基因工程的過程課件

1.2基因工程的基本操作程序1.2基因工程的基本操作程序11、目的基因的獲取2、基因表達載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細胞4、目的基因的檢測與鑒定基因工程基本操作的四個步驟1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧?一、目的基因的獲取(一)、目的基因主要是______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些?從基因文庫中獲取利用PCR技術(shù)擴增2、人工合成法如：與生物抗性相關(guān)的基因、與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因、與生物藥物和保健品相關(guān)的基因、與毒物降解相關(guān)的基因、與工業(yè)用酶相關(guān)的基因、具調(diào)控作用的因子等。1、直接合成法（鳥槍法）一、目的基因的獲取(一)、目的基因主要是__________3非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點外顯子內(nèi)含子終止子基因的結(jié)構(gòu)啟動子原核真核非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點外顯子內(nèi)含子終止子4原核細胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子①不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細胞的基因結(jié)構(gòu)②調(diào)控遺傳信息表達,上游的RNA聚合酶結(jié)合位點:啟動子原核細胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下5真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)內(nèi)含子外顯子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有RNA聚合酶結(jié)合位點(啟動子)。非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子與RNA聚合酶結(jié)合位點真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)內(nèi)含子外顯子啟動6原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_____的，邊_________邊_________編碼區(qū)是間隔的、_____的，先_____后_____相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼轉(zhuǎn)錄翻譯轉(zhuǎn)錄翻譯原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_____編碼區(qū)是間隔的、相同7下列關(guān)于基因結(jié)構(gòu)的認識中，正確的是（）A．大豆基因中內(nèi)含子是能夠編碼蛋白質(zhì)的序列B．乳酸菌與酵母菌基因結(jié)構(gòu)中都存在外顯子和內(nèi)含子C．大腸桿菌基因與RNA聚合酶結(jié)合位點位于編碼區(qū)的下游D．水稻細胞基因的編碼區(qū)中存在非編碼序列D下列關(guān)于基因結(jié)構(gòu)的認識中，正確的是（81、從基因文庫中獲取目的基因（1）.基因文庫

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。種類基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫1、從基因文庫中獲取目的基因（1）.基因文庫9基因文庫：

基因組文庫：包含該生物的所有基因。部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫基因文庫：部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，10基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系11提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接重組載體基因組文庫導(dǎo)入受體菌中儲存2、基因文庫的構(gòu)建方法①基因組文庫的構(gòu)建提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片12提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時期的mRNA單鏈DNA雙鏈cDNA片段重組載體與載體連接cDNA文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶導(dǎo)入受體菌中儲存②cDNA文庫的構(gòu)建-----逆轉(zhuǎn)錄法：

提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時期的mRNA單鏈DNA雙鏈c13mRNARNA－DNA雜合雙鏈單鏈DNA雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄（cDNA）DNA聚合酶mRNARNA－DNA雜合雙鏈單鏈DNA雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄（c14真核生物的基因用逆轉(zhuǎn)錄法得到的cDNA與原基因相同嗎？有哪些差異？原核生物基因呢？思考？真核生物的基因用逆轉(zhuǎn)錄法得到的cDNA與原基15編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)DNA聚合酶剪接有關(guān)的酶RNA聚合酶mRNA前體mRNA單鏈DNAcDNA逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄剪接逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制啟動子終止子基因不含非編碼序列。即不含非編碼區(qū)和內(nèi)含子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)DNA聚合酶剪接有關(guān)的酶RNA聚合酶m16（3）構(gòu)建基因文庫的目的

怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢?便于在不知道目的基因核苷酸序列的情況下，獲得所需的目的基因。（3）構(gòu)建基因文庫的目的怎樣從基因文庫中得到我們所需17依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性（4）從基因文庫中得到目的基因的方法——直接分離法(鳥槍法)依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。（4）從基因文庫中得到目的基因的方18直接分離法供體細胞中的DNA許多DNA片段運載體限制酶受體細胞產(chǎn)生特定性狀導(dǎo)入外源DNA擴增目的基因分離(鳥槍法)回顧必修課中目的基因的獲取方法有哪些？多用于原核生物直接分離法供體細胞中的DNA許多DNA片段運載體限制酶受體細19基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較20（二）利用PCR技術(shù)擴增目的基因PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一項生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)，可在短時間內(nèi)獲取大量的目的基因。（二）利用PCR技術(shù)擴增目的基因PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)21條件：_______________________前提條件_______________、________、_____、___________________________.原理：__________方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）結(jié)果：DNA復(fù)制一段已知目的基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增(二)利用PCR技術(shù)擴增目的基因過程：模板DNA變性

復(fù)性（退火）延伸條件：_______________________22③過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成________b、退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d.重復(fù)a.b.c步驟：每重復(fù)一次，目的基因增加___倍一③過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱23變性退火延伸變性退火延伸24③過程：③過程：25PCR反應(yīng)體系中目的基因成指數(shù)(2n)形式擴增PCR反應(yīng)體系中目的基因成指數(shù)(2n)形式擴增26DNA復(fù)制PCR技術(shù)場所原理條件解旋方式酶特點結(jié)果PCR技術(shù)擴增與DNA復(fù)制的比較堿基互補配對原則堿基互補配對原則四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP四種脫氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復(fù)制、邊解旋變復(fù)制半保留復(fù)制、全解旋再復(fù)制體外復(fù)制主要在細胞核內(nèi)大量的DNA片段形成整個DNA分子熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細胞內(nèi)的DNA聚合酶、解旋酶、DNA連接酶等DNA復(fù)制PCR技術(shù)場所原理條件解旋方式酶特點結(jié)果PCR技術(shù)27反轉(zhuǎn)錄法目的基因的信使RNA目的基因化學(xué)合成法肽鏈氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成人工合成法（真核生物）推測推測單鏈DNA合成3、人工合成法：核苷酸序列已知的情況下，可以利用DNA合成儀人工合成化學(xué)法合成的目的基因含內(nèi)含子、啟動子和終止子嗎？反轉(zhuǎn)錄法目的基因的信使RNA目的基因化學(xué)合成法肽鏈氨基酸序列28一、目的基因的獲取1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術(shù)擴增3、人工合成種類基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫課堂小結(jié)：一、目的基因的獲取1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術(shù)擴增29（1）用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。（2）用___________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同1.過程:二、基因表達載體的構(gòu)建（核心）（1）用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，30質(zhì)粒目的基因限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶表達載體同一種質(zhì)粒目的基因限制酶處理一個切口兩個切口DNA連接酶表達載體同312.基因表達載體的組成：它們所處的位置和有什么作用？a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標(biāo)記基因位于基因的首端,是mRNA結(jié)合位點位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細胞2.基因表達載體的組成：它們所處的位置和有什么作用？a、目的323、基因表達載體的作用a、使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代b、同時使目的基因能表達和發(fā)揮作用思考：作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。3、基因表達載體的作用a、使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并遺33①載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：限制酶、DNA連接酶③啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少④目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。注意①載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點兩部分DN34常用的受體細胞：原核生物：大腸桿菌枯草桿菌土壤農(nóng)桿菌真核生物：酵母菌和動植物細胞將目的基因?qū)胧荏w細胞的原理借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。轉(zhuǎn)化：目的基因進入_________內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細胞穩(wěn)定表達三、將目的基因?qū)胧荏w細胞常用的受體細胞：原核生物：大腸桿菌枯草桿菌土壤農(nóng)桿菌將目351、將目的基因?qū)胫参锛毎?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點:能感染雙子葉植物和祼子植物,對大多數(shù)單子葉植物無感染能力Ti質(zhì)粒的T—DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞并整合到其染色體上轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達載體導(dǎo)入植物細胞整合植物細胞染色體DNA表達新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌1、將目的基因?qū)胫参锛毎?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點:能感染雙子36整合到染色體上轉(zhuǎn)移至受體細胞整合到染色體上轉(zhuǎn)移至受體細胞37（2）基因槍法——微彈轟擊法特點：成本高適用于單子葉植物基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。（2）基因槍法——微彈轟擊法特點：成本高適用于單子葉植物38胚珠花藥花絲柱頭花柱子房壁子房雄蕊雌蕊（3）花粉通道法胚珠花藥花絲柱頭花柱子房壁子房雄蕊雌蕊（3）花粉通道法39植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用這種方法獲得植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通402、將目的基因?qū)雱游锛毎椒?顯微注射技術(shù)操作程序:提純含目的基因表達載體取受精卵顯微注射移植到子宮早期胚胎新性狀動物2、將目的基因?qū)雱游锛毎椒?顯微注射技術(shù)操作程序:提純含413、將目的基因?qū)胛⑸锛毎Ｓ梅ǎ篊a2+處理常用菌：大腸桿菌微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎Ｓ梅ǎ篊a2+處理常用菌：大腸42小結(jié)：將目的基因?qū)胧荏w細胞1.將目的基因?qū)胫参锛毎D(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法2.將目的基因?qū)雱游锛毎@微注射技術(shù)3.將目的基因?qū)胛⑸锛毎鸆a2+處理小結(jié)：將目的基因?qū)胧荏w細胞1.將目的基因?qū)胫参?3植物基因工程動物基因工程微生物基因工程常用方法受體細胞比較目的基因?qū)氩煌毎姆椒ㄞr(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射法Ca2+處理法體細胞受精卵原核細胞植物基因工程動物基因工程微生物基因工程常用方法受體細胞比較目441、基因工程中科學(xué)家常用細菌、酵母菌等微生物作為受體細胞，原因是A．結(jié)構(gòu)簡單、操作方便B．繁殖速度快C．遺傳物質(zhì)含量少、簡單D．性狀穩(wěn)定、變異少2、基因工程常用的受體細胞有①大腸桿菌②枯草桿菌③支原體④動植物細胞A．①②③④B．①②③C．②③④D．①②④BD1、基因工程中科學(xué)家常用細菌、酵母菌等微生物作為受體細胞，原45檢測①導(dǎo)入檢測：目的基因是否導(dǎo)入受體細胞方法——DNA分子雜交②表達檢測轉(zhuǎn)錄檢測——分子雜交翻譯檢測——抗原抗體雜交分子檢測法鑒定抗蟲鑒定抗病鑒定活性鑒定等個體水平的鑒定四、目的基因的表達和檢測檢測①導(dǎo)入檢測：目的基因是否導(dǎo)入受體細胞方法——DNA分子雜46（一）、檢測1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因(關(guān)鍵步驟)①.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針③.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中（1）方法:DNA分子雜交（2）過程:（一）、檢測1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的47基因工程的過程課件482、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等①方法:分子雜交方法:抗原抗體雜交②過程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA二、個體水平鑒定：鑒定性狀2、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA3、檢測目的基因是否翻譯49目的基因的表達和檢測抗蟲鑒定抗病鑒定活性鑒定等抗原－抗體雜交法DNA-RNA分子雜交法DNA分子雜交法受體是否具有轉(zhuǎn)基因特征個體水平目的基因是否翻譯目的基因是否轉(zhuǎn)錄目的基因是否導(dǎo)入分子水平方法檢測對象目的基因的表達和檢測抗蟲鑒定抗病鑒定抗原－抗體雜交法DN50目的基因?qū)胧荏w細胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性，只有通過鑒定和檢測才能知道。下列屬于目的基因檢測和鑒定的是①檢測受體細胞中是否有目的基因②檢測受體細胞中是否有致病基因③檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA④檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)A．①②③B．②③④C．①③④D．①②④C目的基因?qū)胧荏w細胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性，只51采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的是①將毒素蛋白質(zhì)注射到棉受精卵中②將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中③將編碼毒素蛋白的DNA序列與細菌質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進入受精卵中④將編碼毒素蛋白的DNA序列與質(zhì)粒重組，導(dǎo)人細菌感染棉的體細胞，再進行組織培養(yǎng)A．①②B．②③C．③④D．①④C采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的52歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達載體目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法、Ca2+處理目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定：歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因53練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的

處，DNA連接酶作用于

處。（填“a”或“b”）aa練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量54練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和________法。（3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細胞培養(yǎng)成植株需要利用________技術(shù)，該技術(shù)的核心是____

和

。（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的_____作探針進行分子雜交檢測，又要用______________方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性?；驑尫ㄖ参锝M織培養(yǎng)再分化脫分化目的基因一定濃度鹽水澆灌練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量55（1）a

a

（2）基因槍法（花粉管通道法）

（3）植物組織培養(yǎng)（1分）

脫分化（去分化）

再分化

（4）耐鹽基因（目的基因）

一定濃度鹽水澆灌（移栽到鹽堿地中）（1）a

a56有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）A、限制酶只在獲得目的基因時才用B、重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成C、質(zhì)粒都可作為運載體D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料D有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是（）A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得C、目的基因須由運載體導(dǎo)入受體細胞D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶A有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）D有關(guān)基因工57C基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是A、人工合成目的基因B、目的基因的檢測和表達C、將目的基因?qū)胧荏w細胞D、目的基因與運載體結(jié)合（多選）人們利用基因工程的方法，用大腸桿菌生產(chǎn)人類胰島素，這一過程涉及到A.用適當(dāng)?shù)拿笇σ葝u素基因與運載體進行切割并連接B.把重組后的DNA分子導(dǎo)入受體細菌內(nèi)進行擴增C.檢測重組DNA分子是否導(dǎo)入受體細菌內(nèi)并表達出性狀D.篩選出能產(chǎn)生胰島素的“工程菌”ABCDC基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的。在基因操作的基58培養(yǎng)培養(yǎng)培養(yǎng)導(dǎo)入含目的基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌含有氨芐青霉素的完全培養(yǎng)基含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基兩種培養(yǎng)基均不能生長大腸桿菌Ca2+處理細胞形成感受態(tài)細胞檢測（培養(yǎng)不具有氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性積基因的大腸桿菌）只有氨芐青霉素抗性基因質(zhì)粒只具有氨芐青霉素抗性基因大腸桿菌不具有氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性積基因的大腸桿菌完全培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)培養(yǎng)導(dǎo)入含目的基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌含有氨芐青霉59導(dǎo)入接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基大腸桿菌不含抗四環(huán)素基因證明：不存活含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基證明：大腸桿菌的受體細胞含有目的基因

四環(huán)素抗性基因

四環(huán)素抗性基因存活如何把導(dǎo)入了目的基因的受體細胞篩選出來？存活導(dǎo)入接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基60導(dǎo)入接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基大腸桿菌不含抗四環(huán)素基因證明：不存活含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基證明：大腸桿菌含抗四環(huán)素基因證明：大腸桿菌的受體細胞含有目的基因

四環(huán)素抗性基因

四環(huán)素抗性基因完全培養(yǎng)基存活如何把導(dǎo)入了目的基因的受體細胞篩選出來？導(dǎo)入接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基完61基因工程的過程課件621.2基因工程的基本操作程序1.2基因工程的基本操作程序631、目的基因的獲取2、基因表達載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細胞4、目的基因的檢測與鑒定基因工程基本操作的四個步驟1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧?4一、目的基因的獲取(一)、目的基因主要是______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些?從基因文庫中獲取利用PCR技術(shù)擴增2、人工合成法如：與生物抗性相關(guān)的基因、與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因、與生物藥物和保健品相關(guān)的基因、與毒物降解相關(guān)的基因、與工業(yè)用酶相關(guān)的基因、具調(diào)控作用的因子等。1、直接合成法（鳥槍法）一、目的基因的獲取(一)、目的基因主要是__________65非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點外顯子內(nèi)含子終止子基因的結(jié)構(gòu)啟動子原核真核非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點外顯子內(nèi)含子終止子66原核細胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子①不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細胞的基因結(jié)構(gòu)②調(diào)控遺傳信息表達,上游的RNA聚合酶結(jié)合位點:啟動子原核細胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下67真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)內(nèi)含子外顯子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有RNA聚合酶結(jié)合位點(啟動子)。非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子與RNA聚合酶結(jié)合位點真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)內(nèi)含子外顯子啟動68原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_____的，邊_________邊_________編碼區(qū)是間隔的、_____的，先_____后_____相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼轉(zhuǎn)錄翻譯轉(zhuǎn)錄翻譯原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_____編碼區(qū)是間隔的、相同69下列關(guān)于基因結(jié)構(gòu)的認識中，正確的是（）A．大豆基因中內(nèi)含子是能夠編碼蛋白質(zhì)的序列B．乳酸菌與酵母菌基因結(jié)構(gòu)中都存在外顯子和內(nèi)含子C．大腸桿菌基因與RNA聚合酶結(jié)合位點位于編碼區(qū)的下游D．水稻細胞基因的編碼區(qū)中存在非編碼序列D下列關(guān)于基因結(jié)構(gòu)的認識中，正確的是（701、從基因文庫中獲取目的基因（1）.基因文庫

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。種類基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫1、從基因文庫中獲取目的基因（1）.基因文庫71基因文庫：

基因組文庫：包含該生物的所有基因。部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫基因文庫：部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，72基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系73提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接重組載體基因組文庫導(dǎo)入受體菌中儲存2、基因文庫的構(gòu)建方法①基因組文庫的構(gòu)建提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片74提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時期的mRNA單鏈DNA雙鏈cDNA片段重組載體與載體連接cDNA文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶導(dǎo)入受體菌中儲存②cDNA文庫的構(gòu)建-----逆轉(zhuǎn)錄法：

提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時期的mRNA單鏈DNA雙鏈c75mRNARNA－DNA雜合雙鏈單鏈DNA雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄（cDNA）DNA聚合酶mRNARNA－DNA雜合雙鏈單鏈DNA雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄（c76真核生物的基因用逆轉(zhuǎn)錄法得到的cDNA與原基因相同嗎？有哪些差異？原核生物基因呢？思考？真核生物的基因用逆轉(zhuǎn)錄法得到的cDNA與原基77編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)DNA聚合酶剪接有關(guān)的酶RNA聚合酶mRNA前體mRNA單鏈DNAcDNA逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄剪接逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制啟動子終止子基因不含非編碼序列。即不含非編碼區(qū)和內(nèi)含子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)DNA聚合酶剪接有關(guān)的酶RNA聚合酶m78（3）構(gòu)建基因文庫的目的

怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢?便于在不知道目的基因核苷酸序列的情況下，獲得所需的目的基因。（3）構(gòu)建基因文庫的目的怎樣從基因文庫中得到我們所需79依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性（4）從基因文庫中得到目的基因的方法——直接分離法(鳥槍法)依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。（4）從基因文庫中得到目的基因的方80直接分離法供體細胞中的DNA許多DNA片段運載體限制酶受體細胞產(chǎn)生特定性狀導(dǎo)入外源DNA擴增目的基因分離(鳥槍法)回顧必修課中目的基因的獲取方法有哪些？多用于原核生物直接分離法供體細胞中的DNA許多DNA片段運載體限制酶受體細81基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較82（二）利用PCR技術(shù)擴增目的基因PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一項生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)，可在短時間內(nèi)獲取大量的目的基因。（二）利用PCR技術(shù)擴增目的基因PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)83條件：_______________________前提條件_______________、________、_____、___________________________.原理：__________方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）結(jié)果：DNA復(fù)制一段已知目的基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增(二)利用PCR技術(shù)擴增目的基因過程：模板DNA變性

復(fù)性（退火）延伸條件：_______________________84③過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成________b、退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d.重復(fù)a.b.c步驟：每重復(fù)一次，目的基因增加___倍一③過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱85變性退火延伸變性退火延伸86③過程：③過程：87PCR反應(yīng)體系中目的基因成指數(shù)(2n)形式擴增PCR反應(yīng)體系中目的基因成指數(shù)(2n)形式擴增88DNA復(fù)制PCR技術(shù)場所原理條件解旋方式酶特點結(jié)果PCR技術(shù)擴增與DNA復(fù)制的比較堿基互補配對原則堿基互補配對原則四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP四種脫氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復(fù)制、邊解旋變復(fù)制半保留復(fù)制、全解旋再復(fù)制體外復(fù)制主要在細胞核內(nèi)大量的DNA片段形成整個DNA分子熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細胞內(nèi)的DNA聚合酶、解旋酶、DNA連接酶等DNA復(fù)制PCR技術(shù)場所原理條件解旋方式酶特點結(jié)果PCR技術(shù)89反轉(zhuǎn)錄法目的基因的信使RNA目的基因化學(xué)合成法肽鏈氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成人工合成法（真核生物）推測推測單鏈DNA合成3、人工合成法：核苷酸序列已知的情況下，可以利用DNA合成儀人工合成化學(xué)法合成的目的基因含內(nèi)含子、啟動子和終止子嗎？反轉(zhuǎn)錄法目的基因的信使RNA目的基因化學(xué)合成法肽鏈氨基酸序列90一、目的基因的獲取1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術(shù)擴增3、人工合成種類基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫課堂小結(jié)：一、目的基因的獲取1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術(shù)擴增91（1）用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。（2）用___________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同1.過程:二、基因表達載體的構(gòu)建（核心）（1）用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，92質(zhì)粒目的基因限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶表達載體同一種質(zhì)粒目的基因限制酶處理一個切口兩個切口DNA連接酶表達載體同932.基因表達載體的組成：它們所處的位置和有什么作用？a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標(biāo)記基因位于基因的首端,是mRNA結(jié)合位點位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細胞2.基因表達載體的組成：它們所處的位置和有什么作用？a、目的943、基因表達載體的作用a、使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代b、同時使目的基因能表達和發(fā)揮作用思考：作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。3、基因表達載體的作用a、使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并遺95①載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：限制酶、DNA連接酶③啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少④目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。注意①載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點兩部分DN96常用的受體細胞：原核生物：大腸桿菌枯草桿菌土壤農(nóng)桿菌真核生物：酵母菌和動植物細胞將目的基因?qū)胧荏w細胞的原理借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。轉(zhuǎn)化：目的基因進入_________內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細胞穩(wěn)定表達三、將目的基因?qū)胧荏w細胞常用的受體細胞：原核生物：大腸桿菌枯草桿菌土壤農(nóng)桿菌將目971、將目的基因?qū)胫参锛毎?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點:能感染雙子葉植物和祼子植物,對大多數(shù)單子葉植物無感染能力Ti質(zhì)粒的T—DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞并整合到其染色體上轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達載體導(dǎo)入植物細胞整合植物細胞染色體DNA表達新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌1、將目的基因?qū)胫参锛毎?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點:能感染雙子98整合到染色體上轉(zhuǎn)移至受體細胞整合到染色體上轉(zhuǎn)移至受體細胞99（2）基因槍法——微彈轟擊法特點：成本高適用于單子葉植物基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。（2）基因槍法——微彈轟擊法特點：成本高適用于單子葉植物100胚珠花藥花絲柱頭花柱子房壁子房雄蕊雌蕊（3）花粉通道法胚珠花藥花絲柱頭花柱子房壁子房雄蕊雌蕊（3）花粉通道法101植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆螅ǚ坌纬傻幕ǚ酃苓€未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用這種方法獲得植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通1022、將目的基因?qū)雱游锛毎椒?顯微注射技術(shù)操作程序:提純含目的基因表達載體取受精卵顯微注射移植到子宮早期胚胎新性狀動物2、將目的基因?qū)雱游锛毎椒?顯微注射技術(shù)操作程序:提純含1033、將目的基因?qū)胛⑸锛毎Ｓ梅ǎ篊a2+處理常用菌：大腸桿菌微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎Ｓ梅ǎ篊a2+處理常用菌：大腸104小結(jié)：將目的基因?qū)胧荏w細胞1.將目的基因?qū)胫参锛毎D(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法2.將目的基因?qū)雱游锛毎@微注射技術(shù)3.將目的基因?qū)胛⑸锛毎鸆a2+處理小結(jié)：將目的基因?qū)胧荏w細胞1.將目的基因?qū)胫参?05植物基因工程動物基因工程微生物基因工程常用方法受體細胞比較目的基因?qū)氩煌毎姆椒ㄞr(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射法Ca2+處理法體細胞受精卵原核細胞植物基因工程動物基因工程微生物基因工程常用方法受體細胞比較目1061、基因工程中科學(xué)家常用細菌、酵母菌等微生物作為受體細胞，原因是A．結(jié)構(gòu)簡單、操作方便B．繁殖速度快C．遺傳物質(zhì)含量少、簡單D．性狀穩(wěn)定、變異少2、基因工程常用的受體細胞有①大腸桿菌②枯草桿菌③支原體④動植物細胞A．①②③④B．①②③C．②③④D．①②④BD1、基因工程中科學(xué)家常用細菌、酵母菌等微生物作為受體細胞，原107檢測①導(dǎo)入檢測：目的基因是否導(dǎo)入受體細胞方法——DNA分子雜交②表達檢測轉(zhuǎn)錄檢測——分子雜交翻譯檢測——抗原抗體雜交分子檢測法鑒定抗蟲鑒定抗病鑒定活性鑒定等個體水平的鑒定四、目的基因的表達和檢測檢測①導(dǎo)入檢測：目的基因是否導(dǎo)入受體細胞方法——DNA分子雜108（一）、檢測1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因(關(guān)鍵步驟)①.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針③.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中（1）方法:DNA分子雜交（2）過程:（一）、檢測1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的109基因工程的過程課件1102、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等①方法:分子雜交方法:抗原抗體雜交②過程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA二、個體水平鑒定：鑒定性狀2、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA3、檢測目的基因是否翻譯111目的基因的表達和檢測抗蟲鑒定抗病鑒定活性鑒定等抗原－抗體雜交法DNA-RNA分子雜交法DNA分子雜交法受體是否具有轉(zhuǎn)基因特征個體水平目的基因是否翻譯目的基因是否轉(zhuǎn)錄目的基因是否導(dǎo)入分子水平方法檢測對象目的基因的表達和檢測抗蟲鑒定抗病鑒定抗原－抗體雜交法DN112目的基因?qū)胧荏w細胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性，只有通過鑒定和檢測才能知道。下列屬于目的基因檢測和鑒定的是①檢測受體細胞中是否有目的基因②檢測受體細胞中是否有致病基因③檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA④檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)A．①②③B．②③④C．①③④D．①②④C目的基因?qū)胧荏w細胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性，只113采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的是①將毒素蛋白質(zhì)注射到棉受精卵中②將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中③將編碼毒素蛋白的DNA序列與細菌質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進入受精卵中④將編碼毒素蛋白的DNA序列與質(zhì)粒重組，導(dǎo)人細菌感染棉的體細胞，再進行組織培養(yǎng)A．①②B．②③C．③④D．①④C采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的114歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達載體目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法、Ca2+處理目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定：歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因1