第十二章遺傳工程幻燈片講義課件

第12章遺傳工程

第12章遺傳工程1本章教學時數(shù)：2學時。本章重點：基因工程的基本流程。本章難點：分子標記和基因圖譜；研究基因功能的方法本章教學時數(shù)：2學時。2§1

遺傳工程概述

遺傳工程：細胞工程酶工程發(fā)酵工程基因工程§1遺傳工程概述遺傳工程：3遺傳工程的概念遺傳工程（geneticengineering），也稱生物工程（biologicalengineering）。是指利用工程技術的方法改造和修飾生物體，使其產(chǎn)生新的性狀或更適合人類需求的產(chǎn)品的遺傳學手段。遺傳工程的概念遺傳工程（geneticengineer4廣義遺傳工程和狹義遺傳工程：廣義：包括細胞工程、基因工程、酶工程和發(fā)酵工程等。狹義：基因工程。廣義遺傳工程和狹義遺傳工程：廣義：包括細胞工程、基因工程、酶5細胞工程在離體（invitro）條件下以細胞為基本單位，借助人工培養(yǎng)基，對生物細胞進行培養(yǎng)、繁殖，或者使其發(fā)生變異，從而改良生物品種、創(chuàng)造新品種、加速繁育，或利用細胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質的過程。細胞工程包括細胞培養(yǎng)、細胞融合、細胞器轉移、生物體的克隆與規(guī)?；敝车?。細胞工程在離體（invitro）條件下以細胞為基本單位，6第一個哺乳動物的克隆——Dolly羊第一個哺乳動物的克隆——Dolly羊7酶工程利用酶的催化作用，在一定的生物反應器中，將相應的原料轉化成所需要的產(chǎn)品。是酶學理論與化工技術相結合的新技術體系。酶工程利用酶的催化作用，在一定的生物反應器中，將相應的原料轉8發(fā)酵工程利用微生物與現(xiàn)代化工程技術相結合，工廠化生產(chǎn)人類需要的物質的一種技術體系。目前醫(yī)用抗生素、農(nóng)用抗生素絕大部分都是發(fā)酵工程產(chǎn)品。發(fā)酵工程利用微生物與現(xiàn)代化工程技術相結合，工廠化生產(chǎn)人類需9基因工程利用人工方法在體外（invitro）切割、拼接、重組生物的遺傳物質，獲得重組DNA分子，然后導入宿主細胞或個體，使受體的遺傳特性得到修飾或改良?；蚬こ滩僮鞯膶ο笫荄NA分子。又稱為重組DNA技術基因工程利用人工方法在體外（invitro）切割、拼接、重10重組DNA技術流程重組DNA技術流程11§２基因工程的工具酶內切核酸酶(endonuclease)DNA連接酶(ligase)DNA聚合酶（DNApolymerase）RNA聚合酶（RNApolymerase）反轉錄酶（reversetranscriptase）最重要的工具酶是限制性核酸內切酶（restrictionendonuclease）§２基因工程的工具酶內切核酸酶(endonuclease)12限制性內切核酸酶或稱限制性酶(restrictionenzyme),是基因工程最重要的工具。在細菌中這些酶的功能是降解外來DNA分子，以限制(restriction)或阻止病毒侵染。這類酶能識別雙鏈DNA分子中特異的核苷酸序列，并在特定的位置將雙連DNA分子切斷。限制性內切核酸酶或稱限制性酶(restrictionenz13EcoRⅠEcoRⅠ14限制性內切核酸酶的命名原則：根據(jù)分離出這種酶的細菌在分類學上的屬名、種名和菌株名來命名。名稱的第一個字母是該細菌的屬名的第一個字母，大寫，斜體。名稱的第二、三個字母是該細菌種名的前兩個字母，小寫，斜體。名稱的第四個字母是菌株的名稱，大寫或小寫，正體。如果沒有菌株名稱就不寫。名稱最后的是羅馬數(shù)字，表示從這種細菌中分離出來的酶的序號，如從某個菌株中分離出來的第一種酶為Ⅰ，第二種酶為Ⅱ，等等。限制性內切核酸酶的命名原則：根據(jù)分離出這種酶的細菌在分類學上15如EcoRⅠ來自大腸桿菌（Escherichiacoli）R菌株，讀作echo-r-one；HindⅢ來自流感噬血桿菌（Hemophilusinfluenzae）d菌株,讀作hind-three如EcoRⅠ來自大腸桿菌（Escherichiacoli）16限制酶的分類限制性核酸內切酶的工作分為2個步驟：識別特定的DNA序列在特定的位置切割DNA分子根據(jù)其作用特點,可以將限制性酶分為三種類型：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型。在基因工程中用途最廣泛的是Ⅱ型限制酶。限制酶的分類限制性核酸內切酶的工作分為2個步驟：17Ⅰ型限制酶有特定的識別序列但切割位置遠離識別位置有的種類可以在同識別序列相距1000bp的位置上隨機切割DNA分子在基因工程中沒有什么用途Ⅰ型限制酶有特定的識別序列18Ⅲ型限制酶有特定的識別序列切割位置在識別序列3’端相距20bp處，可以產(chǎn)生各種類型的單鏈末端。Ⅲ型限制酶在基因工程中有特定的用途，但總體來說，用途不大。Ⅲ型限制酶有特定的識別序列19Ⅱ型限制酶在DNA上有特定的識別序列而且其切割位點就在識別序列內部基因工程中用途最廣識別序列是對稱的，在一條鏈中從5’到3’方向的序列與其互補鏈從5’到3’方向的序列完全相同，稱為回紋對稱序列(palindrome)。Ⅱ型限制酶在DNA上有特定的識別序列20酶切與連接酶切與連接21常見內切酶常見內切酶22DNA連接酶(DNAligase)共價連接5′－磷酸和3′－OH，形成磷酸二酯鍵(3′－

5′phosphodiesterbond)

，封閉DNA雙鏈上的缺刻(nick)。DNA連接酶(DNAligase)共價連接5′－磷酸和3′23反轉錄酶

reversetranscriptase反轉錄酶

reversetranscriptase24

§3載體(vector)將外源DNA片段運送進宿主細胞(hostcell)進行擴增或表達的運載工具稱為載體。載體也是DNA分子。§3載體(vector)將外源DNA片段運送進宿主細胞25常用載體：細菌質粒、噬菌體、病毒等。

都要經(jīng)過人工改造。細菌人工染色體（BAC）酵母菌人工染色體（YAC）人類人工染色體（HAC）常用載體：細菌質粒、噬菌體、病毒等。26載體的基本條件①有獨立的復制原點(ori)，能獨立地自我復制，而且能帶動外源DNA一起復制。②具有多種限制性酶的切點，用于連接外源DNA片段。③載體上的限制酶酶切位點對于任何一種限制酶來說只能有一個。④具有一個選擇標記基因。載體的基本條件①有獨立的復制原點(ori)，能獨立地自我復制27質粒載體

①分子量小(2.69kb),但能攜帶較大的外源片段；②拷貝數(shù)多,在每個宿主細胞可達500個；③酶切位點多，克隆方便；④具有α-互補顯色表型,便于檢測。

質粒載體

①分子量小(2.69kb),但能攜帶較大的外源片段28互補顯色反應

互補顯色反應29λ噬菌體（30kb）

λ噬菌體（30kb）30粘粒（cosmid）載體（45kb）粘粒（cosmid）載體（45kb）31細菌人工染色體BAC（300kb）

bacterialartificialchromosome來源于F因子細菌人工染色體BAC（300kb）

bacterialar32YAC（1Mb）

yeastartificialchromosomeYAC（1Mb）

yeastartificialchro33Ti質粒Ti質粒是根癌農(nóng)桿菌的染色體外遺傳物質雙鏈閉合環(huán)狀DNA，150～200kb植物基因工程常用的載體Ti質粒Ti質粒是根癌農(nóng)桿菌的染色體外遺傳物質34Ti質粒結構T-DNATransferDNA是農(nóng)桿菌侵入植物細胞時從Ti質粒上轉移到植物細胞的一段DNAT-DNA兩端個有一段25bp的同向重復序列，是T-DNA的邊緣區(qū)LB；RB在同一條單鏈的LB和RB內各形成一個缺口，單鏈T-DNA進入植物細胞Ti質粒結構T-DNA35§4

基因的分離與鑒定

從基因庫中分離基因聚合酶鏈式反應(PCR)擴增基因人工合成基因T－DNA標簽法

§4基因的分離與鑒定從基因庫中分離基因36(一)從基因庫中分離基因

1．構建基因庫

2．篩選基因庫

3．陽性克隆的分析與鑒定

(一)從基因庫中分離基因1．構建基因庫371．構建基因庫

基因庫(library)是一組DNA或cDNA序列克隆的集合體。創(chuàng)建基因文庫的目的是從特定的材料中分離目的DNA片段或基因。把所有的基因集中在一個庫中，采用一定的方法在庫中篩選目的基因。同時也便于基因的長期保存。1．構建基因庫基因庫(library)是一組DNA或cD38基因組文庫GenomicDNAlibrary使用與切割載體相同的限制酶，將供體生物的基因組DNA切割成許多片段將所有片段連接到載體上，構成一個重組DNA群體這個群體包含全基因組的遺傳信息基因組文庫GenomicDNAlibrary使用與切割39cDNA文庫cDNAlibrary以mRNA為模板，經(jīng)反轉錄酶合成互補DNA(complementaryDNA，cDNA)將雙鏈cDNA與適當載體連接轉化到宿主細胞內進行擴增，建成cDNA文庫cDNA文庫cDNAlibrary40基因組文庫與cDNA文庫的比較：基因組文庫包含基因組的所有基因cDNA文庫只包括某一特定細胞類型、某一組織、或某一發(fā)育時期的表達序列分離特定基因，cDNA庫比較方便研究調控序列，必須基因組文庫基因組文庫與cDNA文庫的比較：基因組文庫包含基因組的所有41從基因庫中篩選特定的克隆

一個基因文庫中有幾萬個克隆，目的基因到底在哪個克隆上呢？根據(jù)待選基因相關信息確定篩選方法和條件。最常用的方法是利用一段核苷酸序列作探針，用放射性同位素或非放射性同位素標記探針，篩選基因庫從基因庫中篩選特定的克隆一個基因文庫中有幾萬個克隆，目的基42DNA探針（probe）探針是一段能夠與待選目的基因互補的核酸序列DNA、cDNA、寡聚核苷酸單鏈、雙鏈同位素標記、熒光標記、顏色標記DNA探針（probe）探針是一段能夠與待選目的基因互補的43篩選文庫質?；驇旌Y選細菌混合液在培養(yǎng)在平板上轉移到尼龍膜上裂解細菌變性DNA標記探針雜交漂洗放射自顯影或熒光檢測挑取對應菌落、培養(yǎng)抽提質粒篩選文庫質?；驇旌Y選44陽性克隆的分析與鑒定

從基因庫中篩選出的陽性克隆，還需進一步分析、鑒定，才能最后得到目的基因測序自動測序儀功能分析預測軟件陽性克隆的分析與鑒定從基因庫中篩選出的陽性克隆，還需進一45核酸序列測定的原理核酸序列測定的原理46磷酸二脂鍵磷酸二脂鍵47測序電泳圖譜測序電泳圖譜48核酸序列分析與功能預測同源性比較

同源基因是指那些起源相同、序列相似的基因?？蓮暮怂峒暗鞍踪|兩種水平比較基因間的同源性。將測出的核酸序列同雜交的探針序列進行比較將得到的序列發(fā)到BLAST等DNAData庫的網(wǎng)址上比較核酸序列分析與功能預測同源性比較49開放閱讀框（openreadingframe,ORF）分析開放閱讀框：一段能編碼一條多肽鏈，并具有翻譯起始信號（ATG）和終止信號(TAA、TAG或TGA)的核苷酸序列。來自cDNA庫的序列可直接進行0RF分析，比較其與其他序列的同源性來確定其身份。來自核基因庫的序列，因大多數(shù)真核生物基因含有內含子。開放閱讀框（openreadingframe,ORF）50開放閱讀框（openreadingframe,ORF）分析開放閱讀框（openreadingframe,ORF）51

TGCTCGCTCCTACGAATCCTGCCCCTGAGTAACAATGACTGACTTTTAATTTGTTTGCAG61CTAGGGTGGGGATCGAGATGGTGATCTTGGAGCAGCCACAGCTGCTCCTTCTTCTTCTTC121TTCTTGTAGCAGCTGCAGCTGCAACCGGCGCCACAGCAGCCGACGACGAGTTGGAGTGTC181CCTCCTCCATCTTCGGTAAGTAGCAAAGCACAGTATGACATTCACGAATGCATGTCATGA241TCTATCACTCCCTTTGTCTTCGCTACATTACATACTCTGCCTGTGTTTACCTACTGTACC301CGTCTTCAATTCAATTTGCTGTTGGCTCCCGCGCTTTCCCGAAGCCGCGTGTAGTAGTAT361CATAAAAGTAGGAGTAGATCTTTAATTTGCCCGGCGAAAACTGCTCCTAGTGGTAGATCT421TTGGCTCGGATCGGAGAAGATATTGTAGCTGTACTCTGATCGAGAGCATGCATGCTTGTT481AATCCGATCGAGCGTATTCCTCTGAGTTTGTTATGCTCTGATATTGTAATTGTGGCTGGA541TAATTTTCAAGAAAAAAAAATCGGTTACATACATGCATTTGCACTAATTAACTAGATTGT601GCATCAACAGATCACGCTGTGAACTCTCAAGGCGCCATTCAGTTCCCCGTGTTCCACAAG661AAGCACCAATGCCTCCGCCCATGGTCTGTCCGTGCAACCCAGGCATCCTCGACCGGAGCA721TCAGGAGCAGGAAAAGGAGGAGGATTGAACAATCTACAGGAAGAGGAGATCACTTCATCA781AGTAGTACAAAAATCGACGTGATCGAAGACAGCAGCATCAACGACTTCCTGTTCCTAATG841GCCGTCAGTCTGGGCAAGCCACCGGTTGTGAACCTGGTGGCGATCGACACGGGATCCACC901CTCTCGTGGGTGCAATGCCAGCCGTGCGCGGTGCACTGCCACACGCAGTCCGCGAAGGCC961GGCCCGATATTCGATCCCGGCAGATCCTACACATCCCGGCGAGTTCGCTGCTCGTCGGTC1021AAGTGCGGCGAGCTGAGGTACGATCTGCGGCTCCAGCAAGCCAATTGCATGGAGAAGGAA1081GACAGCTGCACGTACAGCGTCACGTACGGGAACGGGTGGGCGTACAGCGTGGGCAAGATG1141GTGACAGACACGCTGAGGATTGGGGACTCGTTTATGGATCTCATGTTCGGGTGCAGCATG1201GATGTCAAGTACAGCGAATTCGAGGCCGGCATCTTTGGTTTCGGCAGCAGCAGCTTCTCT1261TTCTTCGAGCAGCTGGCAGGGTACCCTGATATTCTGAGTTACAAGGCATTAAGCTACTGC1321TTGCCCACTGACGAGACCAAGCCCGGATACATGATCCTGGGAAGATACGACCGTGCCGCC1381ATGGATGGGGGTTACACTCCTCTCTTCCGGTCAATCAACAGGCCAACCTACTCACTGACG1441ATGGAGATGCTTATCGCCAACGGGCAGAGATTGGTGACATCGTCTTCGGAGATGATCGTC1501GATTCCGGGGCCCAGAGGACGTCCCTGTGGCCTTCCACTTTTGCTCTCCTTGACAAGACC1561ATCACGCAGGCAATGTCGTCGATTGGGTATCACCGGACATCAAGAGCGCGCCAAGAATCA1621TACATCTGCTACTTATCGGAGCACGACTATTCTGGTTGGAACGGCACCATCACGCCCTTC1681TCCAACTGGTCCGCCTTGCCTCTGCTGGAGATCGGCTTCGCCGGCGGTGCTGCACTCGCT1741TTGCCACCCAGAAACGTCTTCTACAACGATCCACACCGCGGTTTGTGCATGACCTTTGCT1801CAGAATCCTGCTCTCAGGTCTCAGATACTGGGGAACAGGGTTACTCGATCCTTCGGAACA1861ACCTTCGACATCCAGGGGAAACAATTCGGCTTCAAATATGCCGTTTGCTGATCGTCGATT1921ATTCCTCATCCTATGATATCTTATAGCTTGCGGGTACGTACCAAGTATATATCAAACTAA1981TTGCATACATGCTCTCCCTCCCTCTGTCCATGCATGTCCTCGTTTCATTGCAAATCTGCA2041TCGATCAATCCAGTTACTGATAATTCCTCCTTATTAACTTAGGCTGATCGATCCATTGCT2101TCTCGTGTGTATATTATGCAGGTCGATTAATTAGCTGGTTTGCCCAAATAACTGATCGGA2161TTGGAGTCTTCTCCCGCGCTACACTACCCCTAGCTGCGATCGTATCACAAGCTAGCGGTA2221CTTGATTTGGGACCTAATTCGTTCAAAAAAAACTTGGCAGCTTAATTTGGGACCTAGTAG2281CTAGCTGAGCCACTACTAGATGTTTACGTACCAGCTATCCGTCGTTTGTTTGTGTCTCCT2341GTGCTTGTGCT2351bpTGCTCGCTCCTACGAATCCTGC52(二)聚合酶鏈式反應(PCR)擴增基因

利用PCR方法可以在數(shù)小時內使目的DNA片段擴增到數(shù)百萬個拷貝。基本原理：根據(jù)待擴增基因的部分序列合成成對引物，在體外合成兩個引物之間的DNA序列。(二)聚合酶鏈式反應(PCR)擴增基因利用PCR方法可以53聚合酶鏈式反應

(PCR，polymerasechainreaction)聚合酶鏈式反應

(PCR，polymerasechain54PCR反應根據(jù)待擴增基因序列合成兩個引物，10-20bp,分別與待擴增基因二條鏈的兩端互補。在DNA模板變性成單鏈后，兩個引物分別與單鏈DNA復性，在耐熱的Taqpolymerse及4種脫氧核苷酸存在下，由引物引導合成DNA新鏈。3個步驟：變性94-95℃,雙鏈變性成單鏈復性50-70℃,兩個引物分別與單鏈DNA互補延伸72℃,在引物Taq酶的作用下從5'→3'的方向合成模板DNA的互補鏈。PCR反應根據(jù)待擴增基因序列合成兩個引物，10-20bp,分55PCR反應常有25－35個循環(huán)經(jīng)過25個循環(huán)以后，理論上原來一個分子DNA可以擴增為106個拷貝。僅用少量的模板DNA分子，可以得到大量擴增產(chǎn)物。通?？梢詳U增5kb左右的DNA片段。性能更好的Taq酶可以擴增長達40kb的DNA片段。PCR擴增的DNA序列經(jīng)過核酸序列測定分析后，可作為基因工程的目的基因。PCR反應常有25－35個循環(huán)56PCR循環(huán)數(shù)與產(chǎn)物拷貝數(shù)之間的關系PCR循環(huán)數(shù)與產(chǎn)物拷貝數(shù)之間的關系57PCR技術的關鍵人工合成寡核苷酸片段（引物）耐熱的TaqDNApolymerase

（來自Thermusaquaticus，94kDa）PCR技術的關鍵人工合成寡核苷酸片段（引物）58PCR方法已成為分子生物學研究常規(guī)手段而且還用于遺傳、發(fā)育、進化、疾病診斷、法醫(yī)學等領域PCR技術的發(fā)明是現(xiàn)代生物學發(fā)展史上的又一個里程碑發(fā)明人獲得了1993年諾貝爾化學獎PCR方法已成為分子生物學研究常規(guī)手段59（三）人工合成基因根據(jù)已知的基因序列，或根據(jù)氨基酸序列推測DNA序列將化學合成寡核苷酸的方法與酶促合成DNA的方法結合起來，可以很快地人工合成基因。（三）人工合成基因根據(jù)已知的基因序列，或根據(jù)氨基酸序列推測60首先化學合成多個含有80－100個核苷酸的寡聚核苷酸每個寡聚核苷酸片段之間有19－24個核苷酸的重疊序列再將各個寡聚核苷酸等量(摩爾濃度)混合，在DNA聚合酶(或Taq酶)作用下，各寡聚核苷酸又作為引物合成新鏈，使單鏈部分補齊成為雙鏈。再用兩個PCR引物，經(jīng)PCR擴增出DNA片段。若將兩個DNA片段放在一起，經(jīng)SOE-PCR(sequenceoverlappedextension，SOE)擴增出完整的基因片段首先化學合成多個含有80－100個核苷酸的寡聚核苷酸61（四）T－DNA標簽克隆基因利用T－DNA插入創(chuàng)造突變體獲得突變體的純合材料分析突變體性狀與T－DNA的共分離關系PCR獲得T－DNA的側翼基因組序列用所得序列作探針篩選基因文庫，獲得目標基因或克隆再作進一步的分析（四）T－DNA標簽克隆基因利用T－DNA插入創(chuàng)造突變體62T－DNA標簽克隆基因的基本原理構建T－DNA載體轉化植物（T1，T－DNA雜合體）篩選T2，獲得突變體尋找與T－DNA共分離的個體讓其自交，產(chǎn)生純合體PCR獲得T－DNA兩側的基因組序列利用側翼DNA序列作探針從DNA文庫中釣取基因基因功能驗證（遺傳互補測驗，用分離的野生基因轉化突變體，恢復功能）T－DNA標簽克隆基因的基本原理構建T－DNA載體63重組DNA分子的構建用相同的內切酶酶解目的基因與載體將載體與目的基因混合用DNAligase連接重組DNA分子的構建用相同的內切酶酶解目的基因與載體64重組DNA分子的構建重組DNA分子的構建65§5外源基因導入宿主細胞將目的基因與載體連接，構建重組DNA分子重組DNA分子必須導入宿主細胞才能擴增或表達§5外源基因導入宿主細胞將目的基因與載體連接，構建重組D66重組DNA導入原核生物原核生物基因工程的受體通常是大腸桿菌導入方式多用轉化法也有用結合的方法重組DNA導入原核生物原核生物基因工程的受體通常是大腸桿菌67重組DNA導入植物1、根癌農(nóng)桿菌轉化技術2、基因槍法重組DNA導入植物1、根癌農(nóng)桿菌轉化技術68根癌農(nóng)桿菌轉化技術根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens)根癌農(nóng)桿菌介導的植物轉化是應用得最早而廣泛的一種植物轉化方法。雙子葉植物、單子葉植物都可以用。根癌農(nóng)桿菌轉化技術根癌農(nóng)桿菌69將目的基因與花椰菜花葉病毒35S啟動子及終止子組成嵌合DNA分子插入到Ti衍生質粒的RB與LB之間構成重組質粒轉化根瘤土壤桿菌細胞重組根瘤土壤桿菌感染植物細胞使質粒的部分DNA與目的基因一起整合到植物染色體上，實現(xiàn)遺傳轉化

將目的基因與花椰菜花葉病毒35S啟動子及終止子組成嵌合DNA70植物轉基因過程植物轉基因過程71基因槍法基因槍（genegun）法，又稱微粒轟擊法（microprojectilebombartment，biolistics）依賴高速的金屬微粒將外源基因導入植物細胞優(yōu)點：無宿主限制，可用于任何基因型的材料缺點：轉化頻率低，結果重復性差，多拷貝導入導致基因沉默，實驗成本高基因槍法基因槍（genegun）法，又稱微粒轟擊法（mic72基因工程的應用1、生物科學基礎研究的重要手段2、改良植物3、改良動物4、基因工程工業(yè)5、疾病診斷與基因治療6、環(huán)境保護基因工程的應用1、生物科學基礎研究的重要手段73生物科學基礎研究的重要手段基因結構的重疊現(xiàn)象和不連續(xù)性mRNA的剪輯轉座因子基因表達的調控生物與環(huán)境信號的識別癌變機理生物科學基礎研究的重要手段基因結構的重疊現(xiàn)象和不連續(xù)性74改良植物抗蟲植物抗除草劑植物1996年開始轉基因作物投入生產(chǎn)2003年，抗蟲作物1000萬hm2

抗除草劑作物5000萬hm2美國轉基因棉花80％；全球50％我國進口的大豆絕大部分是轉基因大豆改良植物抗蟲植物75改良動物比轉基因植物發(fā)展慢原因：涉及社會倫理和宗教問題在技術上動物細胞的再生能力克隆羊Dolly轉基因魚是比較成功的將重組DNA導入受體合子細胞核中，借助于母體環(huán)境實現(xiàn)轉基因動物生產(chǎn)改良動物比轉基因植物發(fā)展慢76基因工程工業(yè)生產(chǎn)工業(yè)、農(nóng)業(yè)、藥用蛋白質轉移花色基因或特異性狀，改變花卉的花色和外觀，提高觀賞價值基因工程工業(yè)生產(chǎn)工業(yè)、農(nóng)業(yè)、藥用蛋白質77人工生產(chǎn)胰島素人工生產(chǎn)胰島素78疾病診斷和基因治療正?；蛱娲毕莼蛐迯屯蛔兓蛑圃旒膊≡\斷試劑盒生產(chǎn)疫苗

用酵母菌生產(chǎn)人乙肝疫苗是第一個真核生物基因工程的商業(yè)化產(chǎn)品有人設想將蜘蛛絲彈性蛋白基因轉入植物，生產(chǎn)彈性蛛絲蛋白，治療人類軟骨細胞增生疾病診斷和基因治療正常基因替代缺陷基因79基因工程用于環(huán)境保護利用轉基因微生物降解污染物如：油船事故的處理基因工程用于環(huán)境保護利用轉基因微生物降解污染物80轉基因生物的安全性對環(huán)境的安全性對人類健康的安全性宗教及倫理問題風險未知既不能夸大風險，也不能掉以輕心國家有完善的安全性評價程序和一系列的政策法規(guī)轉基因生物的安全性對環(huán)境的安全性81第12章遺傳工程

第12章遺傳工程82本章教學時數(shù)：2學時。本章重點：基因工程的基本流程。本章難點：分子標記和基因圖譜；研究基因功能的方法本章教學時數(shù)：2學時。83§1

遺傳工程概述

遺傳工程：細胞工程酶工程發(fā)酵工程基因工程§1遺傳工程概述遺傳工程：84遺傳工程的概念遺傳工程（geneticengineering），也稱生物工程（biologicalengineering）。是指利用工程技術的方法改造和修飾生物體，使其產(chǎn)生新的性狀或更適合人類需求的產(chǎn)品的遺傳學手段。遺傳工程的概念遺傳工程（geneticengineer85廣義遺傳工程和狹義遺傳工程：廣義：包括細胞工程、基因工程、酶工程和發(fā)酵工程等。狹義：基因工程。廣義遺傳工程和狹義遺傳工程：廣義：包括細胞工程、基因工程、酶86細胞工程在離體（invitro）條件下以細胞為基本單位，借助人工培養(yǎng)基，對生物細胞進行培養(yǎng)、繁殖，或者使其發(fā)生變異，從而改良生物品種、創(chuàng)造新品種、加速繁育，或利用細胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質的過程。細胞工程包括細胞培養(yǎng)、細胞融合、細胞器轉移、生物體的克隆與規(guī)模化繁殖等。細胞工程在離體（invitro）條件下以細胞為基本單位，87第一個哺乳動物的克隆——Dolly羊第一個哺乳動物的克隆——Dolly羊88酶工程利用酶的催化作用，在一定的生物反應器中，將相應的原料轉化成所需要的產(chǎn)品。是酶學理論與化工技術相結合的新技術體系。酶工程利用酶的催化作用，在一定的生物反應器中，將相應的原料轉89發(fā)酵工程利用微生物與現(xiàn)代化工程技術相結合，工廠化生產(chǎn)人類需要的物質的一種技術體系。目前醫(yī)用抗生素、農(nóng)用抗生素絕大部分都是發(fā)酵工程產(chǎn)品。發(fā)酵工程利用微生物與現(xiàn)代化工程技術相結合，工廠化生產(chǎn)人類需90基因工程利用人工方法在體外（invitro）切割、拼接、重組生物的遺傳物質，獲得重組DNA分子，然后導入宿主細胞或個體，使受體的遺傳特性得到修飾或改良?；蚬こ滩僮鞯膶ο笫荄NA分子。又稱為重組DNA技術基因工程利用人工方法在體外（invitro）切割、拼接、重91重組DNA技術流程重組DNA技術流程92§２基因工程的工具酶內切核酸酶(endonuclease)DNA連接酶(ligase)DNA聚合酶（DNApolymerase）RNA聚合酶（RNApolymerase）反轉錄酶（reversetranscriptase）最重要的工具酶是限制性核酸內切酶（restrictionendonuclease）§２基因工程的工具酶內切核酸酶(endonuclease)93限制性內切核酸酶或稱限制性酶(restrictionenzyme),是基因工程最重要的工具。在細菌中這些酶的功能是降解外來DNA分子，以限制(restriction)或阻止病毒侵染。這類酶能識別雙鏈DNA分子中特異的核苷酸序列，并在特定的位置將雙連DNA分子切斷。限制性內切核酸酶或稱限制性酶(restrictionenz94EcoRⅠEcoRⅠ95限制性內切核酸酶的命名原則：根據(jù)分離出這種酶的細菌在分類學上的屬名、種名和菌株名來命名。名稱的第一個字母是該細菌的屬名的第一個字母，大寫，斜體。名稱的第二、三個字母是該細菌種名的前兩個字母，小寫，斜體。名稱的第四個字母是菌株的名稱，大寫或小寫，正體。如果沒有菌株名稱就不寫。名稱最后的是羅馬數(shù)字，表示從這種細菌中分離出來的酶的序號，如從某個菌株中分離出來的第一種酶為Ⅰ，第二種酶為Ⅱ，等等。限制性內切核酸酶的命名原則：根據(jù)分離出這種酶的細菌在分類學上96如EcoRⅠ來自大腸桿菌（Escherichiacoli）R菌株，讀作echo-r-one；HindⅢ來自流感噬血桿菌（Hemophilusinfluenzae）d菌株,讀作hind-three如EcoRⅠ來自大腸桿菌（Escherichiacoli）97限制酶的分類限制性核酸內切酶的工作分為2個步驟：識別特定的DNA序列在特定的位置切割DNA分子根據(jù)其作用特點,可以將限制性酶分為三種類型：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型。在基因工程中用途最廣泛的是Ⅱ型限制酶。限制酶的分類限制性核酸內切酶的工作分為2個步驟：98Ⅰ型限制酶有特定的識別序列但切割位置遠離識別位置有的種類可以在同識別序列相距1000bp的位置上隨機切割DNA分子在基因工程中沒有什么用途Ⅰ型限制酶有特定的識別序列99Ⅲ型限制酶有特定的識別序列切割位置在識別序列3’端相距20bp處，可以產(chǎn)生各種類型的單鏈末端。Ⅲ型限制酶在基因工程中有特定的用途，但總體來說，用途不大。Ⅲ型限制酶有特定的識別序列100Ⅱ型限制酶在DNA上有特定的識別序列而且其切割位點就在識別序列內部基因工程中用途最廣識別序列是對稱的，在一條鏈中從5’到3’方向的序列與其互補鏈從5’到3’方向的序列完全相同，稱為回紋對稱序列(palindrome)。Ⅱ型限制酶在DNA上有特定的識別序列101酶切與連接酶切與連接102常見內切酶常見內切酶103DNA連接酶(DNAligase)共價連接5′－磷酸和3′－OH，形成磷酸二酯鍵(3′－

5′phosphodiesterbond)

，封閉DNA雙鏈上的缺刻(nick)。DNA連接酶(DNAligase)共價連接5′－磷酸和3′104反轉錄酶

reversetranscriptase反轉錄酶

reversetranscriptase105

§3載體(vector)將外源DNA片段運送進宿主細胞(hostcell)進行擴增或表達的運載工具稱為載體。載體也是DNA分子。§3載體(vector)將外源DNA片段運送進宿主細胞106常用載體：細菌質粒、噬菌體、病毒等。

都要經(jīng)過人工改造。細菌人工染色體（BAC）酵母菌人工染色體（YAC）人類人工染色體（HAC）常用載體：細菌質粒、噬菌體、病毒等。107載體的基本條件①有獨立的復制原點(ori)，能獨立地自我復制，而且能帶動外源DNA一起復制。②具有多種限制性酶的切點，用于連接外源DNA片段。③載體上的限制酶酶切位點對于任何一種限制酶來說只能有一個。④具有一個選擇標記基因。載體的基本條件①有獨立的復制原點(ori)，能獨立地自我復制108質粒載體

①分子量小(2.69kb),但能攜帶較大的外源片段；②拷貝數(shù)多,在每個宿主細胞可達500個；③酶切位點多，克隆方便；④具有α-互補顯色表型,便于檢測。

質粒載體

①分子量小(2.69kb),但能攜帶較大的外源片段109互補顯色反應

互補顯色反應110λ噬菌體（30kb）

λ噬菌體（30kb）111粘粒（cosmid）載體（45kb）粘粒（cosmid）載體（45kb）112細菌人工染色體BAC（300kb）

bacterialartificialchromosome來源于F因子細菌人工染色體BAC（300kb）

bacterialar113YAC（1Mb）

yeastartificialchromosomeYAC（1Mb）

yeastartificialchro114Ti質粒Ti質粒是根癌農(nóng)桿菌的染色體外遺傳物質雙鏈閉合環(huán)狀DNA，150～200kb植物基因工程常用的載體Ti質粒Ti質粒是根癌農(nóng)桿菌的染色體外遺傳物質115Ti質粒結構T-DNATransferDNA是農(nóng)桿菌侵入植物細胞時從Ti質粒上轉移到植物細胞的一段DNAT-DNA兩端個有一段25bp的同向重復序列，是T-DNA的邊緣區(qū)LB；RB在同一條單鏈的LB和RB內各形成一個缺口，單鏈T-DNA進入植物細胞Ti質粒結構T-DNA116§4

基因的分離與鑒定

從基因庫中分離基因聚合酶鏈式反應(PCR)擴增基因人工合成基因T－DNA標簽法

§4基因的分離與鑒定從基因庫中分離基因117(一)從基因庫中分離基因

1．構建基因庫

2．篩選基因庫

3．陽性克隆的分析與鑒定

(一)從基因庫中分離基因1．構建基因庫1181．構建基因庫

基因庫(library)是一組DNA或cDNA序列克隆的集合體。創(chuàng)建基因文庫的目的是從特定的材料中分離目的DNA片段或基因。把所有的基因集中在一個庫中，采用一定的方法在庫中篩選目的基因。同時也便于基因的長期保存。1．構建基因庫基因庫(library)是一組DNA或cD119基因組文庫GenomicDNAlibrary使用與切割載體相同的限制酶，將供體生物的基因組DNA切割成許多片段將所有片段連接到載體上，構成一個重組DNA群體這個群體包含全基因組的遺傳信息基因組文庫GenomicDNAlibrary使用與切割120cDNA文庫cDNAlibrary以mRNA為模板，經(jīng)反轉錄酶合成互補DNA(complementaryDNA，cDNA)將雙鏈cDNA與適當載體連接轉化到宿主細胞內進行擴增，建成cDNA文庫cDNA文庫cDNAlibrary121基因組文庫與cDNA文庫的比較：基因組文庫包含基因組的所有基因cDNA文庫只包括某一特定細胞類型、某一組織、或某一發(fā)育時期的表達序列分離特定基因，cDNA庫比較方便研究調控序列，必須基因組文庫基因組文庫與cDNA文庫的比較：基因組文庫包含基因組的所有122從基因庫中篩選特定的克隆

一個基因文庫中有幾萬個克隆，目的基因到底在哪個克隆上呢？根據(jù)待選基因相關信息確定篩選方法和條件。最常用的方法是利用一段核苷酸序列作探針，用放射性同位素或非放射性同位素標記探針，篩選基因庫從基因庫中篩選特定的克隆一個基因文庫中有幾萬個克隆，目的基123DNA探針（probe）探針是一段能夠與待選目的基因互補的核酸序列DNA、cDNA、寡聚核苷酸單鏈、雙鏈同位素標記、熒光標記、顏色標記DNA探針（probe）探針是一段能夠與待選目的基因互補的124篩選文庫質?；驇旌Y選細菌混合液在培養(yǎng)在平板上轉移到尼龍膜上裂解細菌變性DNA標記探針雜交漂洗放射自顯影或熒光檢測挑取對應菌落、培養(yǎng)抽提質粒篩選文庫質?；驇旌Y選125陽性克隆的分析與鑒定

從基因庫中篩選出的陽性克隆，還需進一步分析、鑒定，才能最后得到目的基因測序自動測序儀功能分析預測軟件陽性克隆的分析與鑒定從基因庫中篩選出的陽性克隆，還需進一126核酸序列測定的原理核酸序列測定的原理127磷酸二脂鍵磷酸二脂鍵128測序電泳圖譜測序電泳圖譜129核酸序列分析與功能預測同源性比較

同源基因是指那些起源相同、序列相似的基因?？蓮暮怂峒暗鞍踪|兩種水平比較基因間的同源性。將測出的核酸序列同雜交的探針序列進行比較將得到的序列發(fā)到BLAST等DNAData庫的網(wǎng)址上比較核酸序列分析與功能預測同源性比較130開放閱讀框（openreadingframe,ORF）分析開放閱讀框：一段能編碼一條多肽鏈，并具有翻譯起始信號（ATG）和終止信號(TAA、TAG或TGA)的核苷酸序列。來自cDNA庫的序列可直接進行0RF分析，比較其與其他序列的同源性來確定其身份。來自核基因庫的序列，因大多數(shù)真核生物基因含有內含子。開放閱讀框（openreadingframe,ORF）131開放閱讀框（openreadingframe,ORF）分析開放閱讀框（openreadingframe,ORF）132

TGCTCGCTCCTACGAATCCTGCCCCTGAGTAACAATGACTGACTTTTAATTTGTTTGCAG61CTAGGGTGGGGATCGAGATGGTGATCTTGGAGCAGCCACAGCTGCTCCTTCTTCTTCTTC121TTCTTGTAGCAGCTGCAGCTGCAACCGGCGCCACAGCAGCCGACGACGAGTTGGAGTGTC181CCTCCTCCATCTTCGGTAAGTAGCAAAGCACAGTATGACATTCACGAATGCATGTCATGA241TCTATCACTCCCTTTGTCTTCGCTACATTACATACTCTGCCTGTGTTTACCTACTGTACC301CGTCTTCAATTCAATTTGCTGTTGGCTCCCGCGCTTTCCCGAAGCCGCGTGTAGTAGTAT361CATAAAAGTAGGAGTAGATCTTTAATTTGCCCGGCGAAAACTGCTCCTAGTGGTAGATCT421TTGGCTCGGATCGGAGAAGATATTGTAGCTGTACTCTGATCGAGAGCATGCATGCTTGTT481AATCCGATCGAGCGTATTCCTCTGAGTTTGTTATGCTCTGATATTGTAATTGTGGCTGGA541TAATTTTCAAGAAAAAAAAATCGGTTACATACATGCATTTGCACTAATTAACTAGATTGT601GCATCAACAGATCACGCTGTGAACTCTCAAGGCGCCATTCAGTTCCCCGTGTTCCACAAG661AAGCACCAATGCCTCCGCCCATGGTCTGTCCGTGCAACCCAGGCATCCTCGACCGGAGCA721TCAGGAGCAGGAAAAGGAGGAGGATTGAACAATCTACAGGAAGAGGAGATCACTTCATCA781AGTAGTACAAAAATCGACGTGATCGAAGACAGCAGCATCAACGACTTCCTGTTCCTAATG841GCCGTCAGTCTGGGCAAGCCACCGGTTGTGAACCTGGTGGCGATCGACACGGGATCCACC901CTCTCGTGGGTGCAATGCCAGCCGTGCGCGGTGCACTGCCACACGCAGTCCGCGAAGGCC961GGCCCGATATTCGATCCCGGCAGATCCTACACATCCCGGCGAGTTCGCTGCTCGTCGGTC1021AAGTGCGGCGAGCTGAGGTACGATCTGCGGCTCCAGCAAGCCAATTGCATGGAGAAGGAA1081GACAGCTGCACGTACAGCGTCACGTACGGGAACGGGTGGGCGTACAGCGTGGGCAAGATG1141GTGACAGACACGCTGAGGATTGGGGACTCGTTTATGGATCTCATGTTCGGGTGCAGCATG1201GATGTCAAGTACAGCGAATTCGAGGCCGGCATCTTTGGTTTCGGCAGCAGCAGCTTCTCT1261TTCTTCGAGCAGCTGGCAGGGTACCCTGATATTCTGAGTTACAAGGCATTAAGCTACTGC1321TTGCCCACTGACGAGACCAAGCCCGGATACATGATCCTGGGAAGATACGACCGTGCCGCC1381ATGGATGGGGGTTACACTCCTCTCTTCCGGTCAATCAACAGGCCAACCTACTCACTGACG1441ATGGAGATGCTTATCGCCAACGGGCAGAGATTGGTGACATCGTCTTCGGAGATGATCGTC1501GATTCCGGGGCCCAGAGGACGTCCCTGTGGCCTTCCACTTTTGCTCTCCTTGACAAGACC1561ATCACGCAGGCAATGTCGTCGATTGGGTATCACCGGACATCAAGAGCGCGCCAAGAATCA1621TACATCTGCTACTTATCGGAGCACGACTATTCTGGTTGGAACGGCACCATCACGCCCTTC1681TCCAACTGGTCCGCCTTGCCTCTGCTGGAGATCGGCTTCGCCGGCGGTGCTGCACTCGCT1741TTGCCACCCAGAAACGTCTTCTACAACGATCCACACCGCGGTTTGTGCATGACCTTTGCT1801CAGAATCCTGCTCTCAGGTCTCAGATACTGGGGAACAGGGTTACTCGATCCTTCGGAACA1861ACCTTCGACATCCAGGGGAAACAATTCGGCTTCAAATATGCCGTTTGCTGATCGTCGATT1921ATTCCTCATCCTATGATATCTTATAGCTTGCGGGTACGTACCAAGTATATATCAAACTAA1981TTGCATACATGCTCTCCCTCCCTCTGTCCATGCATGTCCTCGTTTCATTGCAAATCTGCA2041TCGATCAATCCAGTTACTGATAATTCCTCCTTATTAACTTAGGCTGATCGATCCATTGCT2101TCTCGTGTGTATATTATGCAGGTCGATTAATTAGCTGGTTTGCCCAAATAACTGATCGGA2161TTGGAGTCTTCTCCCGCGCTACACTACCCCTAGCTGCGATCGTATCACAAGCTAGCGGTA2221CTTGATTTGGGACCTAATTCGTTCAAAAAAAACTTGGCAGCTTAATTTGGGACCTAGTAG2281CTAGCTGAGCCACTACTAGATGTTTACGTACCAGCTATCCGTCGTTTGTTTGTGTCTCCT2341GTGCTTGTGCT2351bpTGCTCGCTCCTACGAATCCTGC133(二)聚合酶鏈式反應(PCR)擴增基因

利用PCR方法可以在數(shù)小時內使目的DNA片段擴增到數(shù)百萬個拷貝?；驹恚焊鶕?jù)待擴增基因的部分序列合成成對引物，在體外合成兩個引物之間的DNA序列。(二)聚合酶鏈式反應(PCR)擴增基因利用PCR方法可以134聚合酶鏈式反應

(PCR，polymerasechainreaction)聚合酶鏈式反應

(PCR，polymerasechain135PCR反應根據(jù)待擴增基因序列合成兩個引物，10-20bp,分別與待擴增基因二條鏈的兩端互補。在DNA模板變性成單鏈后，兩個引物分別與單鏈DNA復性，在耐熱的Taqpolymerse及4種脫氧核苷酸存在下，由引物引導合成DNA新鏈。3個步驟：變性94-95℃,雙鏈變性成單鏈復性50-70℃,兩個引物分別與單鏈DNA互補延伸72℃,在引物Taq酶的作用下從5'→3'的方向合成模板DNA的互補鏈。PCR反應根據(jù)待擴增基因序列合成兩個引物，10-20bp,分136PCR反應常有25－35個循環(huán)經(jīng)過25個循環(huán)以后，理論上原來一個分子DNA可以擴增為106個拷貝。僅用少量的模板DNA分子，可以得到大量擴增產(chǎn)物。通?？梢詳U增5kb左右的DNA片段。性能更好的Taq酶可以擴增長達40kb的DNA片段。PCR擴增的DNA序列經(jīng)過核酸序列測定分析后，可作為基因工程的目的基因。PCR反應常有25－35個循環(huán)137PCR循環(huán)數(shù)與產(chǎn)物拷貝數(shù)之間的關系PCR循環(huán)數(shù)與產(chǎn)物拷貝數(shù)之間的關系138PCR技術的關鍵人工合成寡核苷酸片段（引物）耐熱的TaqDNApolymerase

（來自Thermusaquaticus，94kDa）PCR技術的關鍵人工合成寡核苷酸片段（引物）139PCR方法已成為分子生物學研究常規(guī)手段而且還用于遺傳、發(fā)育、進化、疾病診斷、法醫(yī)學等領域PCR技術的發(fā)明是現(xiàn)代生物學發(fā)展史上的又一個里程碑發(fā)明人獲得了1993年諾貝爾化學獎PCR方法已成為分子生物學研究常規(guī)手段140（三）人工合成基因根據(jù)已知的基因序列，或根據(jù)氨基酸序列推測DNA序列將化學合成寡核苷酸的方法與酶促合成DNA的方法結合起來，可以很快地人工合成基因。（三）人工合成基因根據(jù)已知的基因序列，或根據(jù)氨基酸序列推測141首先化學合成多個含有80－100個核苷酸的寡聚核苷酸每個寡聚核苷酸片段之間有19－24個核苷酸的重疊序列再將各個寡聚核苷酸等量(摩爾濃度)混合，在DNA聚