淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的誕生 雜交瘤技術(shù)基本程序和方法

淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的誕生淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的誕生是幾十年來(lái)免疫學(xué)在理論和技術(shù)兩方面發(fā)展的必然結(jié)果，抗體生成的克隆選擇學(xué)說(shuō)、抗體基因的研究、抗體結(jié)構(gòu)與生物合成以及其多樣性產(chǎn)生機(jī)制的揭示等，為雜交瘤技術(shù)提供了必要理論基礎(chǔ)，同時(shí)，骨髓瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)、細(xì)胞融合與雜交細(xì)胞的篩選等提供了技術(shù)貯備。1975年8月7日，Kohler和Milstein在英國(guó)《自然》雜志上發(fā)表了題為“分泌具有預(yù)定特異性抗體的融合細(xì)胞的持續(xù)培養(yǎng)”（Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity）的著名論文。他們大膽地把以前不同骨髓瘤細(xì)胞之間的融合延伸為將喪失合成次黃嘌呤－鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hypoxanthineguanosinephosphoribosyltransferase，HGPRT）的骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合。融合由仙臺(tái)病毒介導(dǎo)，雜交細(xì)胞通過(guò)在含有次黃嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培養(yǎng)基（HAT）中生長(zhǎng)進(jìn)行選擇。在融合后的細(xì)胞群體里，盡管未融合的正常脾細(xì)胞和相互融合的脾細(xì)胞是HGPRT+，但不能連續(xù)培養(yǎng)，只能在培養(yǎng)基中存活幾天，而未融合的HGPRT－骨髓瘤細(xì)胞和相互融合的HGPRT－骨髓瘤細(xì)胞不能在HAT培養(yǎng)基中存活，只有骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞因得到分別來(lái)自親本脾細(xì)胞的HGPRT和親本骨髓瘤細(xì)胞的連續(xù)繼代特性，而在HAT培養(yǎng)基中存活下來(lái)。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果完全像起始設(shè)計(jì)的那樣，最終得到了很多分泌抗綿羊紅細(xì)胞抗體的克隆化雜交瘤細(xì)胞系。用這些細(xì)胞系注射小鼠后能形成腫瘤，即所謂雜交瘤。生長(zhǎng)雜交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同質(zhì)的抗體，即單克隆抗體。這一技術(shù)建立后不久，在融合劑和所用的骨髓瘤細(xì)胞系等方面即得到改進(jìn)。最早仙臺(tái)病毒被用做融合劑，后來(lái)發(fā)現(xiàn)聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染問(wèn)題，從而得到廣泛的應(yīng)用。隨后建立的骨髓瘤細(xì)胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成輕鏈又不合成重鏈的變種，所以由它們產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞系，只分泌一種針對(duì)預(yù)定的抗原的抗體分子，克服了骨髓瘤細(xì)胞MOPC-21等的不足。再后來(lái)又建立了大鼠、人和雞等用于細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞系，但其基本原理和方法是一樣的。雜交瘤技術(shù)基本程序和方法雜交瘤技術(shù)在具體操作上，各實(shí)驗(yàn)室使用的程序不盡一致。本節(jié)中介紹的方法是作者所在實(shí)驗(yàn)室采用的、實(shí)踐證明成熟的程序，該程序適合國(guó)內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室。在開(kāi)展雜交瘤技術(shù)制備單抗之前，培養(yǎng)骨髓瘤和雜交瘤細(xì)胞必須具備下列主要儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)、CO2恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱（-70℃）、倒置顯微鏡、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機(jī)（水平轉(zhuǎn)子，4000r/min）、37℃水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，10ml、1ml刻度吸管，試管，滴管（彎頭、直頭），平皿，燒杯，500ml、250ml、100ml鹽水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，融合管（50ml圓底帶蓋玻璃或塑料離心管），眼科剪刀，眼科鑷，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，可調(diào)微量加樣器（~50ul，200ul，1000ul），彎頭針頭，200目篩網(wǎng)，小鼠固定裝置等。此外，雜交瘤細(xì)胞的篩選與檢測(cè)的儀器設(shè)備，依據(jù)檢測(cè)單抗的方法不同而各異，請(qǐng)參閱本節(jié)有關(guān)部分。淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的主要步驟包括：動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞的篩選與單抗檢測(cè)、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存、單抗的鑒定等，圖6-1概括了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)研制單抗的主要過(guò)程。1、動(dòng)物免疫(1)抗原制備制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說(shuō)雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機(jī)會(huì)增加，同時(shí)可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純?cè)胶?，?yīng)根據(jù)所研究的抗原和實(shí)驗(yàn)室的條件來(lái)決定。一般來(lái)說(shuō)，抗原的來(lái)源有限，或性質(zhì)不穩(wěn)定，提純時(shí)易變性，或其免疫原性很強(qiáng)，或所需單抗是用于抗原不同組分的純化或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強(qiáng)時(shí)，則必須對(duì)抗原進(jìn)行純化。檢測(cè)用抗原可以是與免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定于所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。(2)免疫動(dòng)物的選擇根據(jù)所用的骨髓瘤細(xì)胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動(dòng)物。因?yàn)?，所有的供雜交瘤技術(shù)用的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系均來(lái)源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細(xì)胞都來(lái)源于LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產(chǎn)都是用這兩種純系動(dòng)物作為免疫動(dòng)物。但是，有時(shí)為了特殊目的而需進(jìn)行種間雜交，則可免疫其他動(dòng)物。種間雜交瘤一般分泌抗體的能力不穩(wěn)定，因?yàn)槿旧w容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時(shí)以8-12周齡為宜，雌性鼠較便于操作。(3)免疫程序的確定免疫是單抗制備過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)之一，其目的在于使B淋巴細(xì)胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利于細(xì)胞融合形成雜交細(xì)胞，并增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的機(jī)會(huì)。因此在設(shè)計(jì)免疫程序時(shí)，應(yīng)考慮到抗原的性質(zhì)和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數(shù)與間隔時(shí)間、佐劑的應(yīng)用及動(dòng)物對(duì)該抗原的應(yīng)答能力等。沒(méi)有一個(gè)免疫程序能適用于各種抗原?，F(xiàn)用的免疫程序中多數(shù)是參照制備常規(guī)多克隆抗體的方法。表6-1列舉了目前常用的免疫程序。免疫途徑常用體內(nèi)免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射，也采用足墊、皮內(nèi)、滴鼻或點(diǎn)眼。最后一次加強(qiáng)免疫多采用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇后者，因?yàn)榭墒箍乖瓕?duì)脾細(xì)胞作用更迅速而充分。在最后一次加強(qiáng)免疫后第3天取脾融合為好，許多實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果表明，初次免疫和再次免疫應(yīng)答反應(yīng)中，取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天，在初次免疫應(yīng)答時(shí)獲得的雜交瘤主要分泌IgM抗體，再次免疫應(yīng)答時(shí)獲得的雜交瘤主要分泌IgG抗體。筆者體會(huì)陽(yáng)性雜交瘤出現(xiàn)的高峰與小鼠血清抗體的滴度并無(wú)明顯的平行關(guān)系，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達(dá)到最高的雜交瘤形成率需要有盡可能多的漿母細(xì)胞，這在最后一次加強(qiáng)免疫后第3天取脾進(jìn)行融合較適宜。已有人報(bào)道采用脾內(nèi)免疫，可提高小鼠對(duì)抗原的免疫反應(yīng)性，且節(jié)省時(shí)間，一般免疫3天后即可融合。表6-1不同免疫抗原的免疫程序免疫原特性

抗原量

接種次數(shù)

間隔時(shí)間

單抗的特性

抗體滴度

親和性免疫原性強(qiáng)（如細(xì)胞、細(xì)菌和病毒等）

106-107個(gè)細(xì)胞或1-10ug

2-4

2-4周

高

中等至強(qiáng)免疫原性中等

10-100ug

2-4

2-4周

中等或高

中等或強(qiáng)免疫原性弱

A.20-400ug

2-4隨后2-3

每月2-3月

中等

強(qiáng)

B.10-50ug其后200-400ug

2其后4

每月每天

中等

中等

C.10-100ug

2其后4其后“休息”最后加強(qiáng)

每月10天1-2月

中等中等或強(qiáng)體內(nèi)免疫法適用于免疫原性強(qiáng)、來(lái)源充分的抗原，對(duì)于免疫原性很弱或?qū)C(jī)體有害（如引起免疫抑制）的抗原就不適用了。如果制備人單克隆抗體幾乎不大可能采用體內(nèi)免疫法。因此，針對(duì)這些情況，可采用體外免疫。所謂體外免疫就是將脾細(xì)胞（或淋巴結(jié)細(xì)胞，或外周血淋巴細(xì)胞）取出體外，在一定條件下與抗原共同培養(yǎng)，然后再與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。其基本方法是取4-8周齡BALB/c小鼠的脾臟，制成單細(xì)胞懸液，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌2-3次，然后懸浮于含10%小牛血清的培養(yǎng)液中，再加入適量抗原（可溶性抗原0.5-5ug/ml，細(xì)胞抗原105-106個(gè)細(xì)胞/ml）和一定量的BALB/c小鼠胸腺細(xì)胞培養(yǎng)上清液；在37℃，6%CO2濃度下培養(yǎng)3-5天，再分離脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。2、細(xì)胞融合（1）主要試劑的配制a.細(xì)胞培養(yǎng)基雜交瘤技術(shù)中使用的細(xì)胞培養(yǎng)基主要有RPMI-1640或DMEM（DulbercoModifiedEaglesMedium）兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，具體配制方法按廠家規(guī)定的程序，配好后過(guò)濾除菌（0.22um），分裝，4℃保存。?不完全RPMI-1640培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基原液96ml100×L.G.溶液1ml雙抗溶液1ml7.5%NaHCO3溶液1-2mlHEPES溶液1ml?不完全DMEM培養(yǎng)基：DMEM13.37g超純水或四蒸水980mlNaHCO33.7g雙抗溶液10ml100×L.G.溶液10ml用1NHCl調(diào)試PH至7.2-7.4，過(guò)濾除菌，分裝4℃保存。?完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基：不完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基80ml小牛血清15-20ml用于骨髓瘤細(xì)胞SP2/0和建株后的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)。?HT培養(yǎng)基：完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基99mlHT貯存液1ml?HAT培養(yǎng)基：完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基98mlHT貯存液1mlA貯存液1mlb.氨基喋呤（A）貯存液（100×，4×10-5mol/L）:稱取1.76mg氨基喋呤（AminopterinMW440.4），溶于90ml超純水或四蒸水中，滴加1mol/LNaOH0.5ml中和，再補(bǔ)加超純水或四蒸水至100ml。過(guò)濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。c.次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）貯存液（100×,H:10-2mol/L，T：1.6×10-3mol/L):稱取136.1mg次黃嘌呤（Hypoxanthine,MW136.1）和38.8mg胸腺嘧啶核苷（Thymidine,MW242.2)，加超純水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，過(guò)濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20℃凍存。用前可置37℃加溫助溶。d.L－谷氨酰胺（L.G.）溶液（100×，0.2mol/L）:稱取2.92gL－谷氨酰胺（L-glutamine，MW146.15），用100ml不完全培養(yǎng)液或超純水（或四蒸水）溶解，過(guò)濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20℃凍存。e.青、鏈霉素（雙抗）溶液（100×）:取青霉素G（鈉鹽）100萬(wàn)單位和鏈霉素（硫酸鹽）1g，溶于100ml滅菌超純水或四蒸水中，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20℃凍存。f.7.5%NaHCO3溶液:稱取分析純NaHCO37.5g，溶于100ml超純水或四蒸水中，過(guò)濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），蓋緊瓶塞，4℃保存。g.HEPES溶液（1mol/L）:稱取23.83gHEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonicacid，N-2－羥乙基哌嗪－N，-2－乙基磺酸，MW238.3）溶于100ml超純水或四蒸水中，過(guò)濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），4℃保存。h.8－氮鳥(niǎo)嘌呤貯存液（100×）:稱取200mg8－氮鳥(niǎo)嘌呤（8-azaguanine，MW152.1），加入4mol/LNaOH1ml，待其溶解后，加入超純水或四蒸水99ml，過(guò)濾除菌；分裝小瓶，-20℃凍存。使用時(shí)按1%濃度加入到培養(yǎng)液中（即終濃度為20ug/ml）。i.50%PEG:稱取PEG1000或400020-50g于三角瓶中，蓋緊，60-80℃水浴融化，0.6ml分裝于青霉素小瓶中，蓋緊，8磅高壓蒸汽15分鐘，-20℃存放備用。臨用前加熱融化，加等量不完全培養(yǎng)基，用少許7.5%NaHCO3調(diào)PH至8.0，或購(gòu)買Sigma或Gibco公司現(xiàn)成產(chǎn)品。⑵

髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備融合前骨髓瘤細(xì)胞維持的方式，對(duì)成功地得到雜交瘤是最為重要的。目標(biāo)是使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的時(shí)間盡可能長(zhǎng)，融合前肯定不能少于1周。凍存的細(xì)胞在復(fù)蘇后要2周時(shí)間才能處于適合于融合的狀態(tài)，長(zhǎng)過(guò)了的骨髓瘤細(xì)胞至少幾天才可能恢復(fù)。在實(shí)驗(yàn)室中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的骨髓瘤細(xì)胞維持在含10%小牛血清的培養(yǎng)基中，方法是用6個(gè)裝5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，接種10倍系列稀釋的骨髓瘤細(xì)胞。1周后到細(xì)胞相當(dāng)密而又未長(zhǎng)過(guò)的一瓶重新移植。典型的倍增時(shí)間為14-16小時(shí)。骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備方法如下：a.

于融合前48-36小時(shí)，將骨髓細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)（一般按一塊96孔板的融合試驗(yàn)約需2-3瓶100ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)備）。b.

融合當(dāng)天，用彎頭滴管將細(xì)胞從瓶壁瘤輕輕吹下，收集于50ml離心管或融合管內(nèi)。c.

1000r/min離心5-10分鐘，棄去上清。d.

加入30ml不完全培養(yǎng)基，同法離心洗滌一次。然后將細(xì)胞重懸浮于10ml不完全培養(yǎng)基，混勻。e.取骨髓瘤細(xì)胞懸液，加0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液作活細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用。細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，取細(xì)胞懸液0.1ml加入0.9ml臺(tái)盼藍(lán)染液中，混勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。計(jì)算細(xì)胞數(shù)目的公式為：每毫升細(xì)胞數(shù)=4個(gè)大方格細(xì)胞數(shù)×105/4；或每毫升細(xì)胞數(shù)=5個(gè)中方格細(xì)胞數(shù)×106/2⑶脾淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備取已經(jīng)免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分離血清作為抗體檢測(cè)時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照血清。同時(shí)通過(guò)頸脫位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分鐘，于解剖臺(tái)板上固定后掀開(kāi)左側(cè)腹部皮膚，可看到脾臟，換眼科剪鑷，在超凈臺(tái)中用無(wú)菌手術(shù)剪剪開(kāi)腹膜，取出脾臟置于已盛有10ml不完全培養(yǎng)基的平皿中，輕輕洗滌，并細(xì)心剝?nèi)ブ車Y(jié)締組織。將脾臟移入另一盛有10ml不完全培養(yǎng)基的平皿中，用彎頭鑷子或裝在1ml注射器上的彎針頭輕輕擠壓脾臟（也可用注射器內(nèi)芯擠壓脾臟），使脾細(xì)胞進(jìn)入平皿中的不完全培養(yǎng)基。用吸管吹打數(shù)次，制成單細(xì)胞懸液。為了除去脾細(xì)胞懸液中的大團(tuán)塊，可用200目銅網(wǎng)過(guò)濾。收獲脾細(xì)胞懸液，1000r/min離心5-10分鐘，用不完全培養(yǎng)基離心洗滌1-2次，然后將細(xì)胞重懸于10ml不完全培養(yǎng)基混勻，取上述懸液，加臺(tái)酚藍(lán)染液作活細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用。通常每只小鼠可得1×108-2.5×108個(gè)脾細(xì)胞，每只大鼠脾臟可得5×108-10×108脾細(xì)胞。⑷飼養(yǎng)細(xì)胞（Feedercells）的制備在細(xì)胞融合后選擇性培養(yǎng)過(guò)程中，由于大量骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞相繼死亡，此時(shí)單個(gè)或少數(shù)分散的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，通常必須加入其他活細(xì)胞使之繁殖，這種被加入的活細(xì)胞稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞促進(jìn)其他細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不明了，一般認(rèn)為它們可能釋放非種屬特異性的生長(zhǎng)刺激因子，為雜交瘤細(xì)胞提供必要的生長(zhǎng)條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度的依賴性。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有胸腺細(xì)胞、正常脾細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞。其中以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的來(lái)源及制備較為方便，且有吞噬清除死亡細(xì)胞及其碎片的作用，因此使用最為普遍。其制備方法如下：按上述采小鼠脾細(xì)胞的方法將小鼠致死、體表消毒和固定后，用消毒剪鑷從后腹掀起腹部皮膚，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培養(yǎng)基至腹腔，注意避免穿入腸管。右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內(nèi)，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部1分鐘，隨后吸出注入的培養(yǎng)液。1000r/min離心5-10分鐘，棄上清。先用5mlHAT培養(yǎng)基將沉淀細(xì)胞懸浮