雜交瘤細胞的凍存與復蘇技術(shù)

雜交瘤細胞的凍存與復蘇技術(shù)（1）

雜交瘤細胞的凍存在建立雜交瘤細胞的過程中，有時一次融合產(chǎn)生很多“陽性”孔，來不及對所有的雜交瘤細胞作進一步的工作，需要把其中一部分細胞凍存起來；另一方面，為了防止實驗室可能發(fā)生的意外事故，如停電、污染、培養(yǎng)箱的溫度或CO2控制器失靈等給正在建立中的雜交瘤帶來災難，通常盡可能早地凍存一部分細胞作為種子，以免遭到不測。在雜交瘤細胞建立以后，更需要凍存一大批，以備今后隨時取用。細胞凍存的原理是細胞在加血清和二甲基亞砜的培養(yǎng)基中以一定的緩慢速度下降溫度（0℃——-20℃，每分鐘下降1℃；-20℃——-40℃每分鐘下降2℃），可在－196℃液氮或液氮蒸氣中長期保存。下面介紹我們實驗室的細胞凍存方法，經(jīng)幾年來對多種細胞的使用，細胞復蘇存活率均在80%以上。A.材料：a.

帶蓋吸管筒一只（鋁質(zhì)或洋鐵皮制），內(nèi)壁（包括筒底和蓋）襯1-2層石棉紙或石棉布。b.

含10-20%血清、5-10%DMSO的HT培養(yǎng)基，冰浴降溫至0℃左右（用作凍存液）。c.

滅菌安瓶或帶蓋小瓶。d.

-70℃冰箱。e.

液氮及液氮罐。f.

處于對數(shù)生長中期、健康而活力好的雜交瘤細胞。B.方法：a.

將雜交瘤細胞（或其他細胞）離心，重新懸浮于預冷的凍存液中，濃度為106-107左右/ml，分裝安瓶，每瓶1ml，置冰浴上；安瓶上標明細胞名稱、凍存日期、批號等。b.

安瓶封口后仍置冰浴上。c.

將安瓶放入一帶收口繩的小布袋內(nèi)，布袋上標明凍存號、細胞名稱等，立即將布袋放入吸管筒內(nèi)，置－70℃冰箱。d.

2-4小時后或過夜后從－70℃冰箱取出吸管筒，將盛有細胞的布袋移入液氮罐；在布袋的線繩上作好標記或代碼；最后在液氮凍存簿上作詳細記錄。e.

液氮罐應(yīng)定期補充液氮（最好是專人管理）；補充液氮及存取細胞時應(yīng)帶保護眼鏡和手套，以免因液氮凍傷等。（2）

雜交瘤細胞的復蘇雜交瘤細胞、骨髓瘤細胞或其他細胞在液氮中保存，若無意外情況時，可保存數(shù)年至數(shù)十年。復蘇時融解細胞速度要快，使之迅速通過最易受損的－5℃—0℃，以防細胞內(nèi)形成冰晶引起細胞死亡。通常情況下，凍存時細胞數(shù)量多，生長狀態(tài)好的雜交瘤細胞系以及其他細胞的復蘇可采用以下方法，這也是各個實驗室普遍采用的程序。即復蘇時，從液氮中取出安瓶，立即在37℃水浴融化，待最后一點冰塊快要融化時，從水浴中取出，置冰浴上。用5-10mlHT培養(yǎng)基稀釋，1000r/min10分鐘，棄上清，再懸浮于適量HT培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶或24孔板，置37℃，7.5%CO2培養(yǎng)。如果細胞存活力不高，死細胞太多，可加104-105/ml小鼠腹腔細胞進行培養(yǎng)。不過，凍存的細胞并不都能100%復蘇成功，其原因較多，如凍存時細胞數(shù)量少或生長狀態(tài)不良，或復蘇時培養(yǎng)條件改變或方法不當，也可能細胞受細菌或支原體污染，以及液氮罐保管不善等。在出現(xiàn)上述情況時，可采用一些補救方法復蘇這些細胞，如小鼠皮下形成實體瘤法，脾內(nèi)接種法，小鼠腹腔誘生腹水和實體瘤法，以及96孔板培養(yǎng)法等。6、單抗特性的鑒定⑴單克隆性的確定包括雜交瘤細胞的染色體分析、單抗免疫球蛋白重鏈和輕鏈類型的鑒定和單抗純度鑒定等。A.

雜交瘤細胞的染色體分析對雜交瘤細胞進行染色體分析可獲得其是否是真正的雜交瘤細胞的客觀指標之一，雜交瘤細胞的染色體數(shù)目應(yīng)接近兩種親本細胞染色體數(shù)目的總和，正常小鼠脾細胞的染色體數(shù)目為40，小鼠骨髓瘤細胞SP2/0為62-68，NS-1為54-64；同時骨髓瘤細胞的染色體結(jié)構(gòu)上反映兩種親本細胞的特點，除多數(shù)為端著絲點染色體外，還出現(xiàn)少數(shù)標志染色體。另一方面，雜交瘤細胞的染色體分析對了解雜交瘤分泌單抗的能力有一定的意義，一般來說，雜交瘤細胞染色體數(shù)目較多且較集中，其分泌能力則高，反之，其分泌單抗能力則低。檢查雜交瘤細胞染色體的方法最常用秋水仙素法，其原理是應(yīng)用秋水仙素特異的破壞紡錘絲而獲得中期分裂相細胞；再用0.075mol/LKCl溶液等低滲處理，使細胞膨脹，體積增大，染色體松散；經(jīng)甲醇－冰醋酸溶液固定，即可觀察檢查。其操作步驟如下：a.

在加秋水仙素前48-36小時將雜交瘤細胞傳代。b.

秋水仙素處理：在培養(yǎng)瓶中加入秋水仙素（100ug/ml，除菌，-20℃保存），使最終濃度為0.1-0.4ug/ml（若改用秋水仙胺則最終濃度為0.02-0.05ug/ml）；繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時，然后吹打細胞，移入離心管中，1000r/min10分鐘，棄上清。c.

加入已預溫到37℃的0.075mol/LKCl溶液5ml，將沉淀細胞懸浮并混勻，37℃水浴15-20分鐘。d.

向懸液中加入新配制的固定液（甲醇與冰醋酸3：1混合）1ml，混勻，然后1000r/min10分鐘，棄去上清液；本步驟的目的是使細胞表面輕微固定，可防止固定后細胞粘連成團塊。e.

加入固定液5ml，將細胞懸浮并混勻，室溫靜置20-30分鐘，然后1000r/min10分鐘，棄去上清液；重復操作一次；其后加5ml固定液，將細胞懸浮并混勻，封上管口，置4℃過夜。f.

取出離心管，1000r/min5分鐘，輕輕吸去上清液，根據(jù)細胞壓積多少而留下0.5-1ml固定液，將細胞懸浮并混勻后，吸取細胞懸液1-2滴，滴在剛從冰水中取出的載玻片上，用口吹散，并在火焰上通過數(shù)次，使細胞平鋪于載玻片上，自然干燥。g.

用新配制的10%Giemsa染液染色10-20分鐘，然后用自來水洗去染液，自然干燥。（Giemsa染液配方：Giemsa粉0.5g，甘油33ml，55-60℃保溫2小時，加甲醇33ml混勻，保存于棕色瓶內(nèi)作為原液；取原液1份，加1/15mol/LPH6.8PBS9份，即成10%Giemsa染液）。h.

鏡檢：選擇染色體分散好，無重疊，無失散的細胞進行觀察分析。每份標本應(yīng)計數(shù)100個完整的中期核細胞，并注意觀察是否有標志染色體。B.

抗免疫球蛋白的類別和亞類鑒定抗體的類和亞類對決定提純的方法有很大的幫助。除采用特殊的免疫方法和檢測方法，最經(jīng)常得到的單抗是IgM和IgG，分泌IgE的雜交瘤細胞很少見，而分泌IgA的雜交瘤通常只有在用于融合的淋巴細胞來自腸道相關(guān)淋巴組織才能得到。如在抗體檢測中使用葡萄球菌A蛋白試劑，則不可能得到IgG以外的其他類的抗體。鑒定單抗Ig類和亞類的方法主要有兩種，一種是免疫擴散，另一種是ELISA。（A）免疫擴散法這種方法簡便、準確，最常用。被檢的McAb樣品通常為雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液，由于其中單抗的濃度較低，應(yīng)先將其濃縮10-20倍左右再檢測。小鼠腹水中的單抗?jié)舛入m很高，但也含有小鼠本身的各類Ig，它們也會與相應(yīng)抗血清發(fā)生反應(yīng)，使鑒定結(jié)果出現(xiàn)混亂，即使將腹水稀釋10-20倍后再檢測也不能完全避免上述情況的發(fā)生，因此一般不用腹水型單抗作為被檢樣品。材料：a.

小鼠IgG及其亞類IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM、IgA的抗血清。b.

0.06mol/L巴比妥鈉－鹽酸緩沖液（PH8.6）。c.

1%瓊脂糖凝膠：1g瓊脂糖加入100ml0.06ml/LPH8.6巴比妥鈉－鹽酸緩沖液中，隔水煮沸溶解，加0.02%NaN3防腐，4℃保存?zhèn)溆?。d.

潔凈載玻片，打孔器（直徑3mm），濕盒，酒精燈。方法：a.

雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液的濃縮：取該上清液10ml裝入透析袋中，用線扎緊，放在小燒杯中，透析袋周圍堆置PEG6000或蔗糖或PVP（聚乙烯吡咯烷酮polyvinylpyrrolidone），放于4℃數(shù)小時，待透析袋內(nèi)液體量濃縮至約0.5-1ml時，吸出，可于－20℃保存?zhèn)溆茫灰部刹捎么碉L蒸發(fā)濃縮。b.

加熱溶化1%瓊脂糖凝膠，鋪制瓊脂糖板，每片約3ml。c.

待瓊脂凝固后，用打孔器在瓊脂板上打出梅花形的小孔（中央1孔，周圍6孔），然后封底。d.

向中央孔加入抗小鼠IgG類或亞類抗血清，周圍孔加入待檢樣品；加樣后將瓊脂板放入濕盒，置37℃水浴箱中12-24小時或4℃過夜，觀察結(jié)果。（B）

ELISA法該法不需要將樣品濃縮，而且比免疫擴散法更快地得到結(jié)果。材料：a.

ELISA所需用溶液同雜交瘤細胞的篩選一節(jié)。b.

酶標板。c.

山羊抗鼠Ig；兔抗小鼠Ig類及亞類特異性血清；HRP結(jié)合的山羊抗兔Ig等。d.

待檢雜交瘤細胞培養(yǎng)上清；陰性、陽性對照樣品。方法一：a.

每孔加入適量的100ul山羊抗小鼠Ig，室溫2小時；洗滌液洗2次。b.

每孔加200ul封閉液，室溫作用1小時。c.

洗滌液洗2次；加100ul雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，4℃過夜；設(shè)陰性、陽性對照孔。d.

洗滌4次，每孔加100ul兔抗小鼠Ig類及亞類特異性抗血清，室溫2小時。e.

洗滌4次，加100ulHRP標記的山羊抗兔Ig；室溫作用2小時。f.

洗滌后，加底物顯色，判讀結(jié)果。g.

若有HRP標記的抗小鼠Ig類及亞類試劑，則可省去e。方法二：a.

以適宜濃度的抗原包被酶標板，100ul/孔，4℃過夜。b.

洗滌后，加入待檢的單抗樣品，100ul/孔，37℃1小時；設(shè)陰性、陽性對照孔。c.

洗滌后，加入HRP標記的抗小鼠類及亞類Ig的抗體試劑，100ul/孔，37℃避光顯色15分鐘；用2mol/LH2SO4終止反應(yīng)后，閱讀各孔的OD490值。C.單抗純度的鑒定聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、SDS、等電點聚焦電泳（IEF）及免疫轉(zhuǎn)印分析（WB）等方法都可用于鑒定單抗的純度。PAGE、SDS、IEF、WB的原理和方法請參閱有關(guān)專著，這里不再贅述。⑵單抗理化特性的鑒定從實用意義上說，單抗對溫度和PH變化的敏感性以及單抗的親合力都是理化特性鑒定的主要項目，它們可為單抗的使用和保存提供重要依據(jù)。其中單抗親合力測定比較復雜，下面作簡要介紹。抗體親合力是指抗體與抗原或半抗原結(jié)合的強度，其高低主要是由抗體和抗原分子的大小、抗體分子結(jié)合簇（部）和抗原決定簇之間的立體構(gòu)型的合適程度決定的。親合力通常以平均內(nèi)在結(jié)合常數(shù)（K）表示。單抗親合力測定是十分重要的，它可為正確選擇不同用途的單抗提供依據(jù)。在建立各種檢測方法時，應(yīng)選用高親合力的單抗，以提高敏感性和特異性，并可節(jié)省試劑。而在親和層析時，應(yīng)選用親合力適中的單抗作為免疫吸附劑，因為親合力過低不易吸附，親合力過高不易洗脫。精確測定單抗的親合力是較困難的，好在實際應(yīng)用中選擇單抗時，通常只需測定各單抗的相對親合力及其高低排列次序。常用的方法有競爭ELISA、非競爭性ELISA

、間接ELISA、間接法夾心ELISA等，這里僅介紹競爭性ELISA測定單抗親和常數(shù)的方法。其步驟是：取適宜濃度的純化抗原包被酶標板，100ul/孔，4℃過夜。洗滌后，加入封閉液（0.5%BSA-PBS，PH7.2）100ul/孔，37℃1小時。取一定濃度的單抗，與系列倍比稀釋的抗原混合，4℃過夜，使反應(yīng)達到平衡；必須注意所用抗原濃度至少要比抗體濃度高10倍以上。將平衡后的抗原抗體復合物加入酶標板孔中，100ul/孔，37℃1小時。洗滌后，加入適宜稀釋度的HRP標記抗小鼠IgG抗體，100ul/孔，37℃1小時。洗滌后，加入底物（OPD）溶液，100ul/孔，37℃顯色15分鐘；2mol/LH2SO4終止反應(yīng)后，于495nm波長測定各孔的吸收率（A）。按下列公式計算各單抗的親和常數(shù)（K）：A0/（A0-A）=1+K/a0其中A0=無抗原時A值；A=采用不同濃度抗原時的A值；a0=抗原總量；K=親和常數(shù)。⑶