-++-cDNAlibrary++--Subcloning+--+Sequencing++-+Ecoliexpression++--二、依據(jù)基因克隆的目的選擇和準備載體Cloningvectorsincommonuse:Plasmidλphageco67(1)TheligationbycohesiveendsAdvantage:easilylinkedDisadvantage:easilytobecycledselfbidirectioninsertion(2)Theligationwithartificiallinker(3)Theligationwithhomopolymerictail

(4)TheligationbybluntendsHighATPcon.T4DNAligaseshouldbeused三、選擇適當?shù)牟呗詫NA片段進行連接Methodsincommonuse:(1)Theligationbycohesivee68(一)粘性末端的連接全同源粘性末端最方便，但載體自身環(huán)化，并為雙向插入5’————G3’————CTTAAppAATTC————3’G————5’————G————CTTAAppAATTC————G————5’————G3’————CTTAAppAATTC————3’G————5’例：用EcoRI分別切割載體和目的DNA：切割載體：切割目的DNA：(一)粘性末端的連接全同源粘性末端最方便，但載體自69————G————CTTAAAATTC—————G————AATTC————3’G————5’5’————G3’————CTTAA雙向插入示意圖：————G————CTTAAAATTC—————G————AATTC————3’G————5’5’————G3’————CTTAA————G————CTTAAAATTC—————G————A70粘性末端的連接粘性末端的連接71(二)用人工接頭法克隆cDNA連接酶堿性磷酸酶(二)用人工接頭法克隆cDNA連接酶堿性磷酸酶72(三)同聚物接尾法克隆雙鏈DNA轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗魍嘶疠d體(三)同聚物接尾法克隆雙鏈DNA轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗魍嘶疠d體73(一)轉(zhuǎn)化(transformation)四、重組DNA需要導(dǎo)入宿主細胞進行擴增Methodsincommonuse:(二)感染(infection)(三)轉(zhuǎn)染(transfection)(四)電穿孔(electroporation)(一)轉(zhuǎn)化(transformation)四、重組DN74(一)轉(zhuǎn)化是直接將DNA導(dǎo)入細菌的方法Transformation：指將質(zhì)?；蚱渌庠碊NA導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主菌，并使其獲得新的表型的過程。

宿主菌：Ecoli感受態(tài)細胞的制備：低溫CaCl2處理，使細胞通透性增加，易于攝取外源DNA，這種細胞稱為感受態(tài)細胞(competentcell)(一)轉(zhuǎn)化是直接將DNA導(dǎo)入細菌的方法Transforma75(二)感染是利用噬菌體將外源DNA導(dǎo)入宿主Infection：指λ噬菌體、粘性質(zhì)粒或真核細胞病毒為載體的重組DNA分子，在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，然后感染適當宿主細胞的過程

(二)感染是利用噬菌體將外源DNA導(dǎo)入宿主Infectio76用于包裝的宿主菌：λ琥珀突變株Dam溶菌物：含頭部蛋白λ突變株Eam溶菌物：含尾部蛋白Dam溶菌物+Eam溶菌物+λDNA重組體包裝噬菌體重組有外源DNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染輔助病毒φ-2細胞包裝成病毒顆粒有感染能力用于包裝的宿主菌：λ琥珀突變株Dam溶菌物：含頭部蛋白λ突變77(三)轉(zhuǎn)染是將外源DNA導(dǎo)入真核細胞的方法Transfection：指真核細胞主動攝取或被動導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過程Methods：電穿孔磷酸鈣共沉淀法脂質(zhì)體融合法進入細胞的DNA存在方式染色體外整合至宿主基因組中(三)轉(zhuǎn)染是將外源DNA導(dǎo)入真核細胞的方法Transfec78(一)遺傳學方法五、重組DNA導(dǎo)入宿主后篩選與鑒定Methodsincommonuse:(二)免疫學方法----檢測表達產(chǎn)物(三)核酸雜交(四)PCR技術(shù)抗性標記表型標記插入失活α互補(五)酶切鑒定Goto23Goto103Goto104Goto105(一)遺傳學方法五、重組DNA導(dǎo)入宿主后篩選與鑒定Meth79第四節(jié)真核細胞基因轉(zhuǎn)染Transfection：指真核細胞主動攝取或被動導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過程一、真核細胞轉(zhuǎn)染的方法與基本原理二、轉(zhuǎn)染細胞可利用抗性標記進行篩選第四節(jié)真核細胞基因轉(zhuǎn)染Transfection：指真核細80(一)磷酸鈣共沉淀示介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染一、真核細胞轉(zhuǎn)染的方法與基本原理Methodsincommonuse:(二)電穿孔法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染(electroporation)(三)DEAE-葡聚糖法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染(DEAE-dextran)(四)脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染(liposome)(五)顯微注射法(microinjection)Calciumphosphateco-precipitation(1%)(一)磷酸鈣共沉淀示介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染一、真核細胞轉(zhuǎn)染的方法與基81Electroporation(電穿孔法)ExtraneousDNAHostcellsElectricitywithhighfrequencyElectroporation(電穿孔法)Extraneo82(一)利用TK-細胞突變株進行轉(zhuǎn)染細胞篩選二、轉(zhuǎn)染細胞可利用抗性標記進行篩選Methodsincommonuse:(二)藥物篩選轉(zhuǎn)染細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選(一)利用TK-細胞突變株進行轉(zhuǎn)染細胞篩選二、轉(zhuǎn)染細胞可83(一)利用TK-細胞突變株進行轉(zhuǎn)染細胞篩選Principle：TK(thymidinekinase)是催化核苷酸補救合成的關(guān)鍵酶氨基喋呤(aminopterin,A)是從頭合成途徑的抑制劑，A的加入使細胞主要依賴于補救合成TK-選擇系統(tǒng)Host----TK-細胞株(TK表達缺陷)培養(yǎng)基----HAT培養(yǎng)基H,hypoxanthine;A,aminopterin;T,thymine(一)利用TK-細胞突變株進行轉(zhuǎn)染細胞篩選Princip84Tk

-氨基蝶呤（A）處理抑制二氫葉酸還原酶四氫葉酸逐漸耗盡dUMPdATPdCTP(-)(+)HdATPdCTPTdTTPTk+培養(yǎng)基含H、TA細胞不能存活細胞能夠存活補救合成tk基因?qū)雝k-細胞細胞能夠存活在含HAT培養(yǎng)基中tk選擇系統(tǒng)原理圖解(越過A的抑制)Tk-氨基蝶呤（A）處理抑制二氫葉四氫葉酸dUMPdATP85Thescreeningwithantibiotics,G418(geneticin,新霉素衍生物)(二)藥物篩選轉(zhuǎn)染細胞Themostusedantibioticmarker:neorThescreeningwithantibiotics86新霉素抗性選擇系統(tǒng)新霉素干擾原核生物蛋白合成不影響真核生物蛋白合成新霉素類似物G418干擾原核生物蛋白合成干擾真核生物蛋白合成細菌新霉素抗性基因neor表達氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)使G418失活表達neor

的細胞可在含G418的培養(yǎng)基中存活新霉素抗性選擇系統(tǒng)新霉素干擾原核生物蛋白合成不影響真核生物蛋87第五節(jié)利用重組DNA技術(shù)進行基因改造Methodsincommonuse:定點誘變技術(shù)寡核苷酸介導(dǎo)定點誘變技術(shù)PCR介導(dǎo)定點誘變技術(shù)目的改變基因的一級序列特征第五節(jié)利用重組DNA技術(shù)進行基因改造Methodsin88一、對特定基因可進行定點誘變Whatisthesite-directedmutagenesis(目的基因的定點誘變)?Itmeanstheprocessthattheoneormoresitesofgenebereplacedordeletedbyartificialmethod.一、對特定基因可進行定點誘變Whatisthesite89(一)帶突變位點的寡核苷酸可介導(dǎo)定點誘變

Thesite-directedmutagenesismediatedbyoligonucleotideCharacters:Itcancausefinelythemutagenesisatthespecialsiteaccordingtothedesignofresearchers(一)帶突變位點的寡核苷酸可介導(dǎo)定點誘變Thesite90Processes:1)TheuseofKlenowfragmentandaprimerwithanincorrectpairedbase,M13assinglestrandtemplate2)ToextendtheprimertogetaheterozygousdoublestrandsDNA3)TotransformtheheterozygousDNAintoEcoli,thewildDNAandmutatedDNAwillbeyielded4)ToscreenanddecidethemutatedDNA，furtherresearchthemutatedDNAProcesses:1)TheuseofKlenow91誘變寡核苷酸引物單鏈M13模板Klenowfragment,dNTP,T4DNApol雜交雙鏈DNA轉(zhuǎn)化Ecoli瓊脂平皿標記誘變寡核苷酸原位分子雜交放射自顯影

寡核苷酸介導(dǎo)的定點誘變基本實驗步驟理論上最高誘變效率只有50%誘變寡核苷酸引物單鏈M13模板Klenowfragment92(二)含U模板可以提高寡核苷介導(dǎo)定點誘變效率Principle:建立含U單鏈模板(U取代T)----正鏈合成雜合雙鏈DNA雜合雙鏈DNA轉(zhuǎn)化野生型Ecoli中尿嘧啶核苷酶降解含U的正鏈帶誘變位點的負鏈能保存，合成雙鏈DNA(突變體突變率90%)(二)含U模板可以提高寡核苷介導(dǎo)定點誘變效率Princip93誘變寡核苷酸引物Klenowfragment,dNTP,T4DNApol轉(zhuǎn)化野生型Ecoli，含尿嘧啶核苷酶，可降解含U模板標記誘變寡核苷酸原位分子雜交放射自顯影U模板介導(dǎo)的定點誘變基本實驗步驟含突變體的負鏈保存下來并進行復(fù)制擴增，篩選鑒定突變率90%單鏈M13模板UUUUUUU雜交雙鏈DNAUUUUUUU誘變寡核苷酸引物Klenowfragment,dNTP,94(三)PCR技術(shù)適合進行基因的定點誘變Principle(兩對引物，三次PCR):一對常規(guī)引物a、d+一對帶誘變點的引物b、ca+b及d+c分別擴增出兩個帶突變點的片段上述兩個片段等量混合，變性、退火用KlenowDNA聚合酶補齊利用a、d引物對進行PCR擴增，即得所需片段(三)PCR技術(shù)適合進行基因的定點誘變Principle(955’5’3’3’abcd5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’5’5’3’3’ad5’3’5’3’PCR1PCR2變性，退火Klenowfragment,dNTPPCR3圖8-8PCR介導(dǎo)的定點誘變法5’5’3’3’abcd5’5’3’3’5’5’3’3’5’96二、利用基因定點誘變技術(shù)改變基因工程蛋白特性目的使工業(yè)酶具有更好的理化特性便于應(yīng)用使臨床生物蛋白或多肽制劑療效高副作用小獲得更多對人類有益的蛋白或多肽產(chǎn)物Forexample:Insulin二、利用基因定點誘變技術(shù)改變基因工程蛋白特性目的使工業(yè)酶具有97GeneengineeringInsulin1.定點誘變制備長效Insulin(半衰期延至35.3h)2.定點誘變制備快速吸收Insulin(減少六聚體形成)3.定點誘變增加Insulin與受體的親和力B27Thr→Arg,C端氨基化；A21Asn→GlyB10His→Asp,體外活性較野生型提高5倍GeneengineeringInsulin1.定點誘98第六節(jié)克隆基因在適當宿主細胞的表達ExpressionsystemsExpressionvectors,AppropriatehostcellsAim:TogetalotofproteinsorpolypeptidesTheexpressionsystemsincommonuse:EcoliexpressionsystemMammalanimalexpressionsystemInsectexpressionsystemYeastexpressionsystem第六節(jié)克隆基因在適當宿主細胞的表達Expression99一、大腸桿菌(Ecoli)表達系統(tǒng)Characters：目標基因表達水平高、遺傳背景清楚、易于培養(yǎng)（培養(yǎng)方法簡單、生長快、培養(yǎng)周期短、抗污染能力強）、成本低一、大腸桿菌(Ecoli)表達系統(tǒng)Characters100(一)表達外源基因需要一些基本要素1.來自真核細胞的基因需要適當改選2.必須選用Ecolivectors3.目的基因與載體可用不同方式連接4.選擇適當?shù)氖荏w菌和誘導(dǎo)條件表達非融合蛋白；表達融合蛋白(一)表達外源基因需要一些基本要素1.來自真核細胞的基因需101Ifthetargetgenecomefromeukaryote,itshouldbecDNA.Why?1.來自真核細胞的基因需要適當改選ThesignalpeptideofsecretaryproteinhastobedeletedtooThe5’-endsequencebeforeATGoncDNAisuseless,soithastobedeleted.Ifthetargetgenecomefrome102ThevectorsmustbeEcoliexpressionvectors,whichcontainthepromoters(PL,tac,T7)recognizedbyDDRPinEcoliandSDsequence.Why?2.必須選用EcolivectorsPromotersEffectivelyinducetranscription轉(zhuǎn)錄效應(yīng)強Canbecontrolledeasily能被有效控制ThevectorsmustbeEcoliexp1035’3’SDTargetgenea.Toexpressthenon-fusionproteinsUseNdeI(CATATG)orNcoI(CCATGG)tobringinATG

SDTargetgeneFragmentofstructuregeneofprokaryote3.目的基因與載體可用不同方式連接Themodelsoflinkage:b.Toexpressthefusionproteins5’3’SDTargetgenea.Toexpress104Fusionprotein:NThepeptideoftargetgenepeptideofprokaryoteCItmeansthatthepeptideexpressedconsistsofN-endofpeptidecodedbyprokaryoteDNAandC-endofpeptidecodedbythecloningfragmentofeukaryoteDNA,whichistermedasfusionprotein.Fusionprotein:NThepeptideof105Theadvantagesoffusionprotein:a.Morestableb.Withthesignalpeptide,thesecretaryproductcouldbeyieldedc.Itcanbepurifiedbyaffinitychromatographyd.Thepeptideofprokaryotecanbecutoutbyproteinase,andthenthepeptideofeukaryotecanbereleasedinnaturalformTheadvantagesoffusionprote106(二)采用適當措施可提高外源基因表達水平1.多種策略提高翻譯水平2.將細菌生長與外源基因表達在時間上分開3.采用不同措施提高表達蛋白的穩(wěn)定性表達融合蛋白，采用突變菌株，表達分泌蛋白調(diào)整SD與ATG之間距離，增加mRNA穩(wěn)定性，點突變改變堿基(二)采用適當措施可提高外源基因表達水平1.多種策略提高107二、哺乳動物表達系統(tǒng)Characters：EukaryoteexpressionsystemsareneededThegenetobeexpressedcancomefromgenomeDNAorcDNAWhy?二、哺乳動物表達系統(tǒng)Characters：108Howcanthevectorsbetransformedintohostcells?Plasmidvectors:Calciumphosphateco-precipitation;Electroporation;DEAE-Dextran;Microinjection;MaketheextraneousDNAintocellsmediatedbyliposomeVirusvectors:Thevirusvectorshavetobeintroducedintowrapcells,thenthepseudo-virusparticleswouldbeproducedandusedtoinfectthehostcells.Howcanthevectorsbetransfo109Thescreeningmarkers:Antibioticsgenes(neor)----codetheaminosaccharidephosphatetransportase----makeG418lostactivityAdvantages:Theexpressionproductshavescarcelyeffectonhostcells,andnoteasilybedegraded.Thescreeningmarkers:Advantag110(1)Insectexpressionsystem1)Drosophilamelanogaster(Fruitfly)expressionsystem(DES)(果蠅表達系統(tǒng))2)Bacilliformvirusexpressionsystem(桿狀病毒表達系統(tǒng))三、其他真核表達系統(tǒng)(2)Microzyme(yeast)expressionsystem(啤酒酵母，Saccharomycescerevisiae)Goto101(1)Insectexpressionsystem三、111第七節(jié)電子克隆輔助基因克隆Insilicocloning通過對基因數(shù)據(jù)庫進行序列搜索、對比分析、拼接整合，預(yù)測新的、假定的全長基因，然后通過分子生物學實驗方法，加以證實，并從相應(yīng)組織、細胞中獲得這種基因，稱為電子克隆InsilicocloningNote:Insilicoisnottherealgenecloning第七節(jié)電子克隆輔助基因克隆Insilicocloni112SummaryThebasicelementsforgenecloningThebasicprocessforgenecloningThegenesite-directedmutagenesisThegeneexpressionInsilicocloningSummaryThebasicelementsfor113Forexample(Genomebased)以小麥胞質(zhì)G-6-PDcDNA序列為信息探針在GenBank水稻nr數(shù)據(jù)庫中找高度同源的基因組序列人工序列拼接RT-PCR確認得到水稻G-6-PD全長cDNA水稻G-6-PDcDNA的電子克隆根據(jù)intron的GU……AG編碼規(guī)則，確定IandE的排布Forexample(Genomebased)以小麥胞114objective:Insilicocloningaimstoprovideabioinformaticsapproachtofindthemostpromisingcandidategenesinacandidateregionindicatedbyquantitativetraitloci(數(shù)量性狀基因座位,數(shù)量性狀基因定位,QTLs).AsthereareusuallyhundredsofgenesinaQTLregion,narrowingthemdowntoasmallernumberisofthemostimportancetoproceedtofurthervalidationsteps.Herewerepresentourstrategytorankthembyutilizingvariousbiologicalknowledgesuchasgeneannotations,MeSHtermsandmetabolicpathways.objective:Insilicocloninga115克隆的HBVDNA分離編碼HBsAg序列酵母表達載體連接酵母啟動子酵母轉(zhuǎn)錄終止子細菌復(fù)制起點AMPR酵母復(fù)制起點LEU2轉(zhuǎn)化酵母細胞在缺乏Leu的培養(yǎng)基中生長，選出含載體的酵母細胞發(fā)酵培養(yǎng)離心分離破壞酵母細胞提純HBsAg粒子Turnto99克隆的HBV分離編碼HBsAg序列酵母表達載體連接酵母啟動116DNA重組DNArecombination不同來源的DNA分子通過共價連接重新組合成為一新的DNA分子，這一過程稱之重組DNA(RecombinantDNA)ThenewDNAmoleculethathasbeenmadebyjoiningtheDNAfragmentsiscalledarecombinantDNAmoleculeorrecombinantDNADNA重組DNArecombination重組DN117DNA重組技術(shù)DNArecombinationtechnique

應(yīng)用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（目的基因）與載體DNA結(jié)合成為一具有自我復(fù)制能力的DNA分子，繼而轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增、提取獲得大量同一DNA分子拷貝，這一技術(shù)即稱為DNArecombinationtechnique、DNAcloningorGenecloning,Molecularcloning.DNA重組技術(shù)DNArecombinationt118基因工程Geneticengineering

將基因進行克隆，并利用克隆的基因表達、制備特定的蛋白或多肽產(chǎn)物，或定向改造細胞乃至生物個體的特性所用的方法及相關(guān)的工作統(tǒng)稱為基因工程(geneticengineering)基因工程Geneticengineering119含重組體的為白色菌落，不含者為藍色菌落Turnto64含重組體的為白色菌落，不含者為藍色菌落Turnto64120菌落原位雜交Turnto64菌落原位雜交Turnto64121M1‘23456789101kb圖2b.經(jīng)EcoRI酶切的陽性質(zhì)粒電泳圖M----1KbDNAladder1∽10,經(jīng)EcoRI酶切的陽性質(zhì)粒M12345678910圖2a.陽性克隆質(zhì)粒電泳圖M----1KbDNAladder1∽10,陽性質(zhì)粒A.beforecutwithREB.aftercutwithRE酶切鑒定Turnto64M1‘23456789101kb圖2b.經(jīng)EcoRI酶切122回文詩欣賞?有一次蘇軾專程上門拜訪秦觀。家人告訴蘇軾，他出外游玩，很可能上佛印和尚寺里去了。于是蘇軾寫信去詢問他的情況。秦少游見蘇軾來信后，便寫了一封只有14字的怪信遣人帶回給蘇軾。信上的14個字排成一圈：暮

已賞

時花

醒歸

微去

力馬

酒如

飛蘇軾看后，連聲叫好。原來，秦觀寫的是一首回文詩，詩中描述了他在外出游玩的生活和情趣。其內(nèi)容為：“賞花歸去馬如飛，去馬如飛酒力微。酒力微醒時已暮，醒時已暮賞花歸?！?4個字組成了一首七言絕句，每個字出現(xiàn)兩次，文字處理技巧高超?；匚脑娦蕾p?有一次蘇軾專程上門拜訪秦觀。家人告訴蘇軾，他123分子生物學基因工程與基因體外表達課件分子生物學基因工程與基因體外表達課件124第十三章基因工程與基因體外表達GeneEngineeringandGeneExpression第十三章基因工程與基因體外表達GeneEngineerin125目的與意義1.獲得感興趣的目的基因2.研究基因結(jié)構(gòu)特征3.表達基因產(chǎn)物4.研究基因功能目的與意義1.獲得感興趣的目的基因2.研究基因結(jié)構(gòu)特征3.表126基本要素1.目的基因(targetgenes)2.工具酶(toolenzymes)3.載體(vectors)4.宿主細胞(hostcells)基本要素1.目的基因(targetgenes)2.工127Maincontents

工具酶DNA載體基因克隆過程真核細胞基因轉(zhuǎn)染基因改造克隆基因表達電子克隆基本概念及背景Maincontents工具酶DNA載體基因克隆過程真128ForExample

如何從植物中克隆法呢基焦磷酸合酶(FPS)?1.查資料認識FPS2.設(shè)計實驗方案3.可行性分析ForExample如何從植物中克隆法呢基焦磷酸合酶(129ForExample

ForExample130FPS克?。篟T-PCR，3'-RACE，5'-RACE改進的異硫氰酸胍一步法提取三七根部總RNART-PCR擴增fps部分保守序列3’-RACE及克隆測序5’-RACE及克隆測序序列拼接FPS克?。篟T-PCR，3'-RACE，5'-RA131mRNA:5’AAAAAA3’TTTTTTT-接頭cDNA:OligodT接頭基因特異性引物3’FullRACE原理圖mRNA:5’1325’FullRACE原理圖(1)P5’-端磷酸化RT-Primer未知區(qū)域已知序列TargetmRNAAAAAAAAA-----5’AAAAAAAA-----5’P未知區(qū)域逆轉(zhuǎn)錄RNA分解P未知區(qū)域未知區(qū)域S1A1S2A21stPCRprimers2ndPCRprimers用RNAligase進行環(huán)化或形成首尾連接物未知區(qū)域1stand2ndPCR5’-端磷酸化RTprimer部位包含未知的5‘上游區(qū)域的擴增產(chǎn)物(2)(3)(4)5’FullRACE原理圖(1)P5’-端磷酸化RT-133ThankYouThankYou134DN