基因重組及遺傳分析課件

第五章細菌基因重組及遺傳分析基因重組（generecombination）是指不同來源的遺傳物質(zhì)通過轉(zhuǎn)移和交換而重新組合的過程。高等動植物和許多產(chǎn)生有性孢子的真核微生物的基因重組都是通過有性世代來完成。第五章細菌基因重組及遺傳分析基因重組（generecom1在細菌中，提供部分遺傳物質(zhì)或少數(shù)基因的一方稱為供體（donor），而獲得基因的另一方稱為受體（recipient）。在細菌中，提供部分遺傳物質(zhì)或少數(shù)基因的一方稱為供體（dono2第一節(jié)轉(zhuǎn)化（Transformation）轉(zhuǎn)化：是指某一基因型的細胞從周圍介質(zhì)中吸收來自另一基因型細胞的DNA而使受體的基因型和表型發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和轉(zhuǎn)化因子的證實對促進現(xiàn)代分子生物學(xué)的誕生和發(fā)展產(chǎn)生了巨大的推動作用。

在實驗室條件下，通常用CaCl2、cAMP、低溫培養(yǎng)、PEG介導(dǎo)及電脈沖等方法轉(zhuǎn)化細菌或其它微生物。細菌轉(zhuǎn)化的過程大體可分為三個階段：感受態(tài)的出現(xiàn)DNA的吸附和進入DNA的整合第一節(jié)轉(zhuǎn)化（Transformation）轉(zhuǎn)化：是指某一基3感受態(tài)的出現(xiàn)

感受態(tài)（competence）：是指受體菌細胞最容易接受外源DNA并使之不被DNA酶降解的生理狀態(tài)。一、轉(zhuǎn)化過程和機制

細菌細胞在特定時期產(chǎn)生一種稱為感受態(tài)因子的小分子蛋白（5-10kD）。這種感受態(tài)因子可與細胞表面受體蛋白結(jié)合，使細胞產(chǎn)生感受態(tài)特異蛋白，其中包括細胞壁自溶素。自溶素使細胞表面的DNA結(jié)合蛋白及核酸酶裸露出來，使其具有與DNA結(jié)合的活性。因此，當細菌表面出現(xiàn)許多DNA結(jié)合位點時，就意味著細菌出現(xiàn)了感受態(tài)。

感受態(tài)的出現(xiàn)感受態(tài)（competence）：是指受體菌細胞44.進入細胞的單鏈與寄主DNA同源區(qū)重組并整合到染色體上革蘭氏陽性菌1.雙鏈DNA片段在DNA結(jié)合蛋白（黑色點）的幫助下吸附到細胞表面并由核酸酶（紫色橢圓）切成缺口2.由核酸酶降解其中一條單鏈3.未被降解的單鏈與感受態(tài)特異蛋白相互作用并進入細胞DNA的吸附和進入

4.進入細胞的單鏈與寄主DNA同源區(qū)重組并整合到染色體上革5在流感嗜血菌中，其感受態(tài)細胞形成一種結(jié)合雙鏈DNA的膜結(jié)構(gòu)，稱為轉(zhuǎn)化小體（transformasome）。該小體吸附DNA后，與細胞的內(nèi)外膜相融合而轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)側(cè)，再將雙鏈變成單鏈DNA。

轉(zhuǎn)化小體雙鏈DNA被轉(zhuǎn)化小體攝取轉(zhuǎn)化的雙鏈DNA（30-50kb）結(jié)合到膜受體上很快進行同源重組使外源DNA整合到染色體上革蘭氏陰性菌在流感嗜血菌中，其感受態(tài)細胞形成一種結(jié)合雙鏈DNA的膜結(jié)構(gòu)，6DNA在進入感受態(tài)細胞之前，要經(jīng)過可逆性吸附和不可逆性吸附?？赡嫖降腄NA對DNA酶敏感，并可以洗脫下來。隨著感受態(tài)細胞膜蛋白的參與，可逆性吸附逐步向不可逆吸附轉(zhuǎn)化，不可逆吸附DNA對DNA酶不敏感。DNA在進入感受態(tài)細胞之前，要經(jīng)過可逆性吸附和不可逆性吸附。7吸附到細胞表面是雙鏈DNA，而不是單鏈DNA實驗證明：肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化因子在100℃下逐漸失去轉(zhuǎn)化活性(DNA發(fā)生變性)。在逐漸冷卻過程中活性逐漸恢復(fù)(單鏈DNA復(fù)性成雙鏈)。說明完整的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)對于轉(zhuǎn)化活性來說是必要的，轉(zhuǎn)化的第一步，需要雙鏈DNA才能結(jié)合到細胞表面的結(jié)合位點上。當DNA吸附后，被酶解開成單鏈DNA，只有單鏈DNA才能進入細胞內(nèi)并與受體染色體DNA進行整合。

吸附到細胞表面是雙鏈DNA，而不是單鏈DNA實驗證明：肺炎鏈8流感嗜血菌特異性攝取序列：5’AAGTGCGGTCA3’淋病奈瑟球菌特異性攝取序列：5’GCCGTCTCAA3’在流感嗜血菌的染色體上有600個拷貝的攝取序列。攝取序列雖然只有10-12bp，但很少隨機地出現(xiàn)在其他物種的DNA序列中，因此這些細菌對外源DNA的吸收具有選擇性。為什么有些細菌對攝取的DNA有特異性要求呢？近年來的研究表明，G-菌和G＋菌對單鏈DNA也能進行有效轉(zhuǎn)化，但一般是在較低的pH值下進行的。流感嗜血菌特異性攝取序列：5’AAGTGCGGTCA39外源DNA片段在受體細胞中的命運：外源DNA（紅色）轉(zhuǎn)化到受體細胞后，通過同源重組整合到染色體上，否則被降解成核苷酸。

DNA的整合

外源DNA片段在受體細胞中的命運：外源DNA（紅色）轉(zhuǎn)化到受10轉(zhuǎn)化為相同或相近物種之間的同源重組提供了可能性，是自然界中基因交換的一條重要途徑，在生物變異和進化中起著重要作用。轉(zhuǎn)化的效率決定于下列三個內(nèi)在因素：受體細胞的感受態(tài)，決定轉(zhuǎn)化DNA能否進入細胞受體細胞的限制系統(tǒng)，決定轉(zhuǎn)化DNA在整合前是否被分解供體和受體DNA的同源性，決定轉(zhuǎn)化DNA的整合。由于轉(zhuǎn)化DNA總是與順序相同或相似的受體DNA配合，所以親緣關(guān)系越近的其同源性也越強，轉(zhuǎn)化效率也越高。轉(zhuǎn)化為相同或相近物種之間的同源重組提供了可能性，是自然界中基11二、人工轉(zhuǎn)化

通過二價陽離子處理，大腸桿菌等部分G-細菌能產(chǎn)生感受態(tài)通過制備原生質(zhì)，大多數(shù)細菌特別是某些G+細菌

已知許多細菌包括大腸桿菌均無自然轉(zhuǎn)化的能力，但經(jīng)人工誘導(dǎo)可使它們形成感受態(tài)。如：二、人工轉(zhuǎn)化通過二價陽離子處理，大腸桿菌等部分G-細菌能產(chǎn)121970年Mandel和Higa首先發(fā)現(xiàn)DNA在含有高濃度Ca2+的條件下能夠被受體細胞攝入和轉(zhuǎn)化，隨后的實驗證明由Ca2+誘導(dǎo)的人工轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中，其轉(zhuǎn)化DNA必須是一種獨立DNA復(fù)制子。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化隨著研究技術(shù)的改進和經(jīng)驗的積累，人們已經(jīng)建立了用Ca2+、Mg2+等誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的標準程序，能對大腸桿菌菌株C600、JMl01、JMl09、DH5a等進行有效的轉(zhuǎn)化。1970年Mandel和Higa首先發(fā)現(xiàn)DNA在含有高濃度C13先將大腸桿菌培養(yǎng)至OD600=0.5～1接著用50-100mmol／LCaCl2處理制備成感受態(tài)細胞然后將DNA與感受態(tài)細胞混合在冰浴中反應(yīng)20-40min進行42℃熱擊可增加DNA的吸收（107個轉(zhuǎn)化子/ug質(zhì)粒DNA）最經(jīng)典的轉(zhuǎn)化方法是：由于異源的質(zhì)粒DNA分子能夠進入大腸桿菌細胞，所以大腸桿菌攝取DNA是非選擇性的。先將大腸桿菌培養(yǎng)至OD600=0.5～1最經(jīng)典的轉(zhuǎn)化方法是：14PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化不能自然形成感受態(tài)的G+細菌如枯草芽孢桿菌和放線菌，可通過聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG，一般用PEG6000)的作用實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。這類細菌必須首先用細胞壁降解酶完全除去它們的肽聚糖層，然后使其維持在等滲的培養(yǎng)基中，在PEG存在下，質(zhì)粒或噬菌體DNA可被高效地導(dǎo)入原生質(zhì)體。PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化不能自然形成感受態(tài)的G+細菌如枯草芽孢桿菌和15電脈沖法（電穿孔法

）在許多細菌和真核系統(tǒng)中，它們既無自然的感受態(tài)呈現(xiàn)也不能用上述的方法建立感受態(tài)。因此人們發(fā)展了一種新的將核酸分子導(dǎo)入細胞的方法，最突出的是電穿孔(electroporation)法和基因槍(biolistic)轉(zhuǎn)化法。電穿孔法：是用高壓脈沖電流擊破細胞膜或?qū)⒓毎舫尚】?，使各種大分子(包括DNA)能通過這些小孔進入細胞，所以又稱電轉(zhuǎn)化。電場強度、電脈沖的長度和DNA濃度電脈沖法（電穿孔法）在許多細菌和真核系統(tǒng)中，它們既無自然的16基因槍(biolistic)轉(zhuǎn)化

基因槍轉(zhuǎn)化法首先由Sanford報道，該方法是將包裹有DNA的鎢顆粒像子彈一樣用高壓射進細胞并使DNA留在細胞內(nèi)，特別是留在細胞器中。用這種方法首次成功地將DNA導(dǎo)入酵母線粒體并引起線粒體遺傳變化。基因槍轉(zhuǎn)化現(xiàn)在被廣泛地應(yīng)用于植物的轉(zhuǎn)化中基因槍(biolistic)轉(zhuǎn)化基因槍轉(zhuǎn)化法首先由Sanf17三、建立轉(zhuǎn)化方法的策略被轉(zhuǎn)化對象（轉(zhuǎn)化受體）轉(zhuǎn)化DNA的構(gòu)建（目的）轉(zhuǎn)化方法選擇三、建立轉(zhuǎn)化方法的策略被轉(zhuǎn)化對象（轉(zhuǎn)化受體）18四、轉(zhuǎn)化應(yīng)用在轉(zhuǎn)化中，如果轉(zhuǎn)化因子的兩個基因是連鎖的，那么它們可以同時被轉(zhuǎn)化，也稱為共轉(zhuǎn)化，連鎖的兩個基因距離越近，其共轉(zhuǎn)化頻率越高，反之則低。利用共轉(zhuǎn)化率和連鎖的二基因間的距離的反比關(guān)系可進行基因定位的工作。1.連鎖檢測四、轉(zhuǎn)化應(yīng)用在轉(zhuǎn)化中，如果轉(zhuǎn)化因子的兩個基因是連鎖的，那么192.遺傳圖譜的繪制trp2+his2+tyr1+（供體）×trp2-his2-tyr1-

（受體）的轉(zhuǎn)化類型trp2-his2重組率=2600+107+3660+418×100%=34%11940+1180+2600+107+3660+418

trp2-tyr1重組率=2600+1180+3660+685×100%=40%11940+107+2600+1180+3660+685his2-tyr1重組率=418+1180+685+107×100%=13%11940+3660+418+1180+685+107trp2his2tyr1

3413402.遺傳圖譜的繪制trp2+his2+tyr1+（供體）×203.基因中斷3.基因中斷214.插入基因4.插入基因22第二節(jié)接合作用（conjugation）接合作用：是指在供體細胞和受體細胞直接接觸后，質(zhì)粒從供體細胞向受體細胞轉(zhuǎn)移的過程，也稱細菌雜交

。

一、接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)與證實

Lederberg和Tatum（1946年）建立了用大腸桿菌K12的兩個營養(yǎng)缺陷型菌株在基本培養(yǎng)基上是否生長，來檢驗細菌雜交或重組存在的方法。在此以前，沒有人證實細菌雜交現(xiàn)象。細菌雜交有別于典型的有性雜交，故稱為細菌接合作用。第二節(jié)接合作用（conjugation）接合作用：是指在23A菌株B菌株A菌株B菌株24混合培養(yǎng)后在基本培養(yǎng)基中出現(xiàn)的原養(yǎng)型菌落是否是雜交的結(jié)果？必須要排除下列幾種解釋：一是細菌細胞并沒有接合，而是交換了DNA(轉(zhuǎn)化作用)二是細胞并未接合，而是通過培養(yǎng)基交換了養(yǎng)料(互養(yǎng))三是細菌細胞并未接合而是親本發(fā)生了回復(fù)突變混合培養(yǎng)后在基本培養(yǎng)基中出現(xiàn)的原養(yǎng)型菌落是否是雜交的結(jié)果？25當時Lederberg和Tatum已經(jīng)證明，當把A菌株的培養(yǎng)液經(jīng)過滅菌，再加入到B菌株的培養(yǎng)液中，沒有原養(yǎng)型菌落，這說明上述實驗并非轉(zhuǎn)化的結(jié)果。1950年，Davis通過他的U形管試驗進一步支持了Lederberg和Tatum的結(jié)論。1.轉(zhuǎn)化作用的排除當時Lederberg和Tatum已經(jīng)證明，當把A菌株的培養(yǎng)26營養(yǎng)缺陷型細胞通過培養(yǎng)基交換養(yǎng)料而生長的現(xiàn)象亦稱為互養(yǎng)。2.互養(yǎng)的排除在A-B+T1s和A+B-T1r的雜交中，將基因型A-B+T1s和A+B-T1r兩種細菌在基本培養(yǎng)基上混合培養(yǎng)，接觸較短的一段時間以后，噴上噬菌體T1，把A-B+T1s細菌殺死。經(jīng)培養(yǎng)以后仍有原養(yǎng)型菌落出現(xiàn)，這說明原養(yǎng)型菌落的出現(xiàn)并非由于互養(yǎng)。

營養(yǎng)缺陷型細胞通過培養(yǎng)基交換養(yǎng)料而生長的現(xiàn)象亦稱為互養(yǎng)。2.27因為大腸桿菌的突變率一般都<10-8，若兩個基因同時回復(fù)突變，則其可能性只有<10-16（10-8×10-8），這種幾率在平板上是很難檢測到的，所以混合培養(yǎng)能出現(xiàn)10-5~10-6頻率的菌落一定是重組的結(jié)果。3.回復(fù)突變的排除因為大腸桿菌的突變率一般都<10-8，若兩個基因同時回復(fù)突變284.遺傳物質(zhì)的單向轉(zhuǎn)移正交實驗（A）Strs×（B）Strr用鏈霉素將A菌株殺死重組體的數(shù)目變化不大(A)Strr×(B)Strs將B菌株殺死一個重組體也沒有出現(xiàn)反交實驗（A）met-bio-（Strr或Strs

）×（B）thr-leu-thi-（Strs或Strr）Hayse（1952）用正反雜交實驗證明，細菌重組的發(fā)生只是染色體單方向的轉(zhuǎn)移，而且染色體的轉(zhuǎn)移往往不完全。

4.遺傳物質(zhì)的單向轉(zhuǎn)移正交實驗（A）Strs×（B）St29把A菌株認為是供體，而B菌株是受體A菌株作為遺傳物質(zhì)的供體，當鏈霉素對它進行滅活以后，并未影響它傳遞遺傳物質(zhì)的能力。B菌株作為遺傳物質(zhì)的受體，一旦被鏈霉素殺死以后，必然不能出現(xiàn)重組體。供體菌株又稱為雄性細胞，受體菌株又稱為雌性細胞把A菌株認為是供體，而B菌株是受體供體菌株又稱為雄性細胞，受30StrrA突變型（不育變種）⊙置冰箱1年后供體的A菌株Strr×B菌株Strs可育的StrsA菌株共培養(yǎng)，一起繁殖不能得到雜交子StrrA菌株×B菌株Strs恢復(fù)了StrrA突變型的可育性F質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)(Hayes)StrrA突變型（不育變種）⊙置冰箱1年后供體的A菌株Str31①大腸桿菌的供體或雄性細胞(如A菌株)記為F+，帶有一個性因子或致育因子F(fertilityfactor)，而另一個不帶性因子F的受體或雌性細胞(如B菌株)叫做F-；②雜交F+×F-是可育的，雜交F-×F-是不育的；③F因子可以傳遞，從F+到F-細菌，但必須通過細胞接觸④F因子能夠自發(fā)喪失，一旦喪失就不能再恢復(fù)，除非從另一個F+細胞再把它傳遞過來。分析結(jié)果：①大腸桿菌的供體或雄性細胞(如A菌株)記為F+，帶有一個性32F因子是染色體外的一種遺傳結(jié)構(gòu)，也就是質(zhì)粒(plasmid)。F+是一種遺傳性狀F因子的存在使細菌成為F+F因子的喪失使細菌成為F-F+細菌分裂仍得到F+細胞F因子是染色體外的一種遺傳結(jié)構(gòu)，也就是質(zhì)粒(plasmid)33二、F質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)及其在細胞中的存在狀態(tài)F質(zhì)粒的遺傳結(jié)構(gòu)

F質(zhì)粒的基因組由三個主要區(qū)段組成：轉(zhuǎn)移區(qū)、復(fù)制區(qū)、插入?yún)^(qū)。二、F質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)及其在細胞中的存在狀態(tài)F質(zhì)粒的遺傳結(jié)構(gòu)F34長度為33kb，由23個基因組成，構(gòu)成一個tra操縱子(traoperon)。traABCEFGHKLQUVW與性菌毛的形成有關(guān)traYZMIGD等與F因子的轉(zhuǎn)移有關(guān)

traG、traN影響雜交對的配對形成與否

traI、traM決定DNA轉(zhuǎn)移起始

traI編碼解旋酶I(helicaseⅠ)traD控制DNA轉(zhuǎn)移；

traY、traZ編碼的核酸內(nèi)切酶能在轉(zhuǎn)移起始區(qū)

oriT上切開一個缺口。（1）轉(zhuǎn)移區(qū)(transferregion)長度為33kb，由23個基因組成，構(gòu)成一個tra操縱子(t35復(fù)制區(qū)負責F質(zhì)粒的自我復(fù)制F質(zhì)粒自主復(fù)制區(qū)為oriV（Vegetativeoriginofreplication），在oriV中包含有復(fù)制起點。F質(zhì)粒的復(fù)制是按θ型方式進行復(fù)制，它是一種嚴緊型質(zhì)粒。F質(zhì)粒的拷貝數(shù)能被精確地控制，一個寄主細胞約有1~2個F質(zhì)粒。rep（Freplicativeprotein）編碼一組與F質(zhì)粒復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)。inc（incompatibility）基因產(chǎn)物使細胞具有不相容性。（2）復(fù)制區(qū)（replicationregion）復(fù)制區(qū)負責F質(zhì)粒的自我復(fù)制（2）復(fù)制區(qū)（replicatio36F質(zhì)粒插入?yún)^(qū)包含4個插入順序：2個IS31個IS21個Tn1000（γδ）它們與F質(zhì)粒的整合、切除、易位有關(guān)（3）插入?yún)^(qū)（insertionregion）F質(zhì)粒插入?yún)^(qū)包含4個插入順序：（3）插入?yún)^(qū)（insertio372.F質(zhì)粒在細胞內(nèi)的存在形式

根據(jù)大腸桿菌細胞內(nèi)有無F質(zhì)粒及F質(zhì)粒在細胞內(nèi)的存在狀態(tài)可將細胞分為4種類型：F-、F+、Hfr、F’。F-：是細胞內(nèi)不含F(xiàn)質(zhì)粒；F+：是細胞內(nèi)含有F質(zhì)粒且獨立染色體外；Hfr菌株(highfrequencyrecombinationstrain)：高頻重組菌株：是F質(zhì)粒整合到宿主的染色體上，隨著宿主染色體的復(fù)制而復(fù)制；F’是指攜帶了宿主的一部分染色體的F質(zhì)粒。

2.F質(zhì)粒在細胞內(nèi)的存在形式根據(jù)大腸桿菌細胞內(nèi)有無F質(zhì)粒38三、F質(zhì)粒與接合作用1.F+×F-雜交有F質(zhì)粒的細胞在形態(tài)學(xué)上可以與F-明顯區(qū)別。除了共有的大量表面菌毛以外，F(xiàn)+還有少量（通常在細胞對數(shù)生長期中只有1~3根）性菌毛。纖細的蛋白質(zhì)性菌毛有的長數(shù)毫米，直徑約為8nm。性菌毛在細菌的接合過程中起著十分重要的作用。三、F質(zhì)粒與接合作用1.F+×F-雜交39基因重組及遺傳分析課件402.Hfr×F-雜交

Hfr菌株是怎樣形成的呢?

F質(zhì)粒有兩種方式整合到染色體上：同源重組、質(zhì)粒和染色體共有插入序列和轉(zhuǎn)座子。大腸桿菌染色體基因組有7個IS1、13個IS2及6個IS3；F質(zhì)粒有1個IS2和2個IS3。

2.Hfr×F-雜交Hfr菌株是怎樣形成的呢?41基因重組及遺傳分析課件42基因重組及遺傳分析課件433.F’×F-雜交

F質(zhì)粒在脫離Hfr細胞的染色體時也會發(fā)生差錯，從而形成帶有細菌染色體基因的F′質(zhì)粒。而F′因子又可通過交換融合到細菌染色體的原來位置上，回復(fù)到原來的Hfr狀態(tài)。由于在F’×F-接合使用中能專一性地向F-轉(zhuǎn)移F′質(zhì)粒攜帶的供體基因，因而通過F′因子的轉(zhuǎn)移而使受體菌改變其遺傳性狀，這種現(xiàn)象也被稱為F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)。3.F’×F-雜交F質(zhì)粒在脫離Hfr細胞的染色體時也會44四、中斷雜交試驗和基因定位中斷雜交：就是將兩個菌株（例如Hfra+strs×F-astrr）在培養(yǎng)液中進行通風(fēng)培養(yǎng)，每隔一定時間取樣，把菌液放入組織搗碎器里攪拌以中斷雜交，經(jīng)過稀釋接種到鑒別培養(yǎng)基上，待形成菌落后鑒定它們的基因型。

1957年Wollman和Jacob首次進行中斷雜交實驗：供體菌：HfrHstrsthr+leu+azistonslac+gal+受體菌：F-

strrthr?leu-azirtonrlac-gal-0azitonlacgalF四、中斷雜交試驗和基因定位中斷雜交：就是將兩個菌株（例如H450thrlactrphisthyargstrF2827456169730thrlact46基因重組及遺傳分析課件47Peptide-inducedtransferofEnterococcusfaecalisplasmidpCF10.(A)PeptidepheromonecCF10(triangles)isexpressedfromthechromosomeofbothplasmid-containingdonorcellsandplasmid-freerecipientcells.Inhibitorpeptide(stars)isexpressedfrompCF10andsecretedintothemediumtopreventpheromonefromthedonorcellfrominducingitself,probablythroughcompetitivebindingtothepheromonebindingproteinPrgZ.(B)PheromonefromanearbyrecipientcellisdetectedbyPrgZ.PrgZimportsthepeptidepheromoneusingthechromosomallyencodedOpp(Oligopeptidepermease)system.(C)ImportedcCF10inducesexpressionoftransfergenes,includingthecell–surfaceadhesinPrgB.(D)PrgBmediatesaggregationofthedonorandrecipientcells.Amatingchannelisthenformedandsingle-strandedpCF10istransferredtothedonorcellviaarollingcirclemechanism.AfterpCF10hasestablisheditselfintherecipientcell,theinhibitorpeptideandanothermechanismofnegativecontrol,PrgY,isexpressedtopreventself-inductionbyendogenouscCF10.Peptide-inducedtransferofEn48第三節(jié)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)轉(zhuǎn)導(dǎo)：是利用噬菌體為媒介，將供體菌的部分DNA轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)的現(xiàn)象。因為絕大多數(shù)細菌都有噬菌體，所以轉(zhuǎn)導(dǎo)作用較普遍。另外，轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA位于噬菌體蛋白外殼內(nèi)，不易被外界的DNA水解酶所破壞，所以比較穩(wěn)定。局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)：被轉(zhuǎn)導(dǎo)的DNA片段僅僅是那些靠近染色體上溶源化位點的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)：任何供體的染色體都可以轉(zhuǎn)移至受體細胞第三節(jié)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)轉(zhuǎn)導(dǎo)：是利用噬菌491952年Lederberg和他的學(xué)生Zinder把鼠傷寒沙門菌的一個突變菌株LT22(trp-)和另一個突變菌株LT2(his-)在基本培養(yǎng)基上進行混合培養(yǎng)，結(jié)果在107細胞中得到大約100個原養(yǎng)型菌落。

一、轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)

1952年Lederberg和他的學(xué)生Zinder把鼠傷寒沙50LT2菌株LT22菌株中間用濾板隔開U形管實驗LT2菌株LT22菌株中間用濾板隔開U形管實驗51①可過濾因子并不由于DNA酶的處理而失活；②可過濾因子和從溶源性的LT22菌株得來的噬菌體(稱為

P22)具有相同的大小和質(zhì)量；③可過濾因子加熱后失活，用抗P22血清處理后也失活；④把P22與LT2和LT22菌株分別混合培養(yǎng)，在基本培養(yǎng)基上不出現(xiàn)原養(yǎng)型菌落。結(jié)果證實了可過濾因子是溫和噬菌體P22。這就是最早發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。

通過一系列的實驗，證實可過濾因子具有下列一些特性：①可過濾因子并不由于DNA酶的處理而失活；通過一系列的實驗52轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中有三個組成部分，即供體、噬菌體和受體。這種導(dǎo)致基因重組的方式不同于轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化需要供體DNA和受體細胞接觸，而轉(zhuǎn)導(dǎo)則是以噬菌體為媒介將供體遺傳物質(zhì)傳給受體，無需DNA和受體細胞接觸。轉(zhuǎn)導(dǎo)可分為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)，普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)又可分為完全轉(zhuǎn)導(dǎo)和流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)。二、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中有三個組成部分，即供體、噬菌體和受體。這種導(dǎo)致基因531.完全轉(zhuǎn)導(dǎo)1.完全轉(zhuǎn)導(dǎo)54P1供體收集子代噬菌體菌苔計數(shù)噬菌體（完全培養(yǎng)基）受體（缺陷型大腸桿菌）選出重組子（轉(zhuǎn)導(dǎo)子）（基本培養(yǎng)基）侵染裂解侵染野生型轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率=

轉(zhuǎn)導(dǎo)子數(shù)×100%=

轉(zhuǎn)導(dǎo)子數(shù)×100%

侵染受體的P1顆粒數(shù)噬菌斑數(shù)+轉(zhuǎn)導(dǎo)子數(shù)P1供體收集子代噬菌體菌苔計數(shù)552.流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)2.流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)563.普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用(1)共轉(zhuǎn)導(dǎo)：普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要應(yīng)用之一是通過測定共轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率進行基因定位，所謂共轉(zhuǎn)導(dǎo)(cotransduction)是指兩個處在一個轉(zhuǎn)導(dǎo)片段上的基因一起整合進受體染色體中。

被共轉(zhuǎn)導(dǎo)的兩個基因之間的距離不能超過轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體所能包裝的DNA長度，而且越是緊密連鎖的基因其共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率也越高。3.普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用(1)共轉(zhuǎn)57F為共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率，d為基因間距離，L為轉(zhuǎn)導(dǎo)片段長度（這里指噬菌體基因組長度，用分鐘表示）F=(1－d/L)3

d=L(1－3√F)以thr+leu+為供體，以thr-leu-為受體的P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗中，得到1%的thr+leu+轉(zhuǎn)導(dǎo)子，計算thr和leu之間的遺傳圖距。（P1噬菌體基因組約為大腸桿菌染色體長度的2.4%）

d=2.4×(1－3√0.01)=2.4×(1-0.215)=1.883

F為共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率，d為基因間距離，L為轉(zhuǎn)導(dǎo)片段長度（這里指噬58(2)三點雜交法：P1噬菌體所進行的共轉(zhuǎn)導(dǎo)被廣泛應(yīng)用于大腸桿菌的基因定位中。1955年Lennox用P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)寄主大腸桿菌染色體，研究基因連鎖關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，thr和leu有時能、有時不能與第三個基因ara共轉(zhuǎn)導(dǎo)。他用P1噬菌體感染供體(thr+

leu+

ara+)，用所得到的噬菌體裂解液去感染受體菌(thr-

leu-

ara-)，得到的結(jié)果。

(2)三點雜交法：P1噬菌體所進行的共轉(zhuǎn)導(dǎo)被廣泛應(yīng)用于大腸桿59實驗1可知：ara基因與leu基因靠得較近，而與thr基因相距較遠，排列順序應(yīng)是thr-ara-leu或thr-leu-ara。如果是前一種情況，則thr+leu+轉(zhuǎn)導(dǎo)子應(yīng)該大多數(shù)含有ara+基因；如果是后一種形式，則thr+leu+轉(zhuǎn)導(dǎo)子應(yīng)該很少含有是ara+，或者根本沒有。而由實驗2可知，thr+leu+轉(zhuǎn)導(dǎo)子同時又是ara+的占85％，所以上述3個基因的排列順序是第1種。實驗1可知：ara基因與leu基因靠得較近，而與thr基因相60三、局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)(specializedtransduction)

局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)：是指以噬菌體為媒介，只能將供體菌特定的一個或幾個基因轉(zhuǎn)移到受體菌中的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。導(dǎo)致局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)的一般都是溫和噬菌體，它們在供體菌染色體上具有特定的整合位點。在某些條件下，當這種整合狀的原噬菌體脫離寄主染色體時，偶爾會將整合位點兩端相鄰的基因錯誤地切離下來，并組裝到噬菌體顆粒中。當這種噬菌體感染另一細菌時，就將原寄主的基因轉(zhuǎn)移到另一細菌中。三、局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)(specializedtransducti611162高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)的原理不正常環(huán)出形成特殊性轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)的原理不正常環(huán)出形成特殊性轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒63這種缺陷噬菌體亦是轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體，它具有感染能力，能整合到寄主染色體相同的位點上形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。所得轉(zhuǎn)導(dǎo)子的頻率約為10-6，稱為低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。當攜帶有g(shù)al基因的λ缺陷噬菌體和正常的λ噬菌體在同一細胞時，正常λ噬菌體整合到寄主的染色體上后，產(chǎn)生兩個雜合(細菌/噬菌體)att位點，λdgal缺陷噬菌體就可以整合到該位點上。高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)子的形成雜基因子重組性轉(zhuǎn)導(dǎo)再次整合導(dǎo)致溶源性轉(zhuǎn)導(dǎo)這種缺陷噬菌體亦是轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體，它具有感染能力，能整合到寄主染64正常λ噬菌體幫助λdgal缺陷噬菌體整合和繁殖，因此被稱為助手噬菌體（helperphage）。這種轉(zhuǎn)導(dǎo)子不穩(wěn)定，因為原噬菌體很容易被誘導(dǎo)切離下來。在這種切離的裂解物中，有一半是正常λ噬菌體，另一半為λdgal缺陷噬菌體。如果用這種裂解物去轉(zhuǎn)導(dǎo)另一個Gal-菌株，其轉(zhuǎn)化頻率理論上可達50%，所以也稱之為高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。正常λ噬菌體幫助λdgal缺陷噬菌體整合和繁殖，因此被稱為助65CRISPR結(jié)構(gòu)及作用機理CRISPR

(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat)為規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)，是一類廣泛分布于細菌和古菌基因組中的重復(fù)結(jié)構(gòu)。CRISPR通過與一系列相關(guān)蛋白、前導(dǎo)序列一起，為原核生物提供對抗噬菌體等外源基因的獲得性免疫能力。CRISPR結(jié)構(gòu)及作用機理CRISPR(Clustered66

這種結(jié)構(gòu)最早于1987年在大腸桿菌(Escherichiacoli)

K12的iap基因側(cè)翼序列中被發(fā)現(xiàn)，后來，科學(xué)家利用這個小片段找到了一種操作簡單、可對多種生物的基因組進行遺傳改造的工具——CRISPR—Cas系統(tǒng)。

后續(xù)的遺傳學(xué)試驗和生物化學(xué)試驗也證實，這些CRISPR序列與很多病毒或者質(zhì)粒的DNA序列是互補的，很有可能是生物體抵御病毒等外來人侵者的一套特異性防御機制，就像是另外一套適應(yīng)性免疫反應(yīng)系統(tǒng)。這種結(jié)構(gòu)最早于1987年在大腸桿菌(Escheri67

CRISPR系統(tǒng)基本結(jié)構(gòu)

CRISPR系統(tǒng)由前導(dǎo)序列（leadersequence，LS）、CRISPR基因座以及一系列Cas（CRISPR--associated）蛋白組成。

CRISPR系統(tǒng)基本結(jié)構(gòu)CRISPR系統(tǒng)68Leader序列：Leader序列前導(dǎo)序列由300～500bp堿基組成，位于CRISPR的5’端，與第一個重復(fù)序列直接相連，是一段在物種內(nèi)相對保守的AT富集的區(qū)域。有研究表明前導(dǎo)序列是新插入序列的識別位點，也有研究指出，它能夠作為啟動子，啟動CRISPR基因座的轉(zhuǎn)錄。Leader序列：Leader序列前導(dǎo)序列由300～50069CRISPR基因座：CRISPR基因座由簡短穩(wěn)定的同向重復(fù)序列(directrepect，DR)和長度相近的非重復(fù)的間隔序列(spacer)間隔排列而成，稱為R-S結(jié)構(gòu)。其中重復(fù)序列的片段長度在21～48b，且含有5～7bp的回文序列，通常能形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，間隔序列的長度在26～72bp，可能來源于噬菌體、質(zhì)粒等外源DNA序列。CRISPR基因座：CRISPR基因座由簡短穩(wěn)定的同向重復(fù)序70Cas基因：cas基因是存在于CRISPR位點附近的一系列基因，cas基因簇通常由4～10個保守基因組成，它表達出的cas蛋白對CRISPR防御機制的實現(xiàn)不可或缺。cas基因根據(jù)其保守程度可分為核心cas基因、亞型特異性cas基因和重復(fù)序列相關(guān)未知蛋白(repeat．a(chǎn)ssociated

mysterious

proteins，RAMP)組件基因。

cas1～6基因廣泛存在于各種CRISPR亞型中，故被稱為核心cas基因，其編碼蛋白的功能現(xiàn)已初步得到證實，例如，Casl和Cas2蛋白在所有CRISPR類型中均存在，主要在獲取新的重復(fù)序列過程中發(fā)揮作用，Cas3則具有核酸酶和解旋酶的功能，主要作用是剪切目標基因。Cas基因：cas基因是存在于CRISPR位點附近的一系列基71CRISPR的工作原理

當細菌抵御噬菌體等外源DNA入侵時，在前導(dǎo)區(qū)的調(diào)控下CRISPR

被轉(zhuǎn)錄為長的RNA前體(Pre

RISPRRNA，pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重復(fù)序列和間隔區(qū)的成熟crRNA，最終識別并結(jié)合到與其互補的外源DNA序列上發(fā)揮剪切作用。CRISPR的工作原理當細菌抵御噬菌體等外源DNA72CRISPR被稱為規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)，實際上就是一種基因編輯器，是細菌用以保護自身對抗病毒的一個系統(tǒng)，也是一種對付攻擊者的基因武器。研究人員發(fā)現(xiàn)，它似乎是一種精確的萬能基因武器，可以用來刪除、添加、激活或抑制其他生物體的目標基因，這些目標基因包括人、老鼠、斑馬魚、細菌、果蠅、酵母、線蟲和農(nóng)作物細胞內(nèi)的基因，這也意味著基因編輯器是一種可以廣泛使用的生物技術(shù)。CRISPR被稱為規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)，實73

作為一種新的基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas有以下特點和優(yōu)勢：1、操作簡單，靶向精確性更高。2、CRISPR/Cas9系統(tǒng)是由RNA調(diào)控的對DNA的修飾，其基因修飾可遺傳。3、基因修飾率高，基因調(diào)控方式多樣，例如敲除、插入、抑制、激活等4、可實現(xiàn)對靶基因多個位點同時敲除。5、無物種限制。6、實驗周期短，最快僅需2個月，節(jié)省大量時間和成本。

作為一種新的基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas有以下特點和74思考題：概念：基因重組，感受態(tài)，接合作用，共轉(zhuǎn)導(dǎo)，原噬菌體，缺陷噬菌體，細菌人工染色體，雜基因子細菌基因重組有哪些方式？與真核生物基因重組有何不同？繪圖說明細菌轉(zhuǎn)化的過程和機制并解釋感受態(tài)出現(xiàn)的機理？為什么有些細菌對攝取的DNA有特殊要求？流感嗜血桿菌攝取DNA的方式有何特點？細菌轉(zhuǎn)化效率主要取決哪些因素？有哪些人工轉(zhuǎn)化方法？在細菌接合作用中，如何排徐轉(zhuǎn)化、互養(yǎng)和回復(fù)突變現(xiàn)象？細菌的雄性和雌性細胞在其基因型和表型上有何不同？思考題：概念：基因重組，感受態(tài)，接合作用，共轉(zhuǎn)導(dǎo)，原噬菌體，75高頻重組菌株是如何形成的？為什么有許多不同品系的Hfr菌株？在Hfr×F-雜交中，為什么得不到含F(xiàn)的雜交子？試述中斷雜交、非中斷雜交的原理和在遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用oriC、oriV、oriT、tra、rep、inc、pac分別代表什么？轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象是如何被發(fā)現(xiàn)和證實的？為什么不是所有噬菌體都能進行轉(zhuǎn)導(dǎo)？試述普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)的機制及其在遺性學(xué)研究中的應(yīng)用？繪圖說明λ噬菌體低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)子和高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)子形成的機理？高頻重組菌株是如何形成的？為什么有許多不同品系的Hfr菌株？76演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！77第五章細菌基因重組及遺傳分析基因重組（generecombination）是指不同來源的遺傳物質(zhì)通過轉(zhuǎn)移和交換而重新組合的過程。高等動植物和許多產(chǎn)生有性孢子的真核微生物的基因重組都是通過有性世代來完成。第五章細菌基因重組及遺傳分析基因重組（generecom78在細菌中，提供部分遺傳物質(zhì)或少數(shù)基因的一方稱為供體（donor），而獲得基因的另一方稱為受體（recipient）。在細菌中，提供部分遺傳物質(zhì)或少數(shù)基因的一方稱為供體（dono79第一節(jié)轉(zhuǎn)化（Transformation）轉(zhuǎn)化：是指某一基因型的細胞從周圍介質(zhì)中吸收來自另一基因型細胞的DNA而使受體的基因型和表型發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和轉(zhuǎn)化因子的證實對促進現(xiàn)代分子生物學(xué)的誕生和發(fā)展產(chǎn)生了巨大的推動作用。

在實驗室條件下，通常用CaCl2、cAMP、低溫培養(yǎng)、PEG介導(dǎo)及電脈沖等方法轉(zhuǎn)化細菌或其它微生物。細菌轉(zhuǎn)化的過程大體可分為三個階段：感受態(tài)的出現(xiàn)DNA的吸附和進入DNA的整合第一節(jié)轉(zhuǎn)化（Transformation）轉(zhuǎn)化：是指某一基80感受態(tài)的出現(xiàn)

感受態(tài)（competence）：是指受體菌細胞最容易接受外源DNA并使之不被DNA酶降解的生理狀態(tài)。一、轉(zhuǎn)化過程和機制

細菌細胞在特定時期產(chǎn)生一種稱為感受態(tài)因子的小分子蛋白（5-10kD）。這種感受態(tài)因子可與細胞表面受體蛋白結(jié)合，使細胞產(chǎn)生感受態(tài)特異蛋白，其中包括細胞壁自溶素。自溶素使細胞表面的DNA結(jié)合蛋白及核酸酶裸露出來，使其具有與DNA結(jié)合的活性。因此，當細菌表面出現(xiàn)許多DNA結(jié)合位點時，就意味著細菌出現(xiàn)了感受態(tài)。

感受態(tài)的出現(xiàn)感受態(tài)（competence）：是指受體菌細胞814.進入細胞的單鏈與寄主DNA同源區(qū)重組并整合到染色體上革蘭氏陽性菌1.雙鏈DNA片段在DNA結(jié)合蛋白（黑色點）的幫助下吸附到細胞表面并由核酸酶（紫色橢圓）切成缺口2.由核酸酶降解其中一條單鏈3.未被降解的單鏈與感受態(tài)特異蛋白相互作用并進入細胞DNA的吸附和進入

4.進入細胞的單鏈與寄主DNA同源區(qū)重組并整合到染色體上革82在流感嗜血菌中，其感受態(tài)細胞形成一種結(jié)合雙鏈DNA的膜結(jié)構(gòu)，稱為轉(zhuǎn)化小體（transformasome）。該小體吸附DNA后，與細胞的內(nèi)外膜相融合而轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)側(cè)，再將雙鏈變成單鏈DNA。

轉(zhuǎn)化小體雙鏈DNA被轉(zhuǎn)化小體攝取轉(zhuǎn)化的雙鏈DNA（30-50kb）結(jié)合到膜受體上很快進行同源重組使外源DNA整合到染色體上革蘭氏陰性菌在流感嗜血菌中，其感受態(tài)細胞形成一種結(jié)合雙鏈DNA的膜結(jié)構(gòu)，83DNA在進入感受態(tài)細胞之前，要經(jīng)過可逆性吸附和不可逆性吸附?？赡嫖降腄NA對DNA酶敏感，并可以洗脫下來。隨著感受態(tài)細胞膜蛋白的參與，可逆性吸附逐步向不可逆吸附轉(zhuǎn)化，不可逆吸附DNA對DNA酶不敏感。DNA在進入感受態(tài)細胞之前，要經(jīng)過可逆性吸附和不可逆性吸附。84吸附到細胞表面是雙鏈DNA，而不是單鏈DNA實驗證明：肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化因子在100℃下逐漸失去轉(zhuǎn)化活性(DNA發(fā)生變性)。在逐漸冷卻過程中活性逐漸恢復(fù)(單鏈DNA復(fù)性成雙鏈)。說明完整的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)對于轉(zhuǎn)化活性來說是必要的，轉(zhuǎn)化的第一步，需要雙鏈DNA才能結(jié)合到細胞表面的結(jié)合位點上。當DNA吸附后，被酶解開成單鏈DNA，只有單鏈DNA才能進入細胞內(nèi)并與受體染色體DNA進行整合。

吸附到細胞表面是雙鏈DNA，而不是單鏈DNA實驗證明：肺炎鏈85流感嗜血菌特異性攝取序列：5’AAGTGCGGTCA3’淋病奈瑟球菌特異性攝取序列：5’GCCGTCTCAA3’在流感嗜血菌的染色體上有600個拷貝的攝取序列。攝取序列雖然只有10-12bp，但很少隨機地出現(xiàn)在其他物種的DNA序列中，因此這些細菌對外源DNA的吸收具有選擇性。為什么有些細菌對攝取的DNA有特異性要求呢？近年來的研究表明，G-菌和G＋菌對單鏈DNA也能進行有效轉(zhuǎn)化，但一般是在較低的pH值下進行的。流感嗜血菌特異性攝取序列：5’AAGTGCGGTCA386外源DNA片段在受體細胞中的命運：外源DNA（紅色）轉(zhuǎn)化到受體細胞后，通過同源重組整合到染色體上，否則被降解成核苷酸。

DNA的整合

外源DNA片段在受體細胞中的命運：外源DNA（紅色）轉(zhuǎn)化到受87轉(zhuǎn)化為相同或相近物種之間的同源重組提供了可能性，是自然界中基因交換的一條重要途徑，在生物變異和進化中起著重要作用。轉(zhuǎn)化的效率決定于下列三個內(nèi)在因素：受體細胞的感受態(tài)，決定轉(zhuǎn)化DNA能否進入細胞受體細胞的限制系統(tǒng)，決定轉(zhuǎn)化DNA在整合前是否被分解供體和受體DNA的同源性，決定轉(zhuǎn)化DNA的整合。由于轉(zhuǎn)化DNA總是與順序相同或相似的受體DNA配合，所以親緣關(guān)系越近的其同源性也越強，轉(zhuǎn)化效率也越高。轉(zhuǎn)化為相同或相近物種之間的同源重組提供了可能性，是自然界中基88二、人工轉(zhuǎn)化

通過二價陽離子處理，大腸桿菌等部分G-細菌能產(chǎn)生感受態(tài)通過制備原生質(zhì)，大多數(shù)細菌特別是某些G+細菌

已知許多細菌包括大腸桿菌均無自然轉(zhuǎn)化的能力，但經(jīng)人工誘導(dǎo)可使它們形成感受態(tài)。如：二、人工轉(zhuǎn)化通過二價陽離子處理，大腸桿菌等部分G-細菌能產(chǎn)891970年Mandel和Higa首先發(fā)現(xiàn)DNA在含有高濃度Ca2+的條件下能夠被受體細胞攝入和轉(zhuǎn)化，隨后的實驗證明由Ca2+誘導(dǎo)的人工轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中，其轉(zhuǎn)化DNA必須是一種獨立DNA復(fù)制子。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化隨著研究技術(shù)的改進和經(jīng)驗的積累，人們已經(jīng)建立了用Ca2+、Mg2+等誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的標準程序，能對大腸桿菌菌株C600、JMl01、JMl09、DH5a等進行有效的轉(zhuǎn)化。1970年Mandel和Higa首先發(fā)現(xiàn)DNA在含有高濃度C90先將大腸桿菌培養(yǎng)至OD600=0.5～1接著用50-100mmol／LCaCl2處理制備成感受態(tài)細胞然后將DNA與感受態(tài)細胞混合在冰浴中反應(yīng)20-40min進行42℃熱擊可增加DNA的吸收（107個轉(zhuǎn)化子/ug質(zhì)粒DNA）最經(jīng)典的轉(zhuǎn)化方法是：由于異源的質(zhì)粒DNA分子能夠進入大腸桿菌細胞，所以大腸桿菌攝取DNA是非選擇性的。先將大腸桿菌培養(yǎng)至OD600=0.5～1最經(jīng)典的轉(zhuǎn)化方法是：91PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化不能自然形成感受態(tài)的G+細菌如枯草芽孢桿菌和放線菌，可通過聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG，一般用PEG6000)的作用實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。這類細菌必須首先用細胞壁降解酶完全除去它們的肽聚糖層，然后使其維持在等滲的培養(yǎng)基中，在PEG存在下，質(zhì)?；蚴删wDNA可被高效地導(dǎo)入原生質(zhì)體。PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化不能自然形成感受態(tài)的G+細菌如枯草芽孢桿菌和92電脈沖法（電穿孔法

）在許多細菌和真核系統(tǒng)中，它們既無自然的感受態(tài)呈現(xiàn)也不能用上述的方法建立感受態(tài)。因此人們發(fā)展了一種新的將核酸分子導(dǎo)入細胞的方法，最突出的是電穿孔(electroporation)法和基因槍(biolistic)轉(zhuǎn)化法。電穿孔法：是用高壓脈沖電流擊破細胞膜或?qū)⒓毎舫尚】?，使各種大分子(包括DNA)能通過這些小孔進入細胞，所以又稱電轉(zhuǎn)化。電場強度、電脈沖的長度和DNA濃度電脈沖法（電穿孔法）在許多細菌和真核系統(tǒng)中，它們既無自然的93基因槍(biolistic)轉(zhuǎn)化

基因槍轉(zhuǎn)化法首先由Sanford報道，該方法是將包裹有DNA的鎢顆粒像子彈一樣用高壓射進細胞并使DNA留在細胞內(nèi)，特別是留在細胞器中。用這種方法首次成功地將DNA導(dǎo)入酵母線粒體并引起線粒體遺傳變化。基因槍轉(zhuǎn)化現(xiàn)在被廣泛地應(yīng)用于植物的轉(zhuǎn)化中基因槍(biolistic)轉(zhuǎn)化基因槍轉(zhuǎn)化法首先由Sanf94三、建立轉(zhuǎn)化方法的策略被轉(zhuǎn)化對象（轉(zhuǎn)化受體）轉(zhuǎn)化DNA的構(gòu)建（目的）轉(zhuǎn)化方法選擇三、建立轉(zhuǎn)化方法的策略被轉(zhuǎn)化對象（轉(zhuǎn)化受體）95四、轉(zhuǎn)化應(yīng)用在轉(zhuǎn)化中，如果轉(zhuǎn)化因子的兩個基因是連鎖的，那么它們可以同時被轉(zhuǎn)化，也稱為共轉(zhuǎn)化，連鎖的兩個基因距離越近，其共轉(zhuǎn)化頻率越高，反之則低。利用共轉(zhuǎn)化率和連鎖的二基因間的距離的反比關(guān)系可進行基因定位的工作。1.連鎖檢測四、轉(zhuǎn)化應(yīng)用在轉(zhuǎn)化中，如果轉(zhuǎn)化因子的兩個基因是連鎖的，那么962.遺傳圖譜的繪制trp2+his2+tyr1+（供體）×trp2-his2-tyr1-

（受體）的轉(zhuǎn)化類型trp2-his2重組率=2600+107+3660+418×100%=34%11940+1180+2600+107+3660+418

trp2-tyr1重組率=2600+1180+3660+685×100%=40%11940+107+2600+1180+3660+685his2-tyr1重組率=418+1180+685+107×100%=13%11940+3660+418+1180+685+107trp2his2tyr1

3413402.遺傳圖譜的繪制trp2+his2+tyr1+（供體）×973.基因中斷3.基因中斷984.插入基因4.插入基因99第二節(jié)接合作用（conjugation）接合作用：是指在供體細胞和受體細胞直接接觸后，質(zhì)粒從供體細胞向受體細胞轉(zhuǎn)移的過程，也稱細菌雜交

。

一、接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)與證實

Lederberg和Tatum（1946年）建立了用大腸桿菌K12的兩個營養(yǎng)缺陷型菌株在基本培養(yǎng)基上是否生長，來檢驗細菌雜交或重組存在的方法。在此以前，沒有人證實細菌雜交現(xiàn)象。細菌雜交有別于典型的有性雜交，故稱為細菌接合作用。第二節(jié)接合作用（conjugation）接合作用：是指在100A菌株B菌株A菌株B菌株101混合培養(yǎng)后在基本培養(yǎng)基中出現(xiàn)的原養(yǎng)型菌落是否是雜交的結(jié)果？必須要排除下列幾種解釋：一是細菌細胞并沒有接合，而是交換了DNA(轉(zhuǎn)化作用)二是細胞并未接合，而是通過培養(yǎng)基交換了養(yǎng)料(互養(yǎng))三是細菌細胞并未接合而是親本發(fā)生了回復(fù)突變混合培養(yǎng)后在基本培養(yǎng)基中出現(xiàn)的原養(yǎng)型菌落是否是雜交的結(jié)果？102當時Lederberg和Tatum已經(jīng)證明，當把A菌株的培養(yǎng)液經(jīng)過滅菌，再加入到B菌株的培養(yǎng)液中，沒有原養(yǎng)型菌落，這說明上述實驗并非轉(zhuǎn)化的結(jié)果。1950年，Davis通過他的U形管試驗進一步支持了Lederberg和Tatum的結(jié)論。1.轉(zhuǎn)化作用的排除當時Lederberg和Tatum已經(jīng)證明，當把A菌株的培養(yǎng)103營養(yǎng)缺陷型細胞通過培養(yǎng)基交換養(yǎng)料而生長的現(xiàn)象亦稱為互養(yǎng)。2.互養(yǎng)的排除在A-B+T1s和A+B-T1r的雜交中，將基因型A-B+T1s和A+B-T1r兩種細菌在基本培養(yǎng)基上混合培養(yǎng)，接觸較短的一段時間以后，噴上噬菌體T1，把A-B+T1s細菌殺死。經(jīng)培養(yǎng)以后仍有原養(yǎng)型菌落出現(xiàn)，這說明原養(yǎng)型菌落的出現(xiàn)并非由于互養(yǎng)。

營養(yǎng)缺陷型細胞通過培養(yǎng)基交換養(yǎng)料而生長的現(xiàn)象亦稱為互養(yǎng)。2.104因為大腸桿菌的突變率一般都<10-8，若兩個基因同時回復(fù)突變，則其可能性只有<10-16（10-8×10-8），這種幾率在平板上是很難檢測到的，所以混合培養(yǎng)能出現(xiàn)10-5~10-6頻率的菌落一定是重組的結(jié)果。3.回復(fù)突變的排除因為大腸桿菌的突變率一般都<10-8，若兩個基因同時回復(fù)突變1054.遺傳物質(zhì)的單向轉(zhuǎn)移正交實驗（A）Strs×（B）Strr用鏈霉素將A菌株殺死重組體的數(shù)目變化不大(A)Strr×(B)Strs將B菌株殺死一個重組體也沒有出現(xiàn)反交實驗（A）met-bio-（Strr或Strs

）×（B）thr-leu-thi-（Strs或Strr）Hayse（1952）用正反雜交實驗證明，細菌重組的發(fā)生只是染色體單方向的轉(zhuǎn)移，而且染色體的轉(zhuǎn)移往往不完全。

4.遺傳物質(zhì)的單向轉(zhuǎn)移正交實驗（A）Strs×（B）St106把A菌株認為是供體，而B菌株是受體A菌株作為遺傳物質(zhì)的供體，當鏈霉素對它進行滅活以后，并未影響它傳遞遺傳物質(zhì)的能力。B菌株作為遺傳物質(zhì)的受體，一旦被鏈霉素殺死以后，必然不能出現(xiàn)重組體。供體菌株又稱為雄性細胞，受體菌株又稱為雌性細胞把A菌株認為是供體，而B菌株是受體供體菌株又稱為雄性細胞，受107StrrA突變型（不育變種）⊙置冰箱1年后供體的A菌株Strr×B菌株Strs可育的StrsA菌株共培養(yǎng)，一起繁殖不能得到雜交子StrrA菌株×B菌株Strs恢復(fù)了StrrA突變型的可育性F質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)(Hayes)StrrA突變型（不育變種）⊙置冰箱1年后供體的A菌株Str108①大腸桿菌的供體或雄性細胞(如A菌株)記為F+，帶有一個性因子或致育因子F(fertilityfactor)，而另一個不帶性因子F的受體或雌性細胞(如B菌株)叫做F-；②雜交F+×F-是可育的，雜交F-×F-是不育的；③F因子可以傳遞，從F+到F-細菌，但必須通過細胞接觸④F因子能夠自發(fā)喪失，一旦喪失就不能再恢復(fù)，除非從另一個F+細胞再把它傳遞過來。分析結(jié)果：①大腸桿菌的供體或雄性細胞(如A菌株)記為F+，帶有一個性109F因子是染色體外的一種遺傳結(jié)構(gòu)，也就是質(zhì)粒(plasmid)。F+是一種遺傳性狀F因子的存在使細菌成為F+F因子的喪失使細菌成為F-F+細菌分裂仍得到F+細胞F因子是染色體外的一種遺傳結(jié)構(gòu)，也就是質(zhì)粒(plasmid)110二、F質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)及其在細胞中的存在狀態(tài)F質(zhì)粒的遺傳結(jié)構(gòu)

F質(zhì)粒的基因組由三個主要區(qū)段組成：轉(zhuǎn)移區(qū)、復(fù)制區(qū)、插入?yún)^(qū)。二、F質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)及其在細胞中的存在狀態(tài)F質(zhì)粒的遺傳結(jié)構(gòu)F111長度為33kb，由23個基因組成，構(gòu)成一個tra操縱子(traoperon)。traABCEFGHKLQUVW與性菌毛的形成有關(guān)traYZMIGD等與F因子的轉(zhuǎn)移有關(guān)

traG、traN影響雜交對的配對形成與否

traI、traM決定DNA轉(zhuǎn)移起始

traI編碼解旋酶I(helicaseⅠ)traD控制DNA轉(zhuǎn)移；

traY、traZ編碼的核酸內(nèi)切酶能在轉(zhuǎn)移起始區(qū)

oriT上切開一個缺口。（1）轉(zhuǎn)移區(qū)(transferregion)長度為33kb，由23個基因組成，構(gòu)成一個tra操縱子(t112復(fù)制區(qū)負責F質(zhì)粒的自我復(fù)制F質(zhì)粒自主復(fù)制區(qū)為oriV（Vegetativeoriginofreplication），在oriV中包含有復(fù)制起點。F質(zhì)粒的復(fù)制是按θ型方式進行復(fù)制，它是一種嚴緊型質(zhì)粒。F質(zhì)粒的拷貝數(shù)能被精確地控制，一個寄主細胞約有1~2個F質(zhì)粒。rep（Freplicativeprotein）編碼一組與F質(zhì)粒復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)。inc（incompatibility）基因產(chǎn)物使細胞具有不相容性。（2）復(fù)制區(qū)（replicationregion）復(fù)制區(qū)負責F質(zhì)粒的自我復(fù)制（2）復(fù)制區(qū)（replicatio113F質(zhì)粒插入?yún)^(qū)包含4個插入順序：2個IS31個IS21個Tn1000（γδ）它們與F質(zhì)粒的整合、切除、易位有關(guān)（3）插入?yún)^(qū)（insertionregion）F質(zhì)粒插入?yún)^(qū)包含4個插入順序：（3）插入?yún)^(qū)（insertio1142.F質(zhì)粒在細胞內(nèi)的存在形式

根據(jù)大腸桿菌細胞內(nèi)有無F質(zhì)粒及F質(zhì)粒在細胞內(nèi)的存在狀態(tài)可將細胞分為4種類型：F-、F+、Hfr、F’。F-：是細胞內(nèi)不含F(xiàn)質(zhì)粒；F+：是細胞內(nèi)含有F質(zhì)粒且獨立染色體外；Hfr菌株(highfrequencyrecombinationstrain)：高頻重組菌株：是F質(zhì)粒整合到宿主的染色體上，隨著宿主染色體的復(fù)制而復(fù)制；F’是指攜帶了宿主的一部分染色體的F質(zhì)粒。

2.F質(zhì)粒在細胞內(nèi)的存在形式根據(jù)大腸桿菌細胞內(nèi)有無F質(zhì)粒115三、F質(zhì)粒與接合作用1.F+×F-雜交有F質(zhì)粒的細胞在形態(tài)學(xué)上可以與F-明顯區(qū)別。除了共有的大量表面菌毛以外，F(xiàn)+還有少量（通常在細胞對數(shù)生長期中只有1~3根）性菌毛。纖細的蛋白質(zhì)性菌毛有的長數(shù)毫米，直徑約為8nm。性菌毛在細菌的接合過程中起著十分重要的作用。三、F質(zhì)粒與接合作用1.F+×F-雜交116基因重組及遺傳分析課件1172.Hfr×F-雜交

Hfr菌株是怎樣形成的呢?

F質(zhì)粒有兩種方式整合到染色體上：同源重組、質(zhì)粒和染色體共有插入序列和轉(zhuǎn)座子。大腸桿菌染色體基因組有7個IS1、13個IS2及6個IS3；F質(zhì)粒有1個IS2和2個IS3。

2.Hfr×F-雜交Hfr菌株是怎樣形成的呢?118基因重組及遺傳分析課件119基因重組及遺傳分析課件1203.F’×F-雜交

F質(zhì)粒在脫離Hfr細胞的染色體時也會發(fā)生差錯，從而形成帶有細菌染色體基因的F′質(zhì)粒。而F′因子又可通過交換融合到細菌染色體的原來位置上，回復(fù)到原來的Hfr狀態(tài)。由于在F’×F-接合使用中能專一性地向F-轉(zhuǎn)移F′質(zhì)粒攜帶的供體基因，因而通過F′因子的轉(zhuǎn)移而使受體菌改變其遺傳性狀，這種現(xiàn)象也被稱為F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)。3.F’×F-雜交F質(zhì)粒在脫離Hfr細胞的染色體時也會121四、中斷雜交試驗和基因定位中斷雜交：就是將兩個菌株（例如Hfra+strs×F-astrr）在培養(yǎng)液中進行通風(fēng)培養(yǎng)，每隔一定時間取樣，把菌液放入組織搗碎器里攪拌以中斷雜交，經(jīng)過稀釋接種到鑒別培養(yǎng)基上，待形成菌落后鑒定它們的基因型。

1957年Wollman和Jacob首次進行中斷雜交實驗：供體菌：HfrHstrsthr+leu+azistonslac+gal+受體菌：F-

strrthr?leu-azirtonrlac-gal-0azitonlacgalF四、中斷雜交試驗和基因定位中斷雜交：就是將兩個菌株（例如H1220thrlactrphisthyargstrF2827456169730thrlact123基因重組及遺傳分析課件124Peptide-inducedtransferofEnterococcusfaecalisplasmidpCF10.(A)PeptidepheromonecCF10(triangles)isexpressedfromthechromosomeofbothplasmid-containingdonorcellsandplasmid-freerecipientcells.Inhibitorpeptide(stars)isexpressedfrompCF10andsecretedintothemediumtopreventpheromonefromthedonorcellfrominducingitself,probablythroughcompetitivebindingtothepheromonebindingproteinPrgZ.(B)PheromonefromanearbyrecipientcellisdetectedbyPrgZ.PrgZimportsthepeptidepheromoneusingthechromosomallyencodedOpp(Oligopeptidepermease)system.(C)ImportedcCF10inducesexpressionoftransfergenes,includingthecell–surfaceadhesinPrgB.(D)PrgBmediatesaggregationofthedonorandrecipientcells.Amatingchannelisthenformedandsingle-strandedpCF10istransferredtothedonorcellviaarollingcirclemechanism.AfterpCF10hasestablisheditselfintherecipientcell,theinhibitorpeptideandanothermechanismofnegativecontrol,PrgY,isexpressedtopreventself-inductionbyendogenouscCF10.Peptide-inducedtransferofEn125第三節(jié)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)轉(zhuǎn)導(dǎo)：是利用噬菌體為媒介，將供體菌的部分DNA轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)的現(xiàn)象。因為絕大多數(shù)細菌都有噬菌體，所以轉(zhuǎn)導(dǎo)作用較普遍。另外，轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA位于噬菌體蛋白外殼內(nèi)，不易被外界的DNA水解酶所破壞，所以比較穩(wěn)定。局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)：被轉(zhuǎn)導(dǎo)的DNA片段僅僅是那些靠近染色體上溶源化位點的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)：任何供體的染色體都可以轉(zhuǎn)移至受體細胞第三節(jié)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)轉(zhuǎn)導(dǎo)：是利用噬菌1261952年Lederberg和他的學(xué)生Zinder把鼠傷寒沙門菌的一個突變菌株LT22(trp-)和另一個突變菌株LT2(his-)在基本培養(yǎng)基上進行混合培養(yǎng)，結(jié)果在107細胞中得到大約100個原養(yǎng)型菌落。

一、轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)

1952年Lederberg和他的學(xué)生Zinder把鼠傷寒沙127LT2菌株LT22菌株中間用濾板隔開U形管實驗LT2菌株LT22菌株中間用濾板隔開U形管實驗128①可過濾因子并不由于DNA酶的處理而失活；②可過濾因子和從溶源性的LT22菌株得來的噬菌體(稱為

P22)具有相同的大小和質(zhì)量；③可過濾因子加熱后失活，用抗P22血清處理后也失活；④把P22與LT2和LT22菌株分別混合培養(yǎng)，在基本培養(yǎng)基上不出現(xiàn)原養(yǎng)型菌落。結(jié)果證實了可過濾因子是溫和噬菌體P22。這就是最早發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。

通過一系列的實驗，證實可過濾因子具有下列一些特性：①可過濾因子并不由于DNA酶的處理而失活；通過一系列的實驗129轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中有三個組成部分，即供體、噬菌體和受體。這種導(dǎo)致基因重組的方式不同于轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化需要供體DNA和受體細胞接觸，而轉(zhuǎn)導(dǎo)則是以噬菌體為媒介將供體遺傳物質(zhì)傳給受體，無需DNA和受體細胞接觸。轉(zhuǎn)導(dǎo)可分為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)，普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)又可分為完全轉(zhuǎn)導(dǎo)和流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)。二、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中有三個組成部分，即供體、噬菌體和受體。這種導(dǎo)致基因1301.完全轉(zhuǎn)導(dǎo)1.完全轉(zhuǎn)導(dǎo)131P1供體收集子代噬菌體菌苔計數(shù)噬菌體（完全培養(yǎng)基）受體（缺陷型大腸桿菌）選出重組子（轉(zhuǎn)導(dǎo)子）（基本培養(yǎng)基）侵染裂解侵染野生型轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率=

轉(zhuǎn)導(dǎo)子數(shù)×100%=

轉(zhuǎn)導(dǎo)子數(shù)×100%

侵染受體的P1顆粒數(shù)噬菌斑數(shù)+轉(zhuǎn)導(dǎo)子數(shù)P1供體收集子代噬菌體菌苔計數(shù)1322.流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)2.流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)1333.普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用(1)共轉(zhuǎn)導(dǎo)：普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要應(yīng)用之一是通過測定共轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率進行基因定位，所謂共轉(zhuǎn)