發(fā)育生物學(xué)課件

Morphogenesis:VertebrateLimbDevelopment第十四章附肢的發(fā)育和再生附肢發(fā)育的研究是發(fā)育生物學(xué)的一個(gè)重要課題。脊椎動(dòng)物，特別是鳥(niǎo)類(lèi)和兩棲類(lèi)附肢（limb）的發(fā)育包含了大量的、各種各樣的誘導(dǎo)作用。有尾類(lèi)的蠑螈和美西螈附肢具有明顯的再生能力，是研究再生的極好模型。一、脊椎動(dòng)物附肢的發(fā)育脊椎動(dòng)物的附肢是一個(gè)極其復(fù)雜的器官，每一塊骨和肌肉的位置都被精密地組織在一起。附肢在三個(gè)基本軸上是不對(duì)稱(chēng)的，但左前肢總是和右前肢呈鏡面對(duì)稱(chēng)。脊椎動(dòng)物的附肢都是由體壁中胚層和外部的表皮共同組成的。孵化10天的完整雞翅標(biāo)本，示三個(gè)發(fā)育軸：近側(cè)-遠(yuǎn)側(cè)軸、前后軸及背腹軸。在所有的四足動(dòng)物中，附肢發(fā)育的基本形態(tài)發(fā)生原則（basicmorphogeneticrules）是相同的。構(gòu)建一個(gè)附肢所需要的位置信息要在一個(gè)三維（或包括時(shí)間在內(nèi)的四維）的、相互協(xié)調(diào)的系統(tǒng)中發(fā)揮作用?，F(xiàn)在已鑒定了一系列蛋白，在附肢近遠(yuǎn)軸、前后軸和背腹軸的形成過(guò)程中發(fā)揮作用。1、附肢的起源脊椎動(dòng)物的附肢在起源上是由胚胎體壁向外生長(zhǎng)形成的，主要是由來(lái)自中胚層的疏松間質(zhì)形成的中央核，以及來(lái)自外胚層的表皮兩大部分組成。附肢的原基稱(chēng)為附肢芽（limbbud）。附肢芽形成的位置在每一物種是恒定的，由Hox基因沿身體前后軸表達(dá)的水平?jīng)Q定。雞胚胎的肢芽。孵化后第三天胚胎的側(cè)面出現(xiàn)肢芽翅肢芽腿肢芽頂外胚層嵴美西螈（Ambystomamaculatum）的預(yù)定前肢場(chǎng)前腎肩帶腮周側(cè)翼組織附肢腮體節(jié)2、附肢的早期發(fā)育附肢早期發(fā)育的第一個(gè)跡象是體節(jié)中胚層細(xì)胞沿胚胎長(zhǎng)軸的增殖，逐漸在表皮的下面形成厚的細(xì)胞團(tuán),它們從附肢場(chǎng)的側(cè)板中胚層和體節(jié)中胚層分離出來(lái)，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行遷移。附肢的發(fā)育開(kāi)始于間質(zhì)細(xì)胞從附肢的骨骼前體細(xì)胞(limbskeletalprecursors)和附肢的肌肉前體細(xì)胞(limbmuscleprecursors)分離后的增殖，這些細(xì)胞在內(nèi)胚層組織下聚集并形成一環(huán)狀的突起，此突起稱(chēng)為肢芽。

Inductionoftheearlylimbbud:Wntproteinsandfibroblastgrowthfactors(FGFs)肢芽形成的信號(hào)來(lái)自于側(cè)板中胚層(lateralplatemesoderm)細(xì)胞，這些細(xì)胞會(huì)分泌成纖維生長(zhǎng)因子FGF10，而FGF10能夠促使外胚層和中胚層之間分肢形成的交互作用。當(dāng)含有FGF10的小珠子被放置于側(cè)翼內(nèi)胚層下方，會(huì)有額外的分肢形成。

(A)在分肢正常形成之處的側(cè)板中胚層lateralplatemesoderm里，有FGF10表現(xiàn)。(B)當(dāng)將會(huì)分泌FGF10的細(xì)胞轉(zhuǎn)植于雞胚的側(cè)翼時(shí)，F(xiàn)GF10會(huì)使一異位的分肢形成。

FGF10的表達(dá)及其在雞肢發(fā)育過(guò)程中的作用Wntproteinsandfibroblastgrowthfactors(FGFs)FGF10原本分布于整個(gè)側(cè)板中胚層，但是在附肢形成之前，F(xiàn)GF10便被限制在側(cè)板中胚層將形成附肢的區(qū)域，F(xiàn)GF10被限制主要與Wntproteins有關(guān)。孵化48－54h雞胚附肢芽開(kāi)始形成的分子模型如圖所示，一開(kāi)始FGF10表現(xiàn)于整個(gè)側(cè)板中胚層，然后在后肢形成之處，受到Wnt8c限制。而在前肢形成之處，則受到Wnt2b限制。FGF10經(jīng)由外胚層的Wnt3a來(lái)誘發(fā)頂外胚層嵴(AER)中的FGF8表現(xiàn)，F(xiàn)GF8能誘導(dǎo)并維持Wntproteins表現(xiàn)，使得FGF10于側(cè)板中胚層內(nèi)能連續(xù)性地表現(xiàn)。頂外胚層嵴前肢、后肢的分化Gain-of-function實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子TBX4和TBX5分別與后肢和前肢的特化有關(guān)。Loss-of-function資料也表明，人類(lèi)TBX5基因缺失會(huì)導(dǎo)致上肢和心臟的異常，但下肢基本不受影響。TBX4和TBX5在FGF10誘導(dǎo)形成的肢芽中的表達(dá)異位表達(dá)TBX4，可以使FGF10誘導(dǎo)形成的前肢轉(zhuǎn)變?yōu)楹笾珤呙桦婄R觀(guān)察孵化4.5天的雞胚肢芽，顯示頂外胚層嵴AER。附肢發(fā)育中外胚層和中胚層間的相互作用附肢的向外生長(zhǎng)涉及AER和中胚層間持續(xù)的相互作用。一旦中胚層誘導(dǎo)其上方的外胚層形成AER，AER與中胚層的相互作用對(duì)附肢的向外生長(zhǎng)是最重要的。中胚層在附肢發(fā)育中也起著關(guān)鍵的作用。AER起初的形成和繼續(xù)存在依賴(lài)于位于其下方的中胚層。漸進(jìn)帶(PZ)在附肢發(fā)育中的作用漸進(jìn)帶位于肢芽的頂端，由快速分裂和增值的未分化細(xì)胞組成。頂外胚層嵴位于漸進(jìn)帶的上表面。不同時(shí)期的ZP細(xì)胞的移植對(duì)附肢發(fā)育有著不同的影響(見(jiàn)下圖)AER對(duì)下方的漸進(jìn)帶發(fā)出信號(hào)，如將AER移植到早期肢芽的背部將誘導(dǎo)異位生長(zhǎng)。Themajorsignalisfibroblastgrowthfactors,FGF-8throughoutridgeandFGF-4intheposteriorregion.

漸進(jìn)帶（PZ）細(xì)胞控制近－遠(yuǎn)端分化A.將早期翅芽的PZ移植到已經(jīng)形成尺骨和撓骨的晚期翅芽中，形成額外的尺骨和撓骨。B.將晚期翅芽的PZ移植到早期翅芽中，中間結(jié)構(gòu)缺失。附肢發(fā)育中至少要求三種類(lèi)型的外胚層和中胚層間的相互作用：第一，中胚層起始附肢芽向外生長(zhǎng)和形成AER；第二，AER進(jìn)一步刺激肢芽的向外生長(zhǎng)以及肢芽中胚層的增殖和分化；第三，附肢芽中胚層提供保持AER所必須的刺激。近遠(yuǎn)軸（P-D)的發(fā)育附肢沿近遠(yuǎn)軸的分化是由AER和附肢中胚層誘導(dǎo)的相互作用產(chǎn)生的。附肢芽的逐漸向外生長(zhǎng)是由于位于A(yíng)ER下面間質(zhì)細(xì)胞的增殖，而AER釋放的分子維持間質(zhì)細(xì)胞不斷進(jìn)行分裂。由AER合成、釋放到其下的間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF可能是雞胚中維持間質(zhì)細(xì)胞增殖的分子。如果AER在肢干發(fā)育的任何時(shí)期被移除，則末端肢更進(jìn)一步的骨骼發(fā)育將會(huì)停止如果有過(guò)多的AER移植到一個(gè)已經(jīng)存在的肢芽上，會(huì)形成多余的構(gòu)造，此構(gòu)造通常接近肢干的末端。如果腿部的間質(zhì)組織直接被置放在翅膀的AER下，后肢的末端構(gòu)造(腳指)會(huì)生長(zhǎng)在翅膀的末端如果在A(yíng)ER下的肢干間質(zhì)組織被非肢干的間質(zhì)組織取代，那么AER會(huì)退化，并且枝干的發(fā)育會(huì)停止如果AER被一個(gè)裝有FGF的有孔小珠所取代，那么仍然可以發(fā)育成正常的肢干在肢干發(fā)育中，越早移除AER，則肢干的缺失越大。上圖分別為在第三天、第三又二分之一天、第四天移除AER以及不移除AER對(duì)翅膀生長(zhǎng)的影響。頂外胚層嵴（AER)對(duì)于肢芽近遠(yuǎn)軸圖式的發(fā)育是必須的生長(zhǎng)因子可以替代頂外胚層嵴。將AER切除后，移植能釋放生長(zhǎng)因子FGF-8的玻璃珠，可使肢幾乎正常發(fā)育。Specifyingthelimbmesoderm:DeterminingtheP/Dpolarityofthelimb

附肢沿P/D軸的分化是由AER和附肢中胚層誘導(dǎo)的相互作用產(chǎn)生的。PZ的間質(zhì)細(xì)胞在其中起到重要作用。但是這些間質(zhì)細(xì)胞如何特化近-遠(yuǎn)軸？有兩個(gè)模式被提出來(lái)解釋這個(gè)現(xiàn)象：①漸進(jìn)帶模式（progresszonemodel）重視“時(shí)間”的量度②早期定位與擴(kuò)散模式（earlyallocationandprogenitorexpansionmodel）重視“空間”的量度

漸進(jìn)帶模式（progresszonemodel）

Progresszonemodel是假設(shè)每個(gè)中胚層細(xì)胞被分化的原因，是由它在漸進(jìn)帶(progresszone;PZ)中分裂所花的時(shí)間長(zhǎng)短來(lái)決定。一個(gè)細(xì)胞在增長(zhǎng)區(qū)所花的時(shí)間越長(zhǎng)，它獲得越多有絲分裂的機(jī)會(huì)，而其構(gòu)造越往遠(yuǎn)程發(fā)展。既然增長(zhǎng)區(qū)要維持一定的大小，當(dāng)肢干生長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞必須不斷離開(kāi)增長(zhǎng)區(qū)；一旦細(xì)胞離開(kāi)，他們就形成軟骨組織。所以，第一個(gè)離開(kāi)的細(xì)胞會(huì)變成stylopod(靠近體側(cè)部分，如肱骨)，而最后離開(kāi)的細(xì)胞形成autopod(遠(yuǎn)離體側(cè)部分，如指骨)，見(jiàn)下圖(A)早期定位與擴(kuò)散模式Earlyallocationandprogenitorexpansionmodel認(rèn)為肢芽在很早就已經(jīng)分化了，后來(lái)的細(xì)胞分裂只是擴(kuò)張已經(jīng)分化的區(qū)域，見(jiàn)下圖(B)。當(dāng)早期將AER移除的時(shí)候，這些特化的區(qū)域還沒(méi)擴(kuò)張，所以大部分的間質(zhì)細(xì)胞(在A(yíng)ER200μm之內(nèi))都死亡了，但當(dāng)在較后期的胚胎階段，肢芽生長(zhǎng)且區(qū)域擴(kuò)張了，200μm的范圍只會(huì)刪除掉autopod的部分。

間質(zhì)細(xì)胞特化近-遠(yuǎn)軸的兩種模式Hoxgenes,meisgenes,andthespecificationoftheP/Daxis

同源基因(homologousgene)在附肢發(fā)育中起到重要作用，它可以用于解釋附肢發(fā)育中的所有主要現(xiàn)象。包括Hoxgenes決定附肢域(limbfield)，Hox-Dgenes決定指的特化等。同源基因比較右圖(A)為正常老鼠的前肢，而圖(B)為Hoxa-11與Hoxd-11兩基因都已突變失去功能的老鼠前肢，其橈骨跟尺骨皆已消失。Hoxgenes在P/Daxis形成中的作用Hoxgene特化前肢特定部分的假設(shè)Hox-9特化肩胛骨，Hox-10特化肱骨，Hox-11特化尺骨跟橈骨，Hox-12特化掌骨，Hox-13特化指骨。Hox基因在四肢形成期間的表現(xiàn)量改變情形。在肢柱形成時(shí)(phaseⅠ)，Hoxd-9與Hoxd-10表現(xiàn)在新形成的肢芽。而在形成肢桿時(shí)(phaseⅡ)，Hoxd-9到Hoxd-13都有表現(xiàn)在肢芽的后端，但只有Hox-9在前端跟后端都有表現(xiàn)。在肢身形成時(shí)，Hox基因的表現(xiàn)相反過(guò)來(lái)，Hoxd-13和Hoxa-13在前端跟后端都有表現(xiàn)，而Hoxd-10到Hoxd-12以及Hoxa-12表現(xiàn)在后端。Hox基因和附肢畸形

附肢畸形在人類(lèi)發(fā)育中還是比較普遍的.大約1%的新生嬰兒有附肢前后軸向發(fā)育的缺陷人類(lèi)的許多遺傳缺陷（如Shh

信號(hào)途徑或Hox基因突變）是導(dǎo)致附肢發(fā)育畸形的原因。Thehandshowsarelativelymilddefect,polydactyly(多指畸形).

Thepicturesbelowshowamuchmoreseverelimbphenotypethatisassociatedwithmutationsofthe

Hoxd13gene.Noticethedifferencebetweentheheterozygous(雜合型)ontheleftandathehomozygous(純合型)conditionontheright.Againwecanseetheimportantcontributionstounderstandinghumandiseasesthathavecomefromstudyingthelowlyfruitfly!果蠅和雞的翅膀發(fā)育相關(guān)基因比較示意圖Trulyamazingthatstructuresthatappearsodifferentandthatoccuronanimalsseparatedbymorethan600millionyearsofevolutionsharethefundamentalmolecularmechanismspatterning.附肢發(fā)育中背－腹軸的分化背－腹軸與來(lái)自中胚層和外胚層兩者的細(xì)胞特化相關(guān)背腹軸分化可能是由肢芽背部外胚層的特異性旁分泌因子(Wnt7a)

誘導(dǎo)產(chǎn)生的。背部中胚層同時(shí)誘導(dǎo)背部肢芽的rFng和Wnt7a分子表達(dá)。腹部中胚層誘導(dǎo)engrailed-1（en-1）在肢芽腹部表達(dá)。Dorsal-VentralAxisofLimbWnt-7a在背部外胚層中表達(dá)，它誘導(dǎo)背部中胚層的Lmx-1表達(dá)并特化背部軸向形成。rFng同樣也在背部外胚層中表達(dá)。en-1表達(dá)細(xì)胞和rFng表達(dá)細(xì)胞之間的相互抑制作用，將決定頂外胚層嵴AER的中部邊緣位置。En-1表達(dá)細(xì)胞與Wnt-7a相互抑制，由此對(duì)肢芽腹部區(qū)域進(jìn)行定位.外胚層控制發(fā)育中肢的背腹軸圖式的形成。Wnt-7a在背部外胚層中表達(dá)，而Engrailed基因在腹部外胚層中表達(dá)。lmx-1基因在背中胚層中被Wnt-7a誘導(dǎo)表達(dá)，并且參與背部結(jié)構(gòu)的確定中腎間質(zhì)細(xì)胞前－后軸的特化

中胚層有一區(qū)域－極化活動(dòng)區(qū)(ZPA)，從ZPA發(fā)出信號(hào)指導(dǎo)肢芽后端的位置定位。ZPA可擴(kuò)散形態(tài)發(fā)生子模型(ZPAdiffusiblemorphogenmodel):ZPA組織通過(guò)分泌一種可溶性形態(tài)發(fā)生素起作用，該物質(zhì)從ZPA向外擴(kuò)散由肢芽后端向前端形成一種濃度梯度。RA(retinoicacid)：視黃酸

Tickle(1982):

retinoicacidcouldmimictheeffectsofZPAexperimentssupportedtheroleofRAastheZPAmorphogen

BryantandaJapanesegroup

(1987):

RAactedbyinducingZPAtissue

當(dāng)極化活性區(qū)(thezoneofpolarizingactivity;ZPA)被移植到前端肢芽的中胚層時(shí)，一模一樣的手指如鏡像一般，從正常的手指的前端冒出。Specificationofthelimbfield:Hoxgenesandretinoicacid所有陸地的脊椎動(dòng)物皆只有4個(gè)肢芽(limbbud：胚胎上的小突起，由此發(fā)育成肢)，而這4個(gè)肢芽皆在彼此的對(duì)面。雖然不同脊椎動(dòng)物的附肢因?yàn)樾纬捎诓煌w節(jié)而有所不同，但是附肢的位置卻是固定的，這與沿著體軸前后端的Hoxgene的表現(xiàn)有關(guān)。促使肢芽開(kāi)始形成的重要物質(zhì)為視黃酸(retinoicacid，RA)，倘若利用藥物阻斷視黃酸的合成，會(huì)因而阻礙肢芽的形成。Bryant和Gardiner(1992)推斷RA沿著體軸前后端形成的濃度梯度可能活化一些特定細(xì)胞內(nèi)的同源基因，因而這些特定細(xì)胞被包含在limbfield內(nèi)。而RA的來(lái)源可能是Hensen’snode。

(A)蝌蚪切除尾巴后，于再生的第一天，將尾端殘余的部分浸泡于retinoicacid。之后，蝌蚪于尾端殘余的部分長(zhǎng)出許多腳。(B)蝌蚪切除尾巴后，沒(méi)有浸泡于RA，使其正常地再生。4周后，于notochord上方可見(jiàn)neuraltube，而肌肉也被包裹成束，卻沒(méi)有軟骨或骨頭生成。(C)浸泡于RA的尾端，箭頭所指之處可見(jiàn)肢芽和骨盆的軟骨及骨頭的生成。在右邊箭頭所指之處，更可見(jiàn)股骨的雛型。ShhgeneandZPAHedgehog(hh),asegmentpolaritygene（體節(jié)極性基因）thatwestudiedearlier,isinvolvedinwingpatterning.Riddle(1993)showedthatavertebratehomologofflyhh,calledsonichh(shh),isexpressedbytheZPA.hh基因在前端附肢原基的異位表達(dá)利用原位雜合技術(shù)顯示Shh蛋白質(zhì)在ZPA的表現(xiàn)newlimbbudhasbeeninducedbyApplicationofaFGFsoakedbead

右圖為Sonichedgehog(shh)極化活性的分析試驗(yàn)。先將shhgene插入雞病毒基因序列中鄰近促進(jìn)子的地方，然后將此重組過(guò)的病毒放入培養(yǎng)的雞纖維組織原細(xì)胞中。將此經(jīng)過(guò)病毒轉(zhuǎn)殖的細(xì)胞移植到雞胚胎肢芽的前端。結(jié)果也產(chǎn)生鏡像般的手指，顯示分泌的蛋白質(zhì)有極化的活性。

在第17期，剛被誘導(dǎo)出來(lái)的AER分泌FGF8到底下的間質(zhì)細(xì)胞。已表達(dá)Hoxb-8與dHand的間質(zhì)細(xì)胞被誘導(dǎo)而產(chǎn)生shh，因此在前肢肢芽的后端形成極化活性區(qū)。AER和極化活性區(qū)(ZPA)之間回饋控制的效應(yīng)第16期的前肢肢芽,兩期之間距離5h在第18期，SHH蛋白質(zhì)維持FGF在A(yíng)ER中的表現(xiàn)，而AER中的FGF又能維持shh基因的表現(xiàn)。

居間中胚層側(cè)板中胚層表面外胚層三個(gè)軸的協(xié)調(diào)

附肢的3個(gè)軸是相互作用和相互協(xié)調(diào)的。特化這3個(gè)軸機(jī)制之間的主要循環(huán)包括(1)由AER(FGF8)和dHAND建立極化活性區(qū)(Sonichedgehog)；(2)由Sonichedgehog(在極化活性區(qū))誘導(dǎo)FGFs產(chǎn)生(在A(yíng)ER)，其方式是藉由Shh誘導(dǎo)Gremlin產(chǎn)生，而Gremlin會(huì)阻礙抑制FGFs的BMP；(3)由Wnt7a維持Sonichedgehog的表現(xiàn)(在腹側(cè)外胚層部分)；(4)由Sonichedgehog阻礙Gli3分裂成抑制子(repressor)的形式，使得形成Gli3活化子(activator)與Gli3抑制子的濃度梯度(gradient)。(1)由AER(FGF8)和dHAND建立極化活性區(qū)(Sonichedgehog)；(2)由Sonichedgehog(在極化活性區(qū))誘導(dǎo)FGFs產(chǎn)生(在A(yíng)ER)，其方式是藉由Shh誘導(dǎo)Gremlin產(chǎn)生，而Gremlin會(huì)阻礙抑制FGFs的BMP；(3)由Wnt7a維持Sonichedgehog的表現(xiàn)(在腹側(cè)外胚層部分)；(4)由Sonichedgehog阻礙Gli3分裂成抑制子(repressor)的形式，使得形成Gli3活化子(activator)與Gli3抑制子的濃度梯度(gradient)基因敲除實(shí)驗(yàn)證明Wnt7a和En-1分子在附肢軸向形成的重要性Asummaryoftheimportantinteractionsamongthemajoraxialpatterningsystems.Thispredictsthatmutantionsaffectingprimarilyoneaxialsystemwillhavesignificantaffectsontheothers.Thishasbeendemonstratedexperimentallybymakingmouseknockoutsofmanyoftheseimportantmolecules.TheWnt7aKOmousehasaventralizedlimbthatisalsomissingposteriorpatternelementsandtruncated附肢發(fā)育過(guò)程中的分子信