放射免疫分析課件

放射免疫分析31、園日涉以成趣，門雖設(shè)而常關(guān)。32、鼓腹無所思。朝起暮歸眠。33、傾壺絕余瀝，窺灶不見煙。34、春秋滿四澤，夏云多奇峰，秋月?lián)P明輝，冬嶺秀孤松。35、丈夫志四海，我愿不知老。放射免疫分析放射免疫分析31、園日涉以成趣，門雖設(shè)而常關(guān)。32、鼓腹無所思。朝起暮歸眠。33、傾壺絕余瀝，窺灶不見煙。34、春秋滿四澤，夏云多奇峰，秋月?lián)P明輝，冬嶺秀孤松。35、丈夫志四海，我愿不知老。第四章放射免疫分析2目的與要求：掌握放射免疫分析的基本原理，實驗室配置及質(zhì)量控制。內(nèi)容：放射免疫分析(RIA)是由Yalow和Berson于1960年創(chuàng)建的一種體外放射分析技術(shù)。這是檢驗專業(yè)學(xué)生必須掌握和重點。3放射免疫分析31、園日涉以成趣，門雖設(shè)而常關(guān)。放射免疫分析放放射免疫分析課件放射免疫分析課件放射免疫分析課件放射免疫分析課件3、標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原之和多于物質(zhì)異性抗體結(jié)合位點。這樣當(dāng)反應(yīng)達到平稀時，標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物的生成量受非標(biāo)記抗原數(shù)量的制約。例如：非標(biāo)記抗原數(shù)量增加時，就會抑制標(biāo)記抗原與抗體的結(jié)合，標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物的生成量就減少，未與抗體結(jié)合的標(biāo)記抗原的數(shù)量加。這種特異性的競爭性抑制的數(shù)量關(guān)系就是放射免疫分析的定量基礎(chǔ)。標(biāo)記抗原與被測物質(zhì)間的數(shù)量關(guān)系可以用抑制曲線來表示。這種曲線表示了結(jié)合抑制的程度與抑制物濃度兩者之間的特定函數(shù)關(guān)系，也稱為劑量反應(yīng)曲線。63、標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原之和多于物質(zhì)異性抗體結(jié)合位點。二、劑量反應(yīng)曲線劑量反應(yīng)曲線又稱標(biāo)準(zhǔn)曲線。是放射免疫分析定量的基礎(chǔ)，是衡量物質(zhì)濃度的客觀尺度(一)標(biāo)準(zhǔn)曲線的手工繪制形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)曲線的形態(tài)可因所用的反應(yīng)變量表達形式的不同，或所采用坐標(biāo)系統(tǒng)不同而有不同的形態(tài)。(二)標(biāo)準(zhǔn)曲線的基本數(shù)學(xué)函數(shù)式放射免疫分析從抗原抗體反應(yīng)動力學(xué)分析，反應(yīng)是雙向性的，服從質(zhì)量作用定律。7二、劑量反應(yīng)曲線7(三)掌握親和常數(shù)K值的計算、意義及應(yīng)用、平衡常數(shù)K又稱親和常數(shù)，或叫做結(jié)合常數(shù)。該常數(shù)對特定的抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)是固定不變的。K的單位為1mol或L/mol。其意義在于可用K值反映抗體之間的親和力。K值與游離抗體濃度呈反比關(guān)系。K值越大，則游離的抗體濃度［Ab］越小，結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物［Ag-Ab］濃度越大。即抗原抗體的結(jié)合力越大。K值是與抗原抗體共同相關(guān)的數(shù)值，不能認(rèn)為僅僅是抗體(或抗原)之間的K值。目前，國內(nèi)外有多種計算K值的方法，有的非常復(fù)雜，而通常使用的方法是Scatchard分析作圖法。8(三)掌握親和常數(shù)K值的計算、意義及應(yīng)用、平衡常數(shù)K(四)掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率對測定的影響標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率對放射免疫分析方法的靈敏度和精密度均有影響。影響標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的因素：1、親和常數(shù)K2、標(biāo)記抗原和標(biāo)準(zhǔn)抗原的用量3、特異性抗體的用量(五)掌握Bo(總結(jié)合)、T(總管)、NSB的概念9(四)掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率對測定的影響標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率對放射免第二節(jié)放射免疫分析方法學(xué)一、掌握建立放射免疫分析方法的必備條件(一)對標(biāo)準(zhǔn)抗原的基本要求(1)標(biāo)準(zhǔn)抗朱與待測抗原的免疫性必須一致，即它們與抗體的親和力和特異性應(yīng)相同。標(biāo)準(zhǔn)抗原與待測抗原所處的介質(zhì)條件應(yīng)基本相同。(2)抗原必須純度度。(3)標(biāo)準(zhǔn)抗原的量必須準(zhǔn)確。(4)標(biāo)準(zhǔn)抗原應(yīng)有很好的穩(wěn)定性。10第二節(jié)放射免疫分析方法學(xué)10(二)對抗血清的要求抗血清中含有對其相應(yīng)抗原的特異性抗體。目前常以抗原免疫年輕、健康的純種小動物而誘發(fā)產(chǎn)生多克隆抗體，選取抗體滴度高的血清，為RIA所用?？寡宓馁|(zhì)量直接影響放射免疫分析方法的靈活敏度和特異性。檢查抗血清質(zhì)量的指標(biāo)主要有親和常數(shù)(K)、免疫交叉反應(yīng)率及滴度(或抗體效價)。11(二)對抗血清的要求11(三)對標(biāo)記抗原的要求標(biāo)記抗原是放射性測定的依據(jù)，對標(biāo)記抗原的基本要求：1、標(biāo)記抗原的免疫活性與待測抗原及標(biāo)準(zhǔn)品必須一致。2、標(biāo)記抗原要有適當(dāng)高的放射性比活度。3、標(biāo)記抗原應(yīng)具有足夠高的放射化學(xué)純度12(三)對標(biāo)記抗原的要求12(四)分離B與F的方法理想分離應(yīng)滿足如下要求：1、分離B、F完全、快速。2、不影響免疫反應(yīng)的平衡條件。3、不受分離操作時的環(huán)境因素(如pH、溫度等)的影響。4、操作簡便，分離試劑的來源豐富且價廉。13(四)分離B與F的方法13目前的分離方法有：1、非特異性分離法(1)吸附法：利用表面活性物質(zhì)將反應(yīng)的液中小分子游離部分F吸附，通過離心，將F沉淀，使大分子結(jié)合物B留在上清液中，而達到分離的目的。(2)過濾法：反應(yīng)液中B與F混合物在通過一定規(guī)格孔徑的濾膜時，大分子不會通過濾膜孔被阻留在濾膜上，小分子游離的放射性物質(zhì)F被抽吸通過濾膜而分離。(3)沉淀法。14目前的分離方法有：142、特異性分離法(1)雙抗法(Ab2法)：應(yīng)用抗IgG的第二抗體來分離B和F的方法稱為雙抗體法。雙抗體法具有特異、高效、非特異性結(jié)合低、重復(fù)性好等優(yōu)點。在使用此法時，往往加入適量的第一抗體同種動物血清作載體。同時第二抗體必須是過量(但也不宜過大)，且以不影響反應(yīng)平衡為宜.(2)固相分離法：將特性抗體(第一或第二抗體)或抗原結(jié)合在固相物質(zhì)。(3)金黃色葡萄球菌A蛋白分離法。152、特異性分離法15二、掌握放射免疫分析的設(shè)計方法：(一)標(biāo)譏抗原和抗體用量最佳化設(shè)計。1、標(biāo)記抗原用量選擇。2、抗血清的使用滴度選擇及其方法。(二)標(biāo)準(zhǔn)抗原劑量設(shè)計1、標(biāo)準(zhǔn)抗原劑量范圍2、標(biāo)準(zhǔn)曲線工作范圍(三)加樣順序設(shè)計(四)反應(yīng)介質(zhì)16二、掌握放射免疫分析的設(shè)計方法：16(五)反應(yīng)容積與溫度及時間1、反應(yīng)容積縮小反應(yīng)容積可相應(yīng)減少抗體和標(biāo)記抗原的絕對用量，使非標(biāo)記抗原的競爭力相應(yīng)增強，有利于提高靈敏度，使反應(yīng)試劑消耗減少。2、溫育溫度和時間抗原、抗體結(jié)合反應(yīng)的平衡結(jié)合常數(shù)K與溫度有關(guān)必須通過實驗來確定最佳工作條件。(六)B與F分離方法選擇(七)樣品采集與保存17(五)反應(yīng)容積與溫度及時間17第四節(jié)放射免疫分析的質(zhì)量控制一、掌握誤差和放射免疫誤差的來源(一)誤差及其分類(二)放射免疫分析誤差來源二、掌握質(zhì)量控制與質(zhì)控樣品(一)放射免疫分析的質(zhì)量控制內(nèi)容(二)質(zhì)量控制樣品18第四節(jié)放射免疫分析的質(zhì)量控制18三、掌握質(zhì)量控制指標(biāo)：靈敏度、精密度、偏倚和準(zhǔn)確度、特異性、穩(wěn)定性、臨床有效性。四、掌握實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制：精密度的評價、批內(nèi)偏倚的評價和批間重現(xiàn)性評價。五、掌握實驗室間的外部質(zhì)量評價。19三、掌握質(zhì)量控制指標(biāo)：靈敏度、精密度、偏倚和準(zhǔn)確度、特異性、END16、業(yè)余生活要有意義，不要越軌?！A盛頓

17、一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息?！_素·貝克

18、最大的挑戰(zhàn)和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人。——馬云

19、自己活著，就是為了使別人過得更美好?！卒h

20、要掌握書，莫被書掌握；要為生而讀，莫為讀而生?！紶栁諩ND16、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。——華盛頓放射免疫分析31、園日涉以成趣，門雖設(shè)而常關(guān)。32、鼓腹無所思。朝起暮歸眠。33、傾壺絕余瀝，窺灶不見煙。34、春秋滿四澤，夏云多奇峰，秋月?lián)P明輝，冬嶺秀孤松。35、丈夫志四海，我愿不知老。放射免疫分析放射免疫分析31、園日涉以成趣，門雖設(shè)而常關(guān)。32、鼓腹無所思。朝起暮歸眠。33、傾壺絕余瀝，窺灶不見煙。34、春秋滿四澤，夏云多奇峰，秋月?lián)P明輝，冬嶺秀孤松。35、丈夫志四海，我愿不知老。第四章放射免疫分析2目的與要求：掌握放射免疫分析的基本原理，實驗室配置及質(zhì)量控制。內(nèi)容：放射免疫分析(RIA)是由Yalow和Berson于1960年創(chuàng)建的一種體外放射分析技術(shù)。這是檢驗專業(yè)學(xué)生必須掌握和重點。3放射免疫分析31、園日涉以成趣，門雖設(shè)而常關(guān)。放射免疫分析放放射免疫分析課件放射免疫分析課件放射免疫分析課件放射免疫分析課件3、標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原之和多于物質(zhì)異性抗體結(jié)合位點。這樣當(dāng)反應(yīng)達到平稀時，標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物的生成量受非標(biāo)記抗原數(shù)量的制約。例如：非標(biāo)記抗原數(shù)量增加時，就會抑制標(biāo)記抗原與抗體的結(jié)合，標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物的生成量就減少，未與抗體結(jié)合的標(biāo)記抗原的數(shù)量加。這種特異性的競爭性抑制的數(shù)量關(guān)系就是放射免疫分析的定量基礎(chǔ)。標(biāo)記抗原與被測物質(zhì)間的數(shù)量關(guān)系可以用抑制曲線來表示。這種曲線表示了結(jié)合抑制的程度與抑制物濃度兩者之間的特定函數(shù)關(guān)系，也稱為劑量反應(yīng)曲線。263、標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原之和多于物質(zhì)異性抗體結(jié)合位點。二、劑量反應(yīng)曲線劑量反應(yīng)曲線又稱標(biāo)準(zhǔn)曲線。是放射免疫分析定量的基礎(chǔ)，是衡量物質(zhì)濃度的客觀尺度(一)標(biāo)準(zhǔn)曲線的手工繪制形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)曲線的形態(tài)可因所用的反應(yīng)變量表達形式的不同，或所采用坐標(biāo)系統(tǒng)不同而有不同的形態(tài)。(二)標(biāo)準(zhǔn)曲線的基本數(shù)學(xué)函數(shù)式放射免疫分析從抗原抗體反應(yīng)動力學(xué)分析，反應(yīng)是雙向性的，服從質(zhì)量作用定律。27二、劑量反應(yīng)曲線7(三)掌握親和常數(shù)K值的計算、意義及應(yīng)用、平衡常數(shù)K又稱親和常數(shù)，或叫做結(jié)合常數(shù)。該常數(shù)對特定的抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)是固定不變的。K的單位為1mol或L/mol。其意義在于可用K值反映抗體之間的親和力。K值與游離抗體濃度呈反比關(guān)系。K值越大，則游離的抗體濃度［Ab］越小，結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物［Ag-Ab］濃度越大。即抗原抗體的結(jié)合力越大。K值是與抗原抗體共同相關(guān)的數(shù)值，不能認(rèn)為僅僅是抗體(或抗原)之間的K值。目前，國內(nèi)外有多種計算K值的方法，有的非常復(fù)雜，而通常使用的方法是Scatchard分析作圖法。28(三)掌握親和常數(shù)K值的計算、意義及應(yīng)用、平衡常數(shù)K(四)掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率對測定的影響標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率對放射免疫分析方法的靈敏度和精密度均有影響。影響標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的因素：1、親和常數(shù)K2、標(biāo)記抗原和標(biāo)準(zhǔn)抗原的用量3、特異性抗體的用量(五)掌握Bo(總結(jié)合)、T(總管)、NSB的概念29(四)掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率對測定的影響標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率對放射免第二節(jié)放射免疫分析方法學(xué)一、掌握建立放射免疫分析方法的必備條件(一)對標(biāo)準(zhǔn)抗原的基本要求(1)標(biāo)準(zhǔn)抗朱與待測抗原的免疫性必須一致，即它們與抗體的親和力和特異性應(yīng)相同。標(biāo)準(zhǔn)抗原與待測抗原所處的介質(zhì)條件應(yīng)基本相同。(2)抗原必須純度度。(3)標(biāo)準(zhǔn)抗原的量必須準(zhǔn)確。(4)標(biāo)準(zhǔn)抗原應(yīng)有很好的穩(wěn)定性。30第二節(jié)放射免疫分析方法學(xué)10(二)對抗血清的要求抗血清中含有對其相應(yīng)抗原的特異性抗體。目前常以抗原免疫年輕、健康的純種小動物而誘發(fā)產(chǎn)生多克隆抗體，選取抗體滴度高的血清，為RIA所用?？寡宓馁|(zhì)量直接影響放射免疫分析方法的靈活敏度和特異性。檢查抗血清質(zhì)量的指標(biāo)主要有親和常數(shù)(K)、免疫交叉反應(yīng)率及滴度(或抗體效價)。31(二)對抗血清的要求11(三)對標(biāo)記抗原的要求標(biāo)記抗原是放射性測定的依據(jù)，對標(biāo)記抗原的基本要求：1、標(biāo)記抗原的免疫活性與待測抗原及標(biāo)準(zhǔn)品必須一致。2、標(biāo)記抗原要有適當(dāng)高的放射性比活度。3、標(biāo)記抗原應(yīng)具有足夠高的放射化學(xué)純度32(三)對標(biāo)記抗原的要求12(四)分離B與F的方法理想分離應(yīng)滿足如下要求：1、分離B、F完全、快速。2、不影響免疫反應(yīng)的平衡條件。3、不受分離操作時的環(huán)境因素(如pH、溫度等)的影響。4、操作簡便，分離試劑的來源豐富且價廉。33(四)分離B與F的方法13目前的分離方法有：1、非特異性分離法(1)吸附法：利用表面活性物質(zhì)將反應(yīng)的液中小分子游離部分F吸附，通過離心，將F沉淀，使大分子結(jié)合物B留在上清液中，而達到分離的目的。(2)過濾法：反應(yīng)液中B與F混合物在通過一定規(guī)格孔徑的濾膜時，大分子不會通過濾膜孔被阻留在濾膜上，小分子游離的放射性物質(zhì)F被抽吸通過濾膜而分離。(3)沉淀法。34目前的分離方法有：142、特異性分離法(1)雙抗法(Ab2法)：應(yīng)用抗IgG的第二抗體來分離B和F的方法稱為雙抗體法。雙抗體法具有特異、高效、非特異性結(jié)合低、重復(fù)性好等優(yōu)點。在使用此法時，往往加入適量的第一抗體同種動物血清作載體。同時第二抗體必須是過量(但也不宜過大)，且以不影響反應(yīng)平衡為宜.(2)固相分離法：將特性抗體(第一或第二抗體)或抗原結(jié)合在固相物質(zhì)。(3)金黃色葡萄球菌A蛋白分離法。352、特異性分離法15二、掌握放射免疫分析的設(shè)計方法：(一)標(biāo)譏抗原和抗體用量最佳化設(shè)計。1、標(biāo)記抗原用量選擇。2、抗血清的使用滴度選擇及其方法。(二)標(biāo)準(zhǔn)抗原劑量設(shè)計1、標(biāo)準(zhǔn)抗原劑量范圍2、標(biāo)準(zhǔn)曲線工作范圍(三)加樣順序設(shè)計(四)反應(yīng)介質(zhì)36二、掌握放射免疫分析的設(shè)計方法：16(五)反應(yīng)容積與溫度及時間1、反應(yīng)容積縮小反應(yīng)