感染性疾病的分子診斷課件

感染性疾病的分子診斷感染性疾病的分子診斷1感染的慨念

感染是病原體和人體之間的相互作用過(guò)程病原微生物：致病菌（條件致病菌）微生物人體微生物人體不同的感染狀態(tài)共生狀態(tài)在正常情況下，人體的一些腔道和體表均有微生物寄生感染的慨念感染是病原體和人體之間的相互作用過(guò)程微人微人不共感染性疾?。河赡撤N病原體所致，通過(guò)不同方式引起人體發(fā)生感染并出現(xiàn)臨床癥狀的疾病。病原體：病毒、細(xì)菌、原蟲(chóng)、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、寄生蟲(chóng)。

感染性疾?。河赡撤N病原體所致，通過(guò)不同方式引起人體發(fā)生感染并常規(guī)檢測(cè)方法：免疫學(xué)方法微生物學(xué)方法受敏感性、特異性限制，不易早期診斷，并且不易提供病原體分型及耐藥性方面的信息。常規(guī)檢測(cè)方法：感染性疾病的分子診斷策略一般性策略（檢出病原體）：判斷有無(wú)感染是何種病原體感染常用方法：PCR＋雜交完整性策略：檢出病原體分型（分類(lèi)）－亞型－耐藥性常用方法：雜交、PCR、基因芯片、DNA測(cè)序感染性疾病的分子診斷策略一般性策略（檢出病原體）：感染性疾病分子診斷標(biāo)志物病原體核酸分子（DNA/RNA）基因表達(dá)產(chǎn)物代謝物免疫應(yīng)答分子細(xì)胞免疫體液免疫TT致敏T細(xì)胞淋巴因子B漿細(xì)胞IgMIgGIgAIgDIgE感染早期出現(xiàn)臨近恢復(fù)期出現(xiàn)與原蟲(chóng)和蠕蟲(chóng)感染有關(guān)感染性疾病分子診斷標(biāo)志物病原體核酸分子（DNA/RNA）細(xì)體二、感染性疾病分子診斷的常用方法

根據(jù)目的基因是否被放大，可分為雜交法和擴(kuò)增法。信號(hào)放大技術(shù)檢測(cè)方法靶分子數(shù)目不變，而檢測(cè)的探針信號(hào)放大

采用多酶、多探針或二者結(jié)合等方法來(lái)增加探針標(biāo)志物的濃度使檢測(cè)信號(hào)得到放大。靶分子擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)方法靶分子（RNA、DNA或探針）的擴(kuò)增PCR、替代擴(kuò)增、LCR等二、感染性疾病分子診斷的常用方法根據(jù)目的基因是否被放大擴(kuò)增的靶序列：編碼外膜蛋白Ⅲ的結(jié)構(gòu)基因，或16SrRNA基因、CPPB基因（同時(shí)存在于染色體及質(zhì)粒上）合多個(gè)側(cè)鏈HIV表型主要依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶基因突變的檢測(cè)RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA整合到宿主基因組中復(fù)制，以被感染細(xì)胞DNA為模板PCR擴(kuò)增；B型和C型主要存在于亞洲人群流感病毒的診斷過(guò)去主要靠雞胚羊膜腔培養(yǎng)和血清學(xué)血凝抑制試驗(yàn)，這些方法比較費(fèi)時(shí)，靈敏度低，難以作出早期診斷。gag基因5’-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3’342外膜蛋白Ⅲ5’-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3’494衣原體是介于立克次氏體與病毒之間，能通過(guò)細(xì)菌濾器，專(zhuān)性活細(xì)胞內(nèi)寄生的一類(lèi)原核生物。PCR法敏感、特異、簡(jiǎn)便、快速，并且可用于流感病毒的分型和流行病學(xué)調(diào)查。5’-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3’241(bp)有8個(gè)RNA片段或7個(gè)RNA片段；沙眼衣原體感染常缺乏特異癥狀，易形成隱匿感染，分子診斷技術(shù)敏感性和特異性高，適用于早期診斷和無(wú)癥狀攜帶者的檢查；感染性疾?。河赡撤N病原體所致，通過(guò)不同方式引起人體發(fā)生感染并出現(xiàn)臨床癥狀的疾病。Dane顆粒（完整的病毒）形態(tài)條件致病菌：正常菌群與人體平衡破壞，引起疾病的一類(lèi)細(xì)菌；病毒載量檢測(cè)：在臨床進(jìn)展情況的判定及療效觀察上極有價(jià)值。C區(qū)編碼HBeAg、HBcAg整個(gè)反應(yīng)過(guò)程由三種酶控制，循環(huán)次數(shù)少，忠實(shí)性高,其擴(kuò)增效率高于PCR，特異性好。5’-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3’241(bp)引物A

靶RNA

引物B

RNAcDNA

RT

3'5'5'5'3'5'3'5'3'cDNA

cDNA模板

5'5'3'3'5'3'引物B

RNAseH

RT

T7RNA聚合酶

100-1000RNA擴(kuò)增子5'3'5'3'3'5'3'5'引物A

3'5'5'RNAseH

RNA

RNA

cDNA

cDNA

圖8-3NASBA原理示意圖引物A5’端帶有T7RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，3’端堿基與靶RNA3’端序列互補(bǔ);引物B的堿基序列與cDNA3’端序列互補(bǔ)擴(kuò)增的靶序列：編碼外膜蛋白Ⅲ的結(jié)構(gòu)基因，或16SrRNA基因nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA)nucleicacidsequence-basedam我國(guó)流行的主要是B和C基因型，長(zhǎng)江以北以C型為主，長(zhǎng)江以南以B型為主，另又少量的A型、D型和混合型。HBVDNA3.擴(kuò)增的靶序列：編碼外膜蛋白Ⅲ的結(jié)構(gòu)基因，或16SrRNA基因、CPPB基因（同時(shí)存在于染色體及質(zhì)粒上）疾病狀況的判斷檢測(cè)出病原體的存在并不能說(shuō)此病原體就是引起疾病的直接原因。DNA重復(fù)序列5’-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3’245信號(hào)檢測(cè)：bDNA可結(jié)合很多酶標(biāo)探針，酶催化底物（1,2-二惡二酮，dioxetane）發(fā)光，使核酸信號(hào)放大，且發(fā)光強(qiáng)度與DNA量成正比。對(duì)疑似病例的診斷和鑒別診斷。我國(guó)流行的主要是B和C基因型，長(zhǎng)江以北以C型為主，長(zhǎng)江以南以B型為主，另又少量的A型、D型和混合型。三、感染性疾病分子診斷的標(biāo)本處理分為甲(A)、乙(B)和丙(C)3個(gè)型別;常用方法：PCR＋雜交操作簡(jiǎn)便，省時(shí)，易于普及受敏感性、特異性限制，不易早期診斷，并且不易提供病原體分型及耐藥性方面的信息。靶分子擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)方法Dane顆粒（完整的病毒）形態(tài)病原體：病毒、細(xì)菌、原蟲(chóng)、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、寄生蟲(chóng)分型（分類(lèi)）－亞型－耐藥性靶序列引物序列擴(kuò)增片斷（bp）NASBA的特點(diǎn)為操作簡(jiǎn)便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程由三種酶控制，循環(huán)次數(shù)少，忠實(shí)性高,其擴(kuò)增效率高于PCR，特異性好。

我國(guó)流行的主要是B和C基因型，長(zhǎng)江以北以C型為主，長(zhǎng)江以南以引物A

靶RNA

引物B

RNAcDNA

RT

3'5'5'5'3'5'3'5'3'cDNA

cDNA模板

5'5'3'3'5'3'引物B

RNAseH

RT

T7RNA聚合酶

100-1000RNA擴(kuò)增子5'3'5'3'3'5'3'5'引物A

3'5'5'RNAseH

RNA

RNA

cDNA

cDNA

圖8-3NASBA原理示意圖引物A5’端帶有T7RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，3’端堿基與靶RNA3’端序列互補(bǔ);引物B的堿基序列與cDNA3’端序列互補(bǔ)引物A靶RNA引物BRNAcDNART3'5'5'nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA)nucleicacidsequence-basedamNASBA的特點(diǎn)為操作簡(jiǎn)便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程由三種酶控制，循環(huán)次數(shù)少，忠實(shí)性高,其擴(kuò)增效率高于PCR，特異性好。

NASBA的特點(diǎn)為操作簡(jiǎn)便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)。整個(gè)三、感染性疾病分子診斷的標(biāo)本處理標(biāo)本采集處理主要包括選擇合適的標(biāo)本種類(lèi)、標(biāo)本量、抗凝劑等及對(duì)標(biāo)本進(jìn)行合適的傳送、保存和預(yù)處理。三、感染性疾病分子診斷的標(biāo)本處理標(biāo)本采集處理主要包括選擇合適四、感染性疾病分子診斷的結(jié)果解釋1.陰性結(jié)果假陰性可能性方法的靈敏度太低方法失敗目標(biāo)分子2.陽(yáng)性結(jié)果假陽(yáng)性可能性方法的特異性受到污染四、感染性疾病分子診斷的結(jié)果解釋1.陰性結(jié)果假陰性可能性3.定性檢測(cè)結(jié)果有時(shí)不能提供病原體活力相關(guān)信息臨床治療病情緩解后一定時(shí)間內(nèi)，在患者樣本中仍可以檢測(cè)出相應(yīng)的病原體。有些病原體潛伏在進(jìn)體內(nèi)，沒(méi)有臨床癥狀。4.疾病狀況的判斷檢測(cè)出病原體的存在并不能說(shuō)此病原體就是引起疾病的直接原因。該病原體可能是一種正常菌群

3.定性檢測(cè)結(jié)果有時(shí)不能提供病原體活力相關(guān)信息五、感染性疾病分子診斷的臨床應(yīng)用及評(píng)價(jià)用于感染性疾病治療的監(jiān)控和預(yù)測(cè)、病情發(fā)展過(guò)程的危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)及疾病預(yù)后等。耐藥性的檢測(cè)細(xì)菌的分型流行病調(diào)查五、感染性疾病分子診斷的臨床應(yīng)用及評(píng)價(jià)用于感染性疾病治療的監(jiān)第一節(jié)病毒的基因檢測(cè)人類(lèi)許多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝炎、腦炎、流行性感冒等等，占人類(lèi)傳染疾病的75%左右。400多種不同病毒。病毒結(jié)構(gòu)：大?。?0-300nm

核心區(qū)：核酸（DNA或RNA）外周衣殼：蛋白質(zhì)包膜：脂質(zhì)（鑲嵌有蛋白質(zhì)）第一節(jié)病毒的基因檢測(cè)人類(lèi)許多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝

我國(guó)是HBV高流行區(qū)，50%－70%的人受過(guò)感染，8%－10%是HBV攜帶者，肝炎患者中60%是慢性肝炎患者，導(dǎo)致肝硬變，HBV又與原發(fā)性肝癌密切相關(guān)。外殼（HBsAg):外殼蛋白成分為表面抗原核心（HBcAg)：DNADNA聚合酶

HBcAg一、乙型肝炎病毒我國(guó)是HBV高流行區(qū)，50%－70%的人受過(guò)感染，8Dane顆粒（完整的病毒）形態(tài)HBsAgHBcAgHBVDNADNAPol（外膜蛋白）（核衣殼蛋白）完整的乙肝病毒顆粒直徑42納米由雙層外殼和一個(gè)核心組成的，核心直徑為27納米，內(nèi)含DNA雙鏈和DNA多聚酶Dane顆粒（完整的病毒）形態(tài)HBsAgHBcAgHBVD（一）病毒基因組結(jié)構(gòu)3.2kb雙鏈DNA病毒不完全雙連環(huán)狀DNA

長(zhǎng)鏈L為負(fù)鏈：有4個(gè)開(kāi)放閱讀框S、C、P、XS區(qū)編碼外膜蛋白（HBsAg）

C區(qū)編碼HBeAg、HBcAgp區(qū)編碼DNA聚合酶

X區(qū)位編碼X蛋白，可能與病毒蛋白表達(dá)有關(guān)。短鏈S為正鏈：長(zhǎng)短不一（一）病毒基因組結(jié)構(gòu)3.2kb雙鏈DNA病毒gap基因5’-ATAATCCACCTATCCCAGATAGGAGAAATC-3’115操作簡(jiǎn)便，省時(shí)，易于普及最外層為囊膜，雙層脂蛋白，是病毒識(shí)別攻擊宿主細(xì)胞所必不可少的；條件致病菌：正常菌群與人體平衡破壞，引起疾病的一類(lèi)細(xì)菌；病毒載量檢測(cè)：在臨床進(jìn)展情況的判定及療效觀察上極有價(jià)值。抗生素治療效果的觀察。檢測(cè)②靶探針1⑥分子生物學(xué)：靈敏、特異，可進(jìn)行早期診斷、分型、耐藥性檢測(cè)；我國(guó)是HBV高流行區(qū)，50%－70%的人受過(guò)感染，8%－10%是HBV攜帶者，肝炎患者中60%是慢性肝炎患者，導(dǎo)致肝硬變，HBV又與原發(fā)性肝癌密切相關(guān)。包裹后的前基因mRNA細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生導(dǎo)致治療失敗、感染復(fù)發(fā)、增加昂貴抗生素的使用。喹諾酮的耐藥-DNA解旋酶的gyrA和gyrB基因擴(kuò)增的靶序列有tpp47、bmp、tpf1、tyf1、tmpA等基因。HIV表型主要依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶基因突變的檢測(cè)四、感染性疾病分子診斷的結(jié)果解釋支鏈DNA信號(hào)放大技術(shù)(bDNA）16SrRNA的rrs基因gag基因5’-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3’342telbivudineF型僅見(jiàn)于中南美洲的土著人最外層為囊膜，雙層脂蛋白，是病毒識(shí)別攻擊宿主細(xì)胞所必不可少的；pre-s1

pre-s2S

P

C

pre-c

XHBVDNA3.2kbpre-S1pre-S1蛋白pre-S2pre-S2蛋白SHBsAgpre-CHBeAgCHBcAgPDNAPXHBxAgHBV基因組結(jié)構(gòu)gap基因5’-ATAATCCACCTATCCCAGATAGHBV基因分型HBV基因序列差異的多少，可將HBV劃分為不同的基因型，至今為止已發(fā)現(xiàn)A、B、C、D、E、F、G、H共8種基因型：A型主要存在于白人，B型和C型主要存在于亞洲人群E型主要存在于西非F型僅見(jiàn)于中南美洲的土著人G型和H型很少見(jiàn)不同基因型序列長(zhǎng)度不同，主要是前S1區(qū)的不同。我國(guó)流行的主要是B和C基因型，長(zhǎng)江以北以C型為主，長(zhǎng)江以南以B型為主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南尤其是西北有較高比例的D型HBV基因分型HBV基因序列差異的多少，可將HBV劃分為不HBV在肝細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制A(n)mRNAcccDNAHBsAg

包膜負(fù)鏈DNA包裹后的前基因

mRNA傳染性HBV病毒顆粒傳染性HBV病毒顆粒部分雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶肝細(xì)胞HBV在肝細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制A(n)mRNAcccDNAHBsAg（二）分子診斷常用的免疫學(xué)檢測(cè)方法，即二對(duì)半的檢測(cè)存在窗口期，不易早期診斷。1.PCR

采用普通PCR、FQ-PCR、競(jìng)爭(zhēng)性PCR、免疫雜交PCR，可提供直接、準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷證據(jù)。引物是根據(jù)S、C、P、X基因中高度保守序列設(shè)計(jì)，決定擴(kuò)增的特異性和敏感度。（二）分子診斷常用的免疫學(xué)檢測(cè)方法，即二對(duì)半的檢測(cè)存在窗口期擴(kuò)增位置引物序列擴(kuò)增片斷（bp)

P、X基因5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’2785’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’

C基因5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’4775’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’

C基因5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’2585’-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3’

擴(kuò)增位置引物序列擴(kuò)增片斷（bp

有時(shí)為了證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行以下分析：

RLFP

斑點(diǎn)雜交

Southern雜交

有時(shí)為了證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行以下分析：2.支鏈DNA信號(hào)放大技術(shù)(bDNA）原理:①捕獲探針檢測(cè)②靶探針1

體系③靶探針2④bDNA分子:DNA主鏈上結(jié)合多個(gè)側(cè)鏈2.支鏈DNA信號(hào)放大技術(shù)(bDNA）原理:第九章：細(xì)菌感染的分子生物學(xué)檢驗(yàn)3%，另有一個(gè)7493bp的質(zhì)粒，整個(gè)基因組有894個(gè)蛋白編碼基因，其中604個(gè)(68%)編碼蛋白的功能已明確，35個(gè)(4%)編碼基因在GenBank收錄的其他細(xì)菌中有同源序列，但功能不清，剩下的255個(gè)(28%)在GenBank中沒(méi)有檢索到同源序列。喹諾酮的耐藥-DNA解旋酶的gyrA和gyrB基因（一）流感病毒基因組結(jié)構(gòu)沙眼衣原體感染常缺乏特異癥狀，易形成隱匿感染，分子診斷技術(shù)敏感性和特異性高，適用于早期診斷和無(wú)癥狀攜帶者的檢查；對(duì)疑似病例的診斷和鑒別診斷。2kb雙鏈DNA病毒現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)引起艾滋病的病毒有HIV-1、HIV-2、HIV-3三種。擴(kuò)增的靶序列：編碼外膜蛋白Ⅲ的結(jié)構(gòu)基因，或16SrRNA基因、CPPB基因（同時(shí)存在于染色體及質(zhì)粒上）梅毒螺旋體(syphilisspirochete)是人類(lèi)梅毒的病原體。流感病毒的診斷過(guò)去主要靠雞胚羊膜腔培養(yǎng)和血清學(xué)血凝抑制試驗(yàn)，這些方法比較費(fèi)時(shí)，靈敏度低，難以作出早期診斷。S區(qū)編碼外膜蛋白（HBsAg）操作簡(jiǎn)便，省時(shí)，易于普及③env基因所編碼病毒包膜蛋白，是HIV免疫學(xué)診斷的主要檢測(cè)抗原。Dane顆粒（完整的病毒）形態(tài)所有RNA片段5’末端和3’末端高度保守；擴(kuò)增的靶序列有tpp47、bmp、tpf1、tyf1、tmpA等基因。8%，共有1041個(gè)開(kāi)放閱讀框，占整個(gè)基因組的92.gap基因5’-ATAATCCACCTATCCCAGATAGGAGAAATC-3’115外膜蛋白Ⅲ5’-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3’494捕獲探針固化在微孔板上靶探針1分別與捕獲探針及待測(cè)核酸雜交靶探針2分別與待測(cè)核酸及bDNA雜交形成復(fù)合物：固相支持物捕獲探針靶探針1CEs待測(cè)核酸靶探針2LEsbDNA復(fù)合物第九章：細(xì)菌感染的分子生物學(xué)檢驗(yàn)捕獲探針固化在微孔板上固相操作簡(jiǎn)便，省時(shí)，易于普及MPB蛋白基因（結(jié)核桿菌復(fù)合群特有）連接酶鏈反應(yīng)(Ligasechainreaction，LCR)，是一種新的DNA體外擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)，主要用于點(diǎn)突變的研究及靶基因的擴(kuò)增.衣原體是介于立克次氏體與病毒之間，能通過(guò)細(xì)菌濾器，專(zhuān)性活細(xì)胞內(nèi)寄生的一類(lèi)原核生物。準(zhǔn)確、快速、早期診斷TB人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV)細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生導(dǎo)致治療失敗、感染復(fù)發(fā)、增加昂貴抗生素的使用。3%，另有一個(gè)7493bp的質(zhì)粒，整個(gè)基因組有894個(gè)蛋白編碼基因，其中604個(gè)(68%)編碼蛋白的功能已明確，35個(gè)(4%)編碼基因在GenBank收錄的其他細(xì)菌中有同源序列，但功能不清，剩下的255個(gè)(28%)在GenBank中沒(méi)有檢索到同源序列。染色體分子量980M，可編碼約5000個(gè)基因，GC含量為50%；全世界1/5人口感染，每年約300萬(wàn)死于結(jié)核，中國(guó)占70%，免疫低下個(gè)體特別是HIV感染者更易于感染結(jié)核分枝桿菌。⑤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)NS基因NS基因5’-CCATAGTAACCCATACGCATGCTG-3’⑥分子生物學(xué)：靈敏、特異，可進(jìn)行早期診斷、分型、耐藥性檢測(cè)；5’-CCAGTAGGAGAAATCTATAAAA-3’64℃50.HBVDNA>107拷貝/ml提示病毒復(fù)制活躍；5’-TTTTCACATCTACGCGGCGG-3’受到污染分支鏈DNA信號(hào)放大技術(shù)(bDNA)操作簡(jiǎn)便，省時(shí)，易于普及分支鏈DNA信號(hào)放大技術(shù)(bDNA)信號(hào)檢測(cè)：bDNA可結(jié)合很多酶標(biāo)探針，酶催化底物（1,2-二惡二酮，dioxetane）發(fā)光，使核酸信號(hào)放大，且發(fā)光強(qiáng)度與DNA量成正比。優(yōu)點(diǎn)：放大倍數(shù)確定陽(yáng)性檢出率高穩(wěn)定性和可重復(fù)性好操作簡(jiǎn)便，省時(shí)，易于普及信號(hào)檢測(cè)：bDNA可結(jié)合很多酶標(biāo)探針，酶催化底物（1,2-二3.基因芯片技術(shù)標(biāo)本經(jīng)PCR擴(kuò)增后與芯片上的特異探針進(jìn)行雜交，可以檢測(cè)：是否有病毒感染感染病毒的種類(lèi)及亞型病毒的耐藥情況特點(diǎn)：可同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測(cè)3.基因芯片技術(shù)近年來(lái)陸續(xù)上市的核苷(酸)類(lèi)似物對(duì)HBV的治療壓力集中在P區(qū)。干擾素治療對(duì)HBV的壓力主要集中在前C/C區(qū)及前S區(qū)。HBV耐藥突變lamivudineadefovirentecavirtelbivudine近年來(lái)陸續(xù)上市的核苷(酸)類(lèi)似物對(duì)HBV的治療壓力集中在P區(qū)YMDD

(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)

HBV對(duì)拉米夫定耐藥是HBVDNA聚合酶突變所致。耐藥基因位點(diǎn)(YMDD)位于聚合酶的C區(qū)(rtM2041或rtM204V)，分別是YMDD中的蛋氨酸(M)被異亮氨酸(I)或纈氨酸(V)所替代，形成YIDD或YVDD變異.拉米夫定作用靶位為HBVDNA聚合酶C區(qū)。有研究表明，拉米夫定與HBV逆轉(zhuǎn)錄酶的親和力與位于第552位氨基酸側(cè)鏈長(zhǎng)度有關(guān)，異亮氨酸和纈氨酸取代蛋氨酸，使側(cè)鏈氨基酸長(zhǎng)度縮短，使逆轉(zhuǎn)錄酶dNTP結(jié)合區(qū)增大，不適于拉米夫定結(jié)合，從而誘發(fā)耐藥性。YMDD

(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)HBV對(duì)條件致病菌：正常菌群與人體平衡破壞，引起疾病的一類(lèi)細(xì)菌；5’-AAGGGCTTTCACCGAAGAGG-3’190(bp)免疫學(xué)方法RLFP對(duì)疑似病例的診斷和鑒別診斷。HIV表型主要依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶基因突變的檢測(cè)①gag基因編碼病毒的核心蛋白；操作簡(jiǎn)便，省時(shí)，易于普及感染2周后才能逐漸產(chǎn)生病毒抗體；支鏈DNA信號(hào)放大技術(shù)(bDNA）DNA聚合酶圖8-3NASBA原理示意圖Dane顆粒（完整的病毒）形態(tài)疫情監(jiān)控和抗癆治療療效的評(píng)價(jià)NASBA最低檢測(cè)限20拷貝/mlgag基因5’-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3’342三、感染性疾病分子診斷的標(biāo)本處理檢測(cè)病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）和蛋白酶（PI）基因的序列，然后把這些結(jié)果與已知的沒(méi)有發(fā)生突變的HIV（稱(chēng)為野生株）基因序列進(jìn)行比較，與之不同的基因序列就認(rèn)為發(fā)生了突變。衣原體是介于立克次氏體與病毒之間，能通過(guò)細(xì)菌濾器，專(zhuān)性活細(xì)胞內(nèi)寄生的一類(lèi)原核生物。外膜蛋白Ⅲ5’-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3’494HBV耐藥檢測(cè)（YMDD突變檢測(cè)方法）條件致病菌：正常菌群與人體平衡破壞，引起疾病的一類(lèi)細(xì)菌；HBYMDD突變檢測(cè)方法1.基因測(cè)序法2.熒光定量PCR方法基本原理確定探針特定的TM值來(lái)區(qū)分是否突變常用方法覆蓋突變位點(diǎn)熒光雙探針雜交

YIDDYMDDYVDD46.91℃54.64℃50.74℃YMDD突變檢測(cè)方法1.基因測(cè)序法YIDD（三）臨床意義1.早期診斷免疫學(xué)檢測(cè)敏感性：0.1μg/ml

核酸雜交檢測(cè)敏感性：0.1pg/mlPCR檢測(cè)：0.1fg/ml

因此，在感染早期即可通過(guò)DNA檢測(cè)證實(shí)病毒的存在。（三）臨床意義1.早期診斷2.監(jiān)測(cè)治療效果:HBVDNA>107拷貝/ml提示病毒復(fù)制活躍；

HBVDNA＜104拷貝/ml治療有一定療效；

HBVDNA＜103拷貝/ml、HBeAg陰轉(zhuǎn)、轉(zhuǎn)氨酶正常為乙型肝炎臨床治愈指標(biāo)；3.判斷病情，指導(dǎo)制定合理的治療方案2.監(jiān)測(cè)治療效果:4.病毒耐藥性的檢測(cè)乙肝病毒DNA聚合酶YMDD處的突變是病毒產(chǎn)生耐藥性的重要原因，通過(guò)監(jiān)測(cè)YMDD的突變情況，可以獲得病毒耐藥性方面的信息，指導(dǎo)抗病毒治療。感染性疾病的分子診斷課件二、流行性感冒病毒

流行性感冒病毒(Influenzavirus)，是引起流行性感冒的病原體;分為甲(A)、乙(B)和丙(C)3個(gè)型別;根據(jù)病毒顆粒表面血凝素(Haemagglutinin

，HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuramiridase，NA)的抗原性，甲型流感病毒又可分為不同的亞型。甲型流感病毒易發(fā)生變異，致病力強(qiáng)，1918年發(fā)生在西方國(guó)家的大流感殺死了幾千萬(wàn)人，即是由甲型流感病毒引起。

Thereare16differentH

antigens

(H1toH16)andninedifferentNantigens(N1toN9).二、流行性感冒病毒Thereare16differ感染性疾病的分子診斷課件（一）流感病毒基因組結(jié)構(gòu)

單鏈RNA病毒，RNA為負(fù)鏈；有8個(gè)RNA片段或7個(gè)RNA片段；所有RNA片段5’末端和3’末端高度保守；兩種不同亞型病毒感染宿主時(shí)，會(huì)生成基因重配的新病毒；RNA基因在復(fù)制過(guò)程中常會(huì)發(fā)生點(diǎn)突變。

（一）流感病毒基因組結(jié)構(gòu)（二）分子診斷方法可采用RT-PCR、FQ-PCR檢測(cè)流感病毒RNA。引物常按流感病毒保守的非結(jié)構(gòu)基因（NS）的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。為證實(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性或提高檢測(cè)的靈敏度，可用限制性?xún)?nèi)切酶分析法、斑點(diǎn)雜交法、Southern印跡法進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的分析。

（二）分子診斷方法擴(kuò)增位置引物序列擴(kuò)增片段大小NS基因

5’-AAGGGCTTTCACCGAAGAGG-3’190(bp)5’-CCCATTCTCATTACTGCTTC-3’

NS基因

5’-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3’241(bp)

5’-TGTCAGCTATTATGGAGCTG-3’

擴(kuò)增位置引物序列DNA重復(fù)序列5’-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3’245淋病在我國(guó)性傳播疾病種中，發(fā)病率居首位。MPB蛋白基因（結(jié)核桿菌復(fù)合群特有）LCR的擴(kuò)增效率與PCR相當(dāng)，其產(chǎn)物的檢測(cè)也較方便靈敏RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA整合到宿主基因組中復(fù)制，以被感染細(xì)胞DNA為模板PCR擴(kuò)增；連接酶鏈反應(yīng)(Ligasechainreaction，LCR)，是一種新的DNA體外擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)，主要用于點(diǎn)突變的研究及靶基因的擴(kuò)增.因此，在感染早期即可通過(guò)DNA檢測(cè)證實(shí)病毒的存在。水解酶或藥物修飾酶（β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶和藥物外排系統(tǒng)等）共有4033基因，功能已知的有1734個(gè),1694個(gè)可能為新基因;合多個(gè)側(cè)鏈PCR法敏感、特異、簡(jiǎn)便、快速，并且可用于流感病毒的分型和流行病學(xué)調(diào)查。檢測(cè)病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）和蛋白酶（PI）基因的序列，然后把這些結(jié)果與已知的沒(méi)有發(fā)生突變的HIV（稱(chēng)為野生株）基因序列進(jìn)行比較，與之不同的基因序列就認(rèn)為發(fā)生了突變。根據(jù)病毒顆粒表面血凝素(Haemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuramiridase，NA)的抗原性，甲型流感病毒又可分為不同的亞型。常用方法：雜交、PCR、基因芯片、DNA測(cè)序分支鏈DNA信號(hào)放大技術(shù)(bDNA)特點(diǎn)：可同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測(cè)人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV)靶序列引物序列擴(kuò)增片斷（bp）⑥分子生物學(xué)：靈敏、特異，可進(jìn)行早期診斷、分型、耐藥性檢測(cè)；陽(yáng)性結(jié)果假陽(yáng)性可能性（三）臨床意義流感病毒的診斷過(guò)去主要靠雞胚羊膜腔培養(yǎng)和血清學(xué)血凝抑制試驗(yàn)，這些方法比較費(fèi)時(shí)，靈敏度低，難以作出早期診斷。

PCR法敏感、特異、簡(jiǎn)便、快速，并且可用于流感病毒的分型和流行病學(xué)調(diào)查。

DNA重復(fù)序列5’-CGTGAGGGCATCGAGGTGG三.人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV)HIV，humanimmunodeficiencyvirusAIDS，acquiredimmunodeficiencysyndromeHIV為艾滋病的病原體。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)引起艾滋病的病毒有HIV-1、HIV-2、HIV-3三種。1998年底艾滋病感染者和艾滋病患者總數(shù)為3.340萬(wàn)，已死亡1.390萬(wàn)，是全球十大主要死因之一。三.人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV)HIV，humanimmu最外層為囊膜，雙層脂蛋白，是病毒識(shí)別攻擊宿主細(xì)胞所必不可少的；其內(nèi)為核衣殼。最外層為囊膜，雙層脂蛋白，是病毒識(shí)別攻擊宿主細(xì)胞所必不可少的感染性疾病的分子診斷課件2.基因組結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄病毒，兩個(gè)拷貝的單股正鏈RNA；每個(gè)RNA長(zhǎng)約9.7Kb，有5’帽，3’端有多聚尾；

HIV是一種高度變異的病毒；含有g(shù)ag、env和pol三個(gè)基因以及6種調(diào)控基因tat,vif,vpr,vpx,nef,rev。

2.基因組結(jié)構(gòu)①gag基因編碼病毒的核心蛋白；②pol基因編碼病毒復(fù)制所需要的酶類(lèi)（逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶）；③env基因所編碼病毒包膜蛋白，是HIV免疫學(xué)診斷的主要檢測(cè)抗原。④調(diào)控基因編碼輔助蛋白，調(diào)節(jié)病毒蛋白合成和復(fù)制。

①gag基因編碼病毒的核心蛋白；（二）分子診斷方法抗體的檢測(cè)：酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和免疫熒光檢測(cè)法（IFA）；感染2周后才能逐漸產(chǎn)生病毒抗體；抗原的檢測(cè)：酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)P24抗原，靈敏度低（二）分子診斷方法抗體的檢測(cè)：酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和1.病毒載量檢測(cè)感染者體內(nèi)HIV的定量檢測(cè)，對(duì)病情判斷和治療效果檢測(cè)極有價(jià)值。目前常用三種技術(shù)：

RT-PCR最低檢測(cè)限50拷貝/mlbDNA最低價(jià)測(cè)限50拷貝/mlNASBA最低檢測(cè)限20拷貝/ml1.病毒載量檢測(cè)PCRRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA整合到宿主基因組中復(fù)制，以被感染細(xì)胞DNA為模板PCR擴(kuò)增；

HIV為高變異病毒，不同患者體內(nèi)分離的病毒基因結(jié)構(gòu)有差異，引物設(shè)計(jì)應(yīng)根據(jù)各編碼區(qū)的保守序列設(shè)計(jì)；靈敏度高，特別是用于無(wú)癥狀HIV感染者。

PCR擴(kuò)增位置引物序列擴(kuò)增片斷（bp)

gag基因5’-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3’3425’-CCAGTAGGAGAAATCTATAAAA-3’

gap基因5’-ATAATCCACCTATCCCAGATAGGAGAAATC-3’1155’-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATCC-3’

pol基因5‘-TAGAATTCCTCAGATCACTCTT-3’3605’-GCAAGCTTATGGGCCATCCATTCC-3’

擴(kuò)增位置引物序列擴(kuò)增片2.病毒表型和耐藥檢測(cè)HIV表型主要依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶基因突變的檢測(cè)最常用的耐藥檢測(cè)方法是基因型檢測(cè)方法,即查找與病毒耐藥有關(guān)的基因突變。檢測(cè)病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）和蛋白酶（PI）基因的序列，然后把這些結(jié)果與已知的沒(méi)有發(fā)生突變的HIV（稱(chēng)為野生株）基因序列進(jìn)行比較，與之不同的基因序列就認(rèn)為發(fā)生了突變。檢測(cè)出的任何突變都有可能導(dǎo)致形成HIV耐藥性，但具體結(jié)果的解釋必須要有非常有經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)家和醫(yī)師來(lái)進(jìn)行。2.病毒表型和耐藥檢測(cè)HIV表型主要依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶基因RT-PCR最低檢測(cè)限50拷貝/ml最外層為囊膜，雙層脂蛋白，是病毒識(shí)別攻擊宿主細(xì)胞所必不可少的；5’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’外膜蛋白Ⅲ5’-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3’494p區(qū)編碼DNA聚合酶LCR的擴(kuò)增效率與PCR相當(dāng)，其產(chǎn)物的檢測(cè)也較方便靈敏流感病毒的診斷過(guò)去主要靠雞胚羊膜腔培養(yǎng)和血清學(xué)血凝抑制試驗(yàn)，這些方法比較費(fèi)時(shí)，靈敏度低，難以作出早期診斷。衣原體是介于立克次氏體與病毒之間，能通過(guò)細(xì)菌濾器，專(zhuān)性活細(xì)胞內(nèi)寄生的一類(lèi)原核生物。兩種不同亞型病毒感染宿主時(shí)，會(huì)生成基因重配的新病毒；產(chǎn)生滅活酶和鈍化酶，如-內(nèi)酰胺酶；pol基因5‘-TAGAATTCCTCAGATCACTCTT-3’360PCR：可對(duì)無(wú)癥狀的感染者進(jìn)行早期診斷；產(chǎn)生滅活酶和鈍化酶，如-內(nèi)酰胺酶；現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)引起艾滋病的病毒有HIV-1、HIV-2、HIV-3三種。AIDS，acquiredimmunodeficiencysyndrome5’-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3’241(bp)pre-S1pre-S1蛋白感染者體內(nèi)HIV的定量檢測(cè)，對(duì)病情判斷和治療效果檢測(cè)極有價(jià)值。（三）臨床意義1.原位雜交：可以顯示病毒感染的部位；2.PCR：可對(duì)無(wú)癥狀的感染者進(jìn)行早期診斷；3.病毒載量檢測(cè)：在臨床進(jìn)展情況的判定及療效觀察上極有價(jià)值。RT-PCR最低檢測(cè)限50拷貝/ml（三）臨床意義1第九章：細(xì)菌感染的分子生物學(xué)檢驗(yàn)概述正常菌群：存在于人體表及與外界相通部位的細(xì)菌；條件致病菌：正常菌群與人體平衡破壞，引起疾病的一類(lèi)細(xì)菌；病原菌：具有毒性和侵襲力的細(xì)菌，造成人體感染；第九章：細(xì)菌感染的分子生物學(xué)檢驗(yàn)概述病原菌的診斷方法：①直接涂片法②生化試驗(yàn)③血清學(xué)試驗(yàn)④分離培養(yǎng)⑤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)⑥分子生物學(xué)：靈敏、特異，可進(jìn)行早期診斷、分型、耐藥性檢測(cè)；不能確診或進(jìn)行分型、耐藥性的檢測(cè)，或費(fèi)時(shí)等病原菌的診斷方法：不能確診或進(jìn)行分型、耐藥性的檢測(cè)，或費(fèi)時(shí)

全世界1/5人口感染，每年約300萬(wàn)死于結(jié)核，中國(guó)占70%，免疫低下個(gè)體特別是HIV感染者更易于感染結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)長(zhǎng)略帶彎曲，分枝狀，有莢膜，抗酸染色陽(yáng)性，對(duì)多種抗生素有抵抗力。一.結(jié)核分枝桿菌全世界1/5人口感染，每年約300萬(wàn)死于結(jié)核，中國(guó)形態(tài)

形態(tài)(一)基因組結(jié)構(gòu)

1.TBH37Rv株基因組是環(huán)狀雙鏈DNA，共有4411529bp;2.共有4033基因，功能已知的有1734個(gè),1694個(gè)可能為新基因;3.基因組中有許多藥物抗性因子的編碼序列，包括水解酶或者藥物修飾酶。

(一)基因組結(jié)構(gòu)感染性疾病的分子診斷課件HBVDNA3.病毒結(jié)構(gòu)：大?。?0-300nmHIV表型主要依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶基因突變的檢測(cè)nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA)流行性感冒病毒(Influenzavirus)，是引起流行性感冒的病原體;⑥分子生物學(xué)：靈敏、特異，可進(jìn)行早期診斷、分型、耐藥性檢測(cè)；水解酶或藥物修飾酶（β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶和藥物外排系統(tǒng)等）逆轉(zhuǎn)錄病毒，兩個(gè)拷貝的單股正鏈RNA；nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA)四、感染性疾病分子診斷的結(jié)果解釋感染性疾病：由某種病原體所致，通過(guò)不同方式引起人體發(fā)生感染并出現(xiàn)臨床癥狀的疾病。產(chǎn)生滅活酶和鈍化酶，如-內(nèi)酰胺酶；操作簡(jiǎn)便，省時(shí)，易于普及分支鏈DNA信號(hào)放大技術(shù)(bDNA)C基因5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’258陰性結(jié)果假陰性可能性達(dá)有關(guān)。病毒的耐藥情況X區(qū)位編碼X蛋白，可能與病毒蛋白表5’-CCATAGTAACCCATACGCATGCTG-3’最常用的耐藥檢測(cè)方法是基因型檢測(cè)方法,即查找與病毒耐藥有關(guān)的基因突變。HBVDNA3.（二）分子診斷方法普通PCR、FQ-PCR、競(jìng)爭(zhēng)性PCR、免疫雜交PCR

擴(kuò)增靶序列：

65KDa抗原基因（細(xì)菌細(xì)胞壁上蛋白）

MPB蛋白基因（結(jié)核桿菌復(fù)合群特有）

rRNA基因（種屬鑒定）

ISDNA6110插入序列（二）分子診斷方法靶序列引物序列擴(kuò)增片斷（bp）

IS6110插入5‘-CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG-3’3175’-TCAGCCGCGTCCACGCCGCCA-3’

16SrRNA5’-GGTGGTTTGTCGCGTTGTTC-3’4635’-TGCACACAGGCCACAAGGGA-3’

DNA重復(fù)序列5’-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3’2455’-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3’

靶序列引物序列擴(kuò)增片斷（bp）TB耐藥檢測(cè)利福平耐藥-RNA聚合酶rpoB基因異煙肼耐藥-katG基因鏈霉素耐藥-S12的rpsL基因

16SrRNA的rrs基因喹諾酮的耐藥-DNA解旋酶的gyrA和gyrB基因水解酶或藥物修飾酶（β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶和藥物外排系統(tǒng)等）TB耐藥檢測(cè)利福平耐藥-RNA聚合酶rpoB基因細(xì)菌耐藥基因的檢測(cè)

細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生導(dǎo)致治療失敗、感染復(fù)發(fā)、增加昂貴抗生素的使用。機(jī)理：由于細(xì)菌基因組的變異，導(dǎo)致

1.細(xì)菌細(xì)胞外膜通透性改變；

2.產(chǎn)生滅活酶和鈍化酶，如-內(nèi)酰胺酶；

3.藥物作用靶位改變；

4.代謝途徑改變；細(xì)菌耐藥基因的檢測(cè)細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生導(dǎo)致治療失敗、感染復(fù)發(fā)（三）臨床意義1.準(zhǔn)確、快速、早期診斷TB2.區(qū)分TB與其它分枝桿菌3.疫情監(jiān)控和抗癆治療療效的評(píng)價(jià)（三）臨床意義1.準(zhǔn)確、快速、早期診斷TB二、淋球菌

淋球菌是淋病的病原菌，人是淋球菌的唯一自然宿主。淋病在我國(guó)性傳播疾病種中，發(fā)病率居首位。淋球菌耐藥菌株的出現(xiàn)和流行對(duì)淋病的控制帶來(lái)很大困難。傳播途徑：1.直接性接觸感染

2.間接接觸感染

二、淋球菌淋球菌是淋病的病原菌，人是淋球菌感染性疾病的分子診斷課件（一）基因組結(jié)構(gòu)

1.染色體分子量980M，可編碼約5000個(gè)基因，GC含量為50%；

2.無(wú)操縱子結(jié)構(gòu)

3.含有1至數(shù)個(gè)質(zhì)粒（2.6MDa，24.5MDa），通過(guò)質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥性在不同菌株間的轉(zhuǎn)移；

（一）基因組結(jié)構(gòu)感染性疾病的分子診斷課件（二）分子診斷1.PCR:

擴(kuò)增的靶序列：編碼外膜蛋白Ⅲ的結(jié)構(gòu)基因，或16SrRNA基因、CPPB基因（同時(shí)存在于染色體及質(zhì)粒上）

（二）分子診斷1.PCR:靶序列引物序列擴(kuò)增片斷（bp）

CPPB基因5’-GTTTGGCTGGTTGATTCAAG-3’6335’-GCAAGATTTCCGATTTGGCG-3’

外膜蛋白Ⅲ5’-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3’4945’-TTTTCACATCTACGCGGCGG-3’

5’-CCGAAGCTCAAGACAACCTC-3’

181靶序列引物序列擴(kuò)增片斷（bp）2.LCR（Ligasechainreaction

）連接酶鏈反應(yīng)(Ligasechainreaction，LCR)，是一種新的DNA體外擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)，主要用于點(diǎn)突變的研究及靶基因的擴(kuò)增.

2.LCR（Ligasechainreaction原理：在PCR反應(yīng)體系中加入二對(duì)引物，加熱(94～95℃)使DNA變性，雙鏈打開(kāi)，然后降溫退火(65℃)，引物與模板DNA結(jié)合并留下一缺口，如果引物與模板完全互補(bǔ)，DNA連接酶即連接封閉缺口，PCR反應(yīng)接著進(jìn)行，擴(kuò)增出大量的目標(biāo)DNA.若有點(diǎn)突變，引物不能與模板精確結(jié)合，缺口附近核苷酸的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，連接酶不能封閉缺口，PCR反應(yīng)不能進(jìn)行，無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物生成，據(jù)此可判斷模板DNA中有無(wú)突變.原理：在PCR反應(yīng)體系中加入二對(duì)引物，加熱(94～95℃)感染性疾病的分子診斷課件（三）臨床意義1.分子診斷技術(shù)具有靈敏性高、快速、特異性好的優(yōu)點(diǎn)，可檢測(cè)極微量的淋球菌。2.應(yīng)用于以下幾方面：對(duì)菌株進(jìn)行分型和耐藥性分析。抗生素治療效果的觀察。進(jìn)行流行病學(xué)分析。對(duì)疑似病例的診斷和鑒別診斷。（三）臨床意義衣原體的基因檢測(cè)

衣原體是介于立克次氏體與病毒之間，能通過(guò)細(xì)菌濾器，專(zhuān)性活細(xì)胞內(nèi)寄生的一類(lèi)原核生物。沙眼衣原體是一種在人體內(nèi)長(zhǎng)期生存并又廣泛傳播的病原體，常導(dǎo)致人泌尿生殖道疾病及眼病，有15種血清型。衣原體的基因檢測(cè)一、基因組沙眼衣原體（血清型D）基因組大小1042Kbp，GC含量為41.3%，另有一個(gè)7493bp的質(zhì)粒，整個(gè)基因組有894個(gè)蛋白編碼基因，其中604個(gè)(68%)編碼蛋白的功能已明確，35個(gè)(4%)編碼基因在GenBank收錄的其他細(xì)菌中有同源序列，但功能不清，剩下的255個(gè)(28%)在GenBank中沒(méi)有檢索到同源序列。一、基因組二、分子診斷1.PCR

擴(kuò)增靶序列主要有外膜蛋白(MOMP)基因、特有質(zhì)粒DNA和rRNA基因序列。rRNA基因5’-GAAGGCGGATAATACCCGCTG-3’

5’-GATGGGGTTGAGCCATCC-3’

MOMP基因

5’-GATAGCGAGCACAAAGACTAA-3’

5’-CCATAGTAACCCATACGCATGCTG-3’

二、分子診斷2.LCRLCR的擴(kuò)增效率與PCR相當(dāng)，其產(chǎn)物的檢測(cè)也較方便靈敏三、臨床意義沙眼衣原體感染常缺乏特異癥狀，易形成隱匿感染，分子診斷技術(shù)敏感性和特異性高，適用于早期診斷和無(wú)癥狀攜帶者的檢查；

2.LCR支原體的基因檢測(cè)

肺炎支原體(mycoplasmapulmonis,MP)是原發(fā)性非典型肺炎的病原體。一、基因組結(jié)構(gòu)肺炎支原體M129株基因組有816394bp，G+C含量為40%，含677個(gè)開(kāi)放閱讀框，39個(gè)RNA編碼基因。支原體的基因檢測(cè)肺炎支原體(mycoplasmap二、分子診斷方法1.PCR

擴(kuò)增靶序列常選在16SrRNA基因組可變區(qū)與保守區(qū)、特異的染色體DNA片段、P1蛋白基因區(qū)。2.核酸雜交特異的寡核苷酸探針與樣品DNA進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，特異性好，但靈敏度不如PCR法。

二、分子診斷方法三、臨床意義因肺炎支原體與其他支原體存在共同抗原，免疫學(xué)方法檢測(cè)可出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性。

PCR方法簡(jiǎn)便快速、特異、敏感，適于早期快速檢測(cè)MP。

三、臨床意義螺旋體的基因檢測(cè)梅毒螺旋體(syphilisspirochete)是人類(lèi)梅毒的病原體。一、基因組結(jié)構(gòu)基因組大小約1000kb，為最小的原核基因組之一，GC含量為52.8%，共有1041個(gè)開(kāi)放閱讀框，占整個(gè)基因組的92.9%，每個(gè)ORF的平均大小為1023bp。螺旋體的基因檢測(cè)二、分子診斷方法1.PCR

擴(kuò)增的靶序列有tpp47、bmp、tpf1、tyf1、tmpA等基因。2.核酸雜交用同位素或非同位素(如生物素、地高辛)標(biāo)記的探針與待測(cè)標(biāo)本的DNA或擴(kuò)增后的DNA進(jìn)行斑點(diǎn)雜交。

二、分子診斷方法三、臨床意義血清學(xué)試驗(yàn)對(duì)早期梅毒診斷不敏感，對(duì)先天性和神經(jīng)性梅毒的診斷特異性差。分子診斷的方法可早期診斷梅毒感染的病人，盡早根治梅毒。

三、臨床意義感染性疾病的分子診斷感染性疾病的分子診斷89感染的慨念

感染是病原體和人體之間的相互作用過(guò)程病原微生物：致病菌（條件致病菌）微生物人體微生物人體不同的感染狀態(tài)共生狀態(tài)在正常情況下，人體的一些腔道和體表均有微生物寄生感染的慨念感染是病原體和人體之間的相互作用過(guò)程微人微人不共感染性疾病：由某種病原體所致，通過(guò)不同方式引起人體發(fā)生感染并出現(xiàn)臨床癥狀的疾病。病原體：病毒、細(xì)菌、原蟲(chóng)、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、寄生蟲(chóng)。

感染性疾?。河赡撤N病原體所致，通過(guò)不同方式引起人體發(fā)生感染并常規(guī)檢測(cè)方法：免疫學(xué)方法微生物學(xué)方法受敏感性、特異性限制，不易早期診斷，并且不易提供病原體分型及耐藥性方面的信息。常規(guī)檢測(cè)方法：感染性疾病的分子診斷策略一般性策略（檢出病原體）：判斷有無(wú)感染是何種病原體感染常用方法：PCR＋雜交完整性策略：檢出病原體分型（分類(lèi)）－亞型－耐藥性常用方法：雜交、PCR、基因芯片、DNA測(cè)序感染性疾病的分子診斷策略一般性策略（檢出病原體）：感染性疾病分子診斷標(biāo)志物病原體核酸分子（DNA/RNA）基因表達(dá)產(chǎn)物代謝物免疫應(yīng)答分子細(xì)胞免疫體液免疫TT致敏T細(xì)胞淋巴因子B漿細(xì)胞IgMIgGIgAIgDIgE感染早期出現(xiàn)臨近恢復(fù)期出現(xiàn)與原蟲(chóng)和蠕蟲(chóng)感染有關(guān)感染性疾病分子診斷標(biāo)志物病原體核酸分子（DNA/RNA）細(xì)體二、感染性疾病分子診斷的常用方法

根據(jù)目的基因是否被放大，可分為雜交法和擴(kuò)增法。信號(hào)放大技術(shù)檢測(cè)方法靶分子數(shù)目不變，而檢測(cè)的探針信號(hào)放大

采用多酶、多探針或二者結(jié)合等方法來(lái)增加探針標(biāo)志物的濃度使檢測(cè)信號(hào)得到放大。靶分子擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)方法靶分子（RNA、DNA或探針）的擴(kuò)增PCR、替代擴(kuò)增、LCR等二、感染性疾病分子診斷的常用方法根據(jù)目的基因是否被放大擴(kuò)增的靶序列：編碼外膜蛋白Ⅲ的結(jié)構(gòu)基因，或16SrRNA基因、CPPB基因（同時(shí)存在于染色體及質(zhì)粒上）合多個(gè)側(cè)鏈HIV表型主要依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶基因突變的檢測(cè)RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA整合到宿主基因組中復(fù)制，以被感染細(xì)胞DNA為模板PCR擴(kuò)增；B型和C型主要存在于亞洲人群流感病毒的診斷過(guò)去主要靠雞胚羊膜腔培養(yǎng)和血清學(xué)血凝抑制試驗(yàn)，這些方法比較費(fèi)時(shí)，靈敏度低，難以作出早期診斷。gag基因5’-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3’342外膜蛋白Ⅲ5’-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3’494衣原體是介于立克次氏體與病毒之間，能通過(guò)細(xì)菌濾器，專(zhuān)性活細(xì)胞內(nèi)寄生的一類(lèi)原核生物。PCR法敏感、特異、簡(jiǎn)便、快速，并且可用于流感病毒的分型和流行病學(xué)調(diào)查。5’-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3’241(bp)有8個(gè)RNA片段或7個(gè)RNA片段；沙眼衣原體感染常缺乏特異癥狀，易形成隱匿感染，分子診斷技術(shù)敏感性和特異性高，適用于早期診斷和無(wú)癥狀攜帶者的檢查；感染性疾病：由某種病原體所致，通過(guò)不同方式引起人體發(fā)生感染并出現(xiàn)臨床癥狀的疾病。Dane顆粒（完整的病毒）形態(tài)條件致病菌：正常菌群與人體平衡破壞，引起疾病的一類(lèi)細(xì)菌；病毒載量檢測(cè)：在臨床進(jìn)展情況的判定及療效觀察上極有價(jià)值。C區(qū)編碼HBeAg、HBcAg整個(gè)反應(yīng)過(guò)程由三種酶控制，循環(huán)次數(shù)少，忠實(shí)性高,其擴(kuò)增效率高于PCR，特異性好。5’-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3’241(bp)引物A

靶RNA

引物B

RNAcDNA

RT

3'5'5'5'3'5'3'5'3'cDNA

cDNA模板

5'5'3'3'5'3'引物B

RNAseH

RT

T7RNA聚合酶

100-1000RNA擴(kuò)增子5'3'5'3'3'5'3'5'引物A

3'5'5'RNAseH

RNA

RNA

cDNA

cDNA

圖8-3NASBA原理示意圖引物A5’端帶有T7RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，3’端堿基與靶RNA3’端序列互補(bǔ);引物B的堿基序列與cDNA3’端序列互補(bǔ)擴(kuò)增的靶序列：編碼外膜蛋白Ⅲ的結(jié)構(gòu)基因，或16SrRNA基因nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA)nucleicacidsequence-basedam我國(guó)流行的主要是B和C基因型，長(zhǎng)江以北以C型為主，長(zhǎng)江以南以B型為主，另又少量的A型、D型和混合型。HBVDNA3.擴(kuò)增的靶序列：編碼外膜蛋白Ⅲ的結(jié)構(gòu)基因，或16SrRNA基因、CPPB基因（同時(shí)存在于染色體及質(zhì)粒上）疾病狀況的判斷檢測(cè)出病原體的存在并不能說(shuō)此病原體就是引起疾病的直接原因。DNA重復(fù)序列5’-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3’245信號(hào)檢測(cè)：bDNA可結(jié)合很多酶標(biāo)探針，酶催化底物（1,2-二惡二酮，dioxetane）發(fā)光，使核酸信號(hào)放大，且發(fā)光強(qiáng)度與DNA量成正比。對(duì)疑似病例的診斷和鑒別診斷。我國(guó)流行的主要是B和C基因型，長(zhǎng)江以北以C型為主，長(zhǎng)江以南以B型為主，另又少量的A型、D型和混合型。三、感染性疾病分子診斷的標(biāo)本處理分為甲(A)、乙(B)和丙(C)3個(gè)型別;常用方法：PCR＋雜交操作簡(jiǎn)便，省時(shí)，易于普及受敏感性、特異性限制，不易早期診斷，并且不易提供病原體分型及耐藥性方面的信息。靶分子擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)方法Dane顆粒（完整的病毒）形態(tài)病原體：病毒、細(xì)菌、原蟲(chóng)、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、寄生蟲(chóng)分型（分類(lèi)）－亞型－耐藥性靶序列引物序列擴(kuò)增片斷（bp）NASBA的特點(diǎn)為操作簡(jiǎn)便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程由三種酶控制，循環(huán)次數(shù)少，忠實(shí)性高,其擴(kuò)增效率高于PCR，特異性好。

我國(guó)流行的主要是B和C基因型，長(zhǎng)江以北以C型為主，長(zhǎng)江以南以引物A

靶RNA

引物B

RNAcDNA

RT

3'5'5'5'3'5'3'5'3'cDNA

cDNA模板

5'5'3'3'5'3'引物B

RNAseH

RT

T7RNA聚合酶

100-1000RNA擴(kuò)增子5'3'5'3'3'5'3'5'引物A

3'5'5'RNAseH

RNA

RNA

cDNA

cDNA

圖8-3NASBA原理示意圖引物A5’端帶有T7RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，3’端堿基與靶RNA3’端序列互補(bǔ);引物B的堿基序列與cDNA3’端序列互補(bǔ)引物A靶RNA引物BRNAcDNART3'5'5'nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA)nucleicacidsequence-basedamNASBA的特點(diǎn)為操作簡(jiǎn)便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程由三種酶控制，循環(huán)次數(shù)少，忠實(shí)性高,其擴(kuò)增效率高于PCR，特異性好。

NASBA的特點(diǎn)為操作簡(jiǎn)便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)。整個(gè)三、感染性疾病分子診斷的標(biāo)本處理標(biāo)本采集處理主要包括選擇合適的標(biāo)本種類(lèi)、標(biāo)本量、抗凝劑等及對(duì)標(biāo)本進(jìn)行合適的傳送、保存和預(yù)處理。三、感染性疾病分子診斷的標(biāo)本處理標(biāo)本采集處理主要包括選擇合適四、感染性疾病分子診斷的結(jié)果解釋1.陰性結(jié)果假陰性可能性方法的靈敏度太低方法失敗目標(biāo)分子2.陽(yáng)性結(jié)果假陽(yáng)性可能性方法的特異性受到污染四、感染性疾病分子診斷的結(jié)果解釋1.陰性結(jié)果假陰性可能性3.定性檢測(cè)結(jié)果有時(shí)不能提供病原體活力相關(guān)信息臨床治療病情緩解后一定時(shí)間內(nèi)，在患者樣本中仍可以檢測(cè)出相應(yīng)的病原體。有些病原體潛伏在進(jìn)體內(nèi)，沒(méi)有臨床癥狀。4.疾病狀況的判斷檢測(cè)出病原體的存在并不能說(shuō)此病原體就是引起疾病的直接原因。該病原體可能是一種正常菌群

3.定性檢測(cè)結(jié)果有時(shí)不能提供病原體活力相關(guān)信息五、感染性疾病分子診斷的臨床應(yīng)用及評(píng)價(jià)用于感染性疾病治療的監(jiān)控和預(yù)測(cè)、病情發(fā)展過(guò)程的危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)及疾病預(yù)后等。耐藥性的檢測(cè)細(xì)菌的分型流行病調(diào)查五、感染性疾病分子診斷的臨床應(yīng)用及評(píng)價(jià)用于感染性疾病治療的監(jiān)第一節(jié)病毒的基因檢測(cè)人類(lèi)許多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝炎、腦炎、流行性感冒等等，占人類(lèi)傳染疾病的75%左右。400多種不同病毒。病毒結(jié)構(gòu)：大?。?0-300nm

核心區(qū)：核酸（DNA或RNA）外周衣殼：蛋白質(zhì)包膜：脂質(zhì)（鑲嵌有蛋白質(zhì)）第一節(jié)病毒的基因檢測(cè)人類(lèi)許多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝

我國(guó)是HBV高流行區(qū)，50%－70%的人受過(guò)感染，8%－10%是HBV攜帶者，肝炎患者中60%是慢性肝炎患者，導(dǎo)致肝硬變，HBV又與原發(fā)性肝癌密切相關(guān)。外殼（HBsAg):外殼蛋白成分為表面抗原核心（HBcAg)：DNADNA聚合酶

HBcAg一、乙型肝炎病毒我國(guó)是HBV高流行區(qū)，50%－70%的人受過(guò)感染，8Dane顆粒（完整的病毒）形態(tài)HBsAgHBcAgHBVDNADNAPol（外膜蛋白）（核衣殼蛋白）完整的乙肝病毒顆粒直徑42納米由雙層外殼和一個(gè)核心組成的，核心直徑為27納米，內(nèi)含DNA雙鏈和DNA多聚酶Dane顆粒（完整的病毒）形態(tài)HBsAgHBcAgHBVD（一）病毒基因組結(jié)構(gòu)3.2kb雙鏈DNA病毒不完全雙連環(huán)狀DNA

長(zhǎng)鏈L為負(fù)鏈：有4個(gè)開(kāi)放閱讀框S、C、P、XS區(qū)編碼外膜蛋白（HBsAg）

C區(qū)編碼HBeAg、HBcAgp區(qū)編碼DNA聚合酶

X區(qū)位編碼X蛋白，可能與病毒蛋白表達(dá)有關(guān)。短鏈S為正鏈：長(zhǎng)短不一（一）病毒基因組結(jié)構(gòu)3.2kb雙鏈DNA病毒gap基因5’-ATAATCCACCTATCCCAGATAGGAGAAATC-3’115操作簡(jiǎn)便，省時(shí)，易于普及最外層為囊膜，雙層脂蛋白，是病毒識(shí)別攻擊宿主細(xì)胞所必不可少的；條件致病菌：正常菌群與人體平衡破壞，引起疾病的一類(lèi)細(xì)菌；病毒載量檢測(cè)：在臨床進(jìn)展情況的判定及療效觀察上極有價(jià)值。抗生素治療效果的觀察。檢測(cè)②靶探針1⑥分子生物學(xué)：靈敏、特異，可進(jìn)行早期診斷、分型、耐藥性檢測(cè)；我國(guó)是HBV高流行區(qū)，50%－70%的人受過(guò)感染，8%－10%是HBV攜帶者，肝炎患者中60%是慢性肝炎患者，導(dǎo)致肝硬變，HBV又與原發(fā)性肝癌密切相關(guān)。包裹后的前基因mRNA細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生導(dǎo)致治療失敗、感染復(fù)發(fā)、增加昂貴抗生素的使用。喹諾酮的耐藥-DNA解旋酶的gyrA和gyrB基因擴(kuò)增的靶序列有tpp47、bmp、tpf1、tyf1、tmpA等基因。HIV表型主要依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶基因突變的檢測(cè)四、感染性疾病分子診斷的結(jié)果解釋支鏈DNA信號(hào)放大技術(shù)(bDNA）16SrRNA的rrs基因gag基因5’-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3’342telbivudineF型僅見(jiàn)于中南美洲的土著人最外層為囊膜，雙層脂蛋白，是病毒識(shí)別攻擊宿主細(xì)胞所必不可少的；pre-s1

pre-s2S

P

C

pre-c

XHBVDNA3.2kbpre-S1pre-S1蛋白pre-S2pre-S2蛋白SHBsAgpre-CHBeAgCHBcAgPDNAPXHBxAgHBV基因組結(jié)構(gòu)gap基因5’-ATAATCCACCTATCCCAGATAGHBV基因分型HBV基因序列差異的多少，可將HBV劃分為不同的基因型，至今為止已發(fā)現(xiàn)A、B、C、D、E、F、G、H共8種基因型：A型主要存在于白人，B型和C型主要存在于亞洲人群E型主要存在于西非F型僅見(jiàn)于中南美洲的土著人G型和H型很少見(jiàn)不同基因型序列長(zhǎng)度不同，主要是前S1區(qū)的不同。我國(guó)流行的主要是B和C基因型，長(zhǎng)江以北以C型為主，長(zhǎng)江以南以B型為主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南尤其是西北有較高比例的D型HBV基因分型HBV基因序列差異的多少，可將HBV劃分為不HBV在肝細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制A(n)mRNAcccDNAHBsAg

包膜負(fù)鏈DNA包裹后的前基因

mRNA傳染性HBV病毒顆粒傳染性HBV病毒顆粒部分雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶肝細(xì)胞HBV在肝細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制A(n)mRNAcccDNAHBsAg（二）分子診斷常用的免疫學(xué)檢測(cè)方法，即二對(duì)半的檢測(cè)存在窗口期，不易早期診斷。1.PCR

采用普通PCR、FQ-PCR、競(jìng)爭(zhēng)性PCR、免疫雜交PCR，可提供直接、準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷證據(jù)。引物是根據(jù)S、C、P、X基因中高度保守序列設(shè)計(jì)，決定擴(kuò)增的特異性和敏感度。（二）分子診斷常用的免疫學(xué)檢測(cè)方法，即二對(duì)半的檢測(cè)存在窗口期擴(kuò)增位置引物序列擴(kuò)增片斷（bp)

P、X基因5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’2785’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’

C基因5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’4775’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’

C基因5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’2585’-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3’

擴(kuò)增位置引物序列擴(kuò)增片斷（bp

有時(shí)為了證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行以下分析：

RLFP

斑點(diǎn)雜交

Southern雜交

有時(shí)為了證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行以下分析：2.支鏈DNA信號(hào)放大技術(shù)(bDNA）原理:①捕獲探針檢測(cè)②靶探針1

體系③靶探針2④bDNA分子:DNA主鏈上結(jié)合多個(gè)側(cè)鏈2.支鏈DNA信號(hào)放大技術(shù)(bDNA）原理:第九章：細(xì)菌感染的分子生物學(xué)檢驗(yàn)3%，另有一個(gè)7493bp的質(zhì)粒，整個(gè)基因組有894個(gè)蛋白編碼基因，其中604個(gè)(68%)編碼蛋白的功能已明確，35個(gè)(4%)編碼基因在GenBank收錄的其他細(xì)菌中有同源序列，但功能不清，剩下的255個(gè)(28%)在GenBank中沒(méi)有檢索到同源序列。喹諾酮的耐藥-DNA解旋酶的gyrA和gyrB基因（一）流感病毒基因組結(jié)構(gòu)沙眼衣原體感染常缺乏特異癥狀，易形成隱匿感染，分子診斷技術(shù)敏感性和特異性高，適用于早期診斷和無(wú)癥狀攜帶者的檢查；對(duì)疑似病例的診斷和鑒別診斷。2kb雙鏈DNA病毒現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)引起艾滋病的病毒有HIV-1、HIV-2、HIV-3三種。擴(kuò)增的靶序列：編碼外膜蛋白Ⅲ的結(jié)構(gòu)基因，或16SrRNA基因、CPPB基因（同時(shí)存在于染色體及質(zhì)粒上）梅毒螺旋體(syphilisspirochete)是人類(lèi)梅毒的病原體。流感病毒的診斷過(guò)去主要靠雞胚羊膜腔培養(yǎng)和血清學(xué)血凝抑制試驗(yàn)，這些方法比較費(fèi)時(shí)，靈敏度低，難以作出早期診斷。S區(qū)編碼外膜蛋白（HBsAg）操作簡(jiǎn)便，省時(shí)，易于普及③env基因所編碼病毒包膜蛋白，是HIV免疫學(xué)診斷的主要