第二章基因工程載體和工具酶課件

第二章基因工程載體和工具酶湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院袁婺洲第二章基因工程載體和工具酶湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1本章目錄2.1載體2.1.1質(zhì)粒載體2.1.2噬菌體載體2.1.3其他載體2.2工具酶2.2.1限制性核酸內(nèi)切酶2.2.2DNA聚合酶和Klenow大片段2.2.3DNA連接酶2.2.4堿性磷酸酶2.2.5末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶本章目錄2.1載體2第二章基因工程載體和工具酶第一節(jié)載體第二章基因工程載體和工具酶第一節(jié)載體3載體的功能及特征運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件載體的功能及特征運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)4克隆載體應(yīng)具備的條件具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）

具有合適的篩選標(biāo)記具有較高的外源DNA的裝載能力具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)整合位點(diǎn)克隆載體應(yīng)具備的條件具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移51.質(zhì)粒plasmid細(xì)菌染色體外的遺傳因子，閉合環(huán)狀雙鏈DNA大?。?-200kb能自主復(fù)制，但要利用寄主細(xì)胞復(fù)制染色體的同一組酶系復(fù)制分松弛型和嚴(yán)謹(jǐn)型兩種

松弛型：10-200拷貝（加氯霉素?cái)U(kuò)增）嚴(yán)謹(jǐn)型：1-10拷貝有某些基因，如抗藥性基因，對(duì)寄主的生長(zhǎng)是有利的1.質(zhì)粒plasmid細(xì)菌染色體外的遺傳因子，閉合環(huán)狀雙6天然質(zhì)粒天然質(zhì)粒7第二章基因工程載體和工具酶課件8PcopcopP/OrepreporiCopRep質(zhì)粒的自主復(fù)制性：ColE1、pMB1、pSC101等不同啟動(dòng)子pMB1質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)控制松弛型質(zhì)粒啟動(dòng)子的突變質(zhì)粒的基本特征PcopcopP/OrepreporiCopRep質(zhì)粒的自主92.質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性。質(zhì)粒的基本特征以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容2.質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不103.攜帶特殊的遺傳標(biāo)記：抗生素標(biāo)記基因1)氨芐青霉素抗性基因2)四環(huán)素抗性基因3)氯霉素抗性基因4)卡那霉素和新霉素抗性基因5）lacZ’基因質(zhì)粒的基本特征3.攜帶特殊的遺傳標(biāo)記：抗生素標(biāo)記基因1)氨芐青霉素抗性基因2)四環(huán)素抗性基因3)氯霉素抗性基因4)卡那霉素和新霉素抗性基因5）lacZ’基因3.攜帶特殊的遺傳標(biāo)記：抗生素標(biāo)記基因1)氨芐青霉素抗性基11LacZ基因的顯色原理：LacZ基因的顯色原理：12第二章基因工程載體和工具酶課件13第二章基因工程載體和工具酶課件14第二章基因工程載體和工具酶課件15LacZ基因表達(dá)的藍(lán)白斑菌落LacZ基因表達(dá)的藍(lán)白斑菌落16基因工程質(zhì)粒：PlasmidpBR322松馳型質(zhì)粒Ampr，Tetr多種限制性酶切位點(diǎn)全長(zhǎng)4362bp基因工程質(zhì)粒：PlasmidpBR322松馳型質(zhì)粒17PlasmidpBR322結(jié)構(gòu)圖4363bpPlasmidpBR322結(jié)構(gòu)圖4363bp18pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)來(lái)源pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)來(lái)源19Plasmidplink322在pBR322基礎(chǔ)上改建，增加了一個(gè)多接頭（polylinker），即增加了多克隆位點(diǎn)。全長(zhǎng)3.8kbPlasmidplink322在pBR322基礎(chǔ)上改建，20Plasmidplink322Plasmidplink32221

pUC質(zhì)粒(UniversityofCalifornia)

pUC質(zhì)粒是由大腸桿菌pBR322質(zhì)粒與M13噬菌體改建而成的雙鏈DNA質(zhì)粒載體

pUC18/pUC19全長(zhǎng)2674bp，有Amp抗性基因，一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)ori。帶有l(wèi)acZ的N端標(biāo)記序列；因在復(fù)制起點(diǎn)ori區(qū)域內(nèi)缺失rop基因（改進(jìn)的pMB1復(fù)制子），細(xì)胞即使生長(zhǎng)在無(wú)氯霉素環(huán)境中也可形成高拷貝數(shù)（500-700）。宿主菌攜帶β－半乳糖苷酶C端序列。重組子菌落是白色，空轉(zhuǎn)化子是藍(lán)色。pUC質(zhì)粒(UniversityofCalifo22PlasmidpUC18/pUC19

結(jié)構(gòu)

PlasmidpUC18/pUC19結(jié)構(gòu)23改建質(zhì)粒的要求：盡可能使質(zhì)?？s小，以便插入更大的外源DNA片段；增加多種酶切位點(diǎn)；增加標(biāo)記基因；提高外源DNA的表達(dá)水平；增加質(zhì)粒在受體細(xì)胞中的拷貝數(shù)改建質(zhì)粒的要求：盡可能使質(zhì)粒縮小，以便插入更大的外源DNA片24轉(zhuǎn)化子的篩選方法遺傳標(biāo)記篩選（載體與目的基因本身）DNA片段大小檢測(cè)核酸分子雜交目的基因表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)轉(zhuǎn)化子的篩選方法遺傳標(biāo)記篩選（載體與目的基因本身）25pBR322質(zhì)?？寺⊥庠椿虻倪^(guò)程

pBR322質(zhì)粒克隆外源基因的過(guò)程26載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)抗藥性篩選法ROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIAprpBR3224363bpori將外源DNA片段插在EcoRI位點(diǎn)：非重組子呈Apr、Tcr重組子呈Apr、Tcr將外源DNA片段插在BamHI位點(diǎn)：非重組子呈Apr、Tcr重組子呈Apr、Tcs載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)抗藥性篩選法ROPROISalIBamH27載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)顯色篩選法pUC18AprlacZ'oriApr

+X-gal重組子（Apr+lacZ-）

將外源基因克隆在pUC18的lacZ’標(biāo)記基因內(nèi)部，使之滅活，此時(shí)重組子呈Apr、lacZ-，白色菌落；而非重組子則呈Apr、lacZ+，藍(lán)色菌落載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)顯色篩選法pUC18AprlacZ'oriA28DNA片段大小檢測(cè)全酶解圖譜法：pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBBEP4.0kb1.0kb0.8kb用BamHI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA電泳觀察酶解產(chǎn)物片段：重組子：2.7kb+4.0kb非重組子：2.7kbDNA片段大小檢測(cè)全酶解圖譜法：pUC182.7kbHi29DNA片段大小檢測(cè)全酶解圖譜法：pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBP4.0kb1.0kb0.8kb用EcoRI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA目的重組子：

3.0kb+3.7kb

或者：

1.0kb+5.7kb用PstI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA目的重組子：3.2kb+3.5kb或者：0.8kb+5.9kbDNA片段大小檢測(cè)全酶解圖譜法：pUC182.7kbHi30質(zhì)粒DNA提取的策略質(zhì)粒DNA的提取細(xì)菌細(xì)胞破碎----堿使染色體DNA變性-----離心分離------收集質(zhì)粒DNA-----純化------保存真核細(xì)胞DNA的提取研磨使細(xì)胞破碎-----蛋白酶K去核蛋白----分離蛋白質(zhì)與DNA------純化-----沉淀------純度檢測(cè)質(zhì)粒DNA提取的策略質(zhì)粒DNA的提取31質(zhì)粒DNA的純化RNA酶去RNASDS-蛋白復(fù)合物蛋白酶K去蛋白質(zhì)酚-氯仿抽提純化試劑盒紫外分光光度計(jì)測(cè)A260與A280值：1·8或2·0質(zhì)粒DNA的純化RNA酶去RNA32質(zhì)粒DNA沉淀二倍體積的無(wú)水乙醇與DNA相混合。使乙醇的終含量占67%左右。室溫靜置30分鐘。乙醇沉淀時(shí)，加NaAcorNaCl至終濃度為0·1-0·25M，是為了中和DNA分子在堿性條件下所帶的負(fù)電荷，減少DNA分子同性電荷的相斥力。0·6倍體積的異丙醇沉淀，-20°C半小時(shí)。質(zhì)粒DNA沉淀二倍體積的無(wú)水乙醇與DNA相混合。使乙醇的終含33DNA分離

瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳氯化銫密度梯度離心DNA分離

瓊脂糖凝膠電泳34DNA濃度檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳0.05-0.1μgEB-標(biāo)準(zhǔn)DNA濃度比較:1ng紫外分光光度計(jì)測(cè)A260:0.1-1ideal,0.05-1.5accepted純度:分光光度計(jì)不但能確定核酸的濃度，還可以通過(guò)A260/A280估計(jì)核酸純度。純DNA其比值為1.8，純RNA為2.0。如比值高于1.8，說(shuō)明DNA樣品中含RNA，而樣品中的酚和蛋白質(zhì)將會(huì)導(dǎo)致比值降低。DNA濃度檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳0.05-0.1μg35EB與DNAEB與DNA36DNA大小測(cè)量凝膠上與標(biāo)準(zhǔn)分子量比較λHindIII100bpladder自己的markerDNA大小測(cè)量凝膠上與標(biāo)準(zhǔn)分子量比較37在紫外透射儀下看DNA時(shí)，DNA亮度與哪些因素有關(guān)？DNA濃度DNA大小波長(zhǎng)純度EB量等有關(guān)在紫外透射儀下看DNA時(shí)，DNA亮度與哪些因素有關(guān)？DNA濃38DNA電泳結(jié)果分析DNA電泳結(jié)果分析392.λ噬菌體λ噬菌體DNA是線性雙鏈DNA分子，48.5kb噬菌體λ粒子，DNA線性雙鏈，帶有12bp的粘性末端，稱為cos位點(diǎn)。噬菌體感染細(xì)菌以后，雙鏈DNA分子通過(guò)COS位點(diǎn)成環(huán)狀Λ基因組三個(gè)區(qū)域：左側(cè)：包括外殼蛋白基因，20kb

中間區(qū)：18kb

右側(cè)：復(fù)制及裂解基因，12kbλDNA+外源DNA之和必須在39-53kb之間，所以可插入7-21kb的外源片段

2.λ噬菌體λ噬菌體DNA是線性雙鏈DNA分子，48.405’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l-DNAλ噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTG41λ-DNA載體的構(gòu)建：刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)野生型的l-DNA鏈上有5個(gè)EcoRI位點(diǎn)和7個(gè)HindIII位點(diǎn)，

不利于重組操作，必須刪除至1-2個(gè)同時(shí)，為了便于各種來(lái)源的DNA片段的克隆，還需要增

加一些單一的酶切位點(diǎn)除了簡(jiǎn)單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增加酶位點(diǎn)λ-DNA載體的構(gòu)建：刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)野生型的l-DNA鏈42λ-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記與質(zhì)粒不同，野生型λ-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是l-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容l-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類：免疫功能類標(biāo)記顏色反應(yīng)類標(biāo)記λ-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記與質(zhì)粒不同，野生型λ-43λ-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記lacZlacZ基因編碼b-半乳糖苷酶，能催化無(wú)色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物；而空載體l-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑λ-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記lacZlacZ基因44(一)插入型載體(一)插入型載體45第二章基因工程載體和工具酶課件46在Charon4載體中克隆外源DNA在Charon4載體中克隆外源DNA473.M13單鏈?zhǔn)删wM13噬菌體的生物學(xué)特性：

生物結(jié)構(gòu)M13噬菌體的外型呈絲狀M13

噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成

M13

DNA全長(zhǎng)6407個(gè)核苷酸M13DNA上至少有10個(gè)基因2700個(gè)外殼蛋白分子M13

噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長(zhǎng)

3.M13單鏈?zhǔn)删wM13噬菌體的生物學(xué)特性：生物結(jié)構(gòu)M48第二章基因工程載體和工具酶課件49大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13DNA載體的構(gòu)建：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列載體lacZ‘polylinker大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13DNA載體的構(gòu)建：I50DNA測(cè)序片段的擴(kuò)增DNA測(cè)序片段的擴(kuò)增514.柯斯質(zhì)粒cosmid1978年由Collins和Hohn改建正常的質(zhì)粒與噬菌體的cos位點(diǎn)構(gòu)成有Amp，Tet抗性基因Cos位點(diǎn)可識(shí)別噬菌體的外殼蛋白，可被包裝4.柯斯質(zhì)粒cosmid1978年由Collins和Ho52柯斯質(zhì)粒（cosmid）的結(jié)構(gòu)pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalI1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段裝載范圍為31-45kb柯斯質(zhì)粒（cosmid）的結(jié)構(gòu)pHC796400bpTcr53柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：能像l-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞

裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：能像l-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)54柯斯質(zhì)粒的克隆過(guò)程柯斯質(zhì)粒的克隆過(guò)程555.人工微小染色體

YAC,yeastartificialchromosomeBAC,bacteriaartificialchromosomePAC,P1artificialchromosomeMAC,mammalcellartificialchromosomeFosmid,F因子改建而來(lái)5.人工微小染色體YAC,yeastartificia56酵母人工染色體（YAC）YAC載體應(yīng)含有下列元件：

酵母染色體的端粒序列

pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色體的復(fù)制子

酵母染色體的中心粒序列

酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記大腸桿菌的復(fù)制子

大腸桿菌的選擇標(biāo)記YAC載體的裝載量為350-400kb酵母人工染色體（YAC）YAC載體應(yīng)含有下列元件：酵母染色57YAC的構(gòu)建YAC的構(gòu)建58酵母人工染色體的應(yīng)用酵母人工染色體的應(yīng)用59克隆載體的發(fā)展歷史：第一代：環(huán)狀質(zhì)粒，裝載幾個(gè)到十幾個(gè)kb片段;第二代：經(jīng)過(guò)改建的病毒，裝載能力２０kb左右;第三代：cosmid,裝載能力30-40kb;第四代:YAC,裝載能力1-2Mb;第五代:新型載體:BAC,PAC,MAC,Fosmid等,裝載能力80-200kb克隆載體的發(fā)展歷史：第一代：環(huán)狀質(zhì)粒，裝載幾個(gè)到十幾個(gè)kb片606.穿梭質(zhì)粒載體（shuttleplasmidvector）

是一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號(hào)，因而可在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。6.穿梭質(zhì)粒載體（shuttleplasmidvect61大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體627.表達(dá)載體表達(dá)載體是將目的基因在人工控制下置于生物宿主中大量生產(chǎn)的載體.表達(dá)載體三個(gè)系統(tǒng):1.DNA復(fù)制及質(zhì)粒DNA的篩選:有DNA復(fù)制起點(diǎn)ori,及Amp,Tet抗性基因2.目的基因的轉(zhuǎn)錄:這一系統(tǒng)包括啟動(dòng)子,抑制物基因和轉(zhuǎn)錄終止子.啟動(dòng)子位于目的基因的上游,常用的如Placz等.3.蛋白質(zhì)的翻譯:包括核糖體識(shí)別位點(diǎn)SD,翻譯起始密碼子和終止密碼子.7.表達(dá)載體表達(dá)載體是將目的基因在人工控制下置于生物宿主中63第二章基因工程載體和工具酶課件64

pQE30載體屬于PDS質(zhì)粒家族大腸桿菌T5啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)表達(dá)的蛋白帶有一個(gè)六聚組氨酸接頭pQE30載體65GEX-4T-1原核表達(dá)載體：具有可高效誘導(dǎo)表達(dá)的tac啟動(dòng)子；采用溫和洗脫條件可將融合蛋白從親和介質(zhì)中洗脫下來(lái)，最大限度減少對(duì)蛋白活性的影響；具有專一性的凝血酶識(shí)別位點(diǎn)，可從融合產(chǎn)物中得到純化的目標(biāo)蛋白

GEX-4T-1原核表達(dá)載體：66含有氨芐青霉素抗性的pDNA3.1(-)真核表達(dá)質(zhì)粒吉?dú)W霉素含有氨芐青霉素抗性的pDNA3.1(-)真核表達(dá)質(zhì)粒吉?dú)W霉67第二章基因工程載體和工具酶課件68第二章基因工程載體和工具酶第二節(jié)工具酶第二章基因工程載體和工具酶第二節(jié)工具酶69用于核酸操作的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶堿性磷酸酯酶末端轉(zhuǎn)移酶用于核酸操作的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶701.限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈主要存在于原核細(xì)菌中，細(xì)菌的限制與修飾作用，幫助細(xì)菌限制外來(lái)DNA的入侵1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出

HindII和HindIII

1.限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割71限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名種名株名HindIII

EcoRIHaemophilus

influenzae

d嗜血流感桿菌d株同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶EscherichiacoliR限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名72限制性核酸內(nèi)切酶的種類1986年,615

種限制酶,98種甲基化酶；

1998年,10000種細(xì)菌或古細(xì)菌中存在3000種酶;2005年1月，共發(fā)現(xiàn)4342種限制酶和甲基化酶，其中限制酶有3681

種，商業(yè)化的限制酶有588

種，在Ⅱ型限制酶中共有221種特異性。限制性核酸內(nèi)切酶的種類1986年,615種限制酶,973限制性核酸內(nèi)切酶的分類主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATPMg2+SAMATPMg2+SAMMg2+識(shí)別序列TGAN8TGCT回文對(duì)稱序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位點(diǎn)距識(shí)別序列1kb處識(shí)別序列內(nèi)或附近距識(shí)別序列下游隨機(jī)性切割特異性切割24-26bp處限制性核酸內(nèi)切酶的分類主要特性74II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性①識(shí)別雙鏈DNA分子中4-8對(duì)堿基的特定序列②大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè)③識(shí)別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型回文結(jié)構(gòu)5‘…GCT

GAATTC

GAG…3’3‘…CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI的識(shí)別序列EcoRI的切割位點(diǎn)II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性①識(shí)別雙鏈DNA分子中475第二章基因工程載體和工具酶課件76EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…

G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…

G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-C-T-T-A-A-P

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…5’

退火4-7℃5‘…

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A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…

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G-C-T-C…5’OHPOHPEcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-77PstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C

…5’PstI37℃5‘…

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退火4-7℃5‘…

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A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHOHPPPstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G78PvuII等產(chǎn)生的平頭末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

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C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…

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C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’

PvuII等產(chǎn)生的平頭末端5‘…G-C-T-C-A-G-79限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)出現(xiàn)頻率44＝25646＝4096限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)出現(xiàn)頻率44＝25646＝409680同裂酶（同切點(diǎn)酶）：來(lái)源不同，識(shí)別順序相同或相近，切割序列相同，產(chǎn)生相同或不同的粘性末端。或者說(shuō)：不同來(lái)源的限制酶可以切割相同的序列。

Sau3AI:5’-GATC-3’3’-CTAG-5’BamHI:5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’同裂酶（同切點(diǎn)酶）：81同尾酶：來(lái)源各異，識(shí)別靶序列各不相同，但產(chǎn)生相同的粘性末端。

BglII:5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BamHI:5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’同尾酶：82影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA的純度(蛋白質(zhì)、酚、氯仿、EDTA、SDS、高濃度的鹽離子等)DNA的甲基化程度酶切消化反應(yīng)的溫度DNA的分子結(jié)構(gòu)限制性核酸內(nèi)切酶的緩沖液影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA的純度(蛋白質(zhì)、酚、氯仿83影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素1.DNA樣品的純度：蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反應(yīng)總體積延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素1.DNA樣品的純度：蛋白質(zhì)、842.緩沖液Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hr影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素:1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1小時(shí)，完全水解1mg標(biāo)準(zhǔn)DNA所需的酶量2.緩沖液Tris-HCl50mMpH7.5MgC85第二章基因工程載體和工具酶課件86第二章基因工程載體和工具酶課件87II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解對(duì)鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時(shí)酶解低鹽酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解對(duì)鹽濃度要求不同的酶，可采取882、DNA連接酶作用：負(fù)責(zé)雙鏈DNA中相鄰3`-OH與5`-磷酸基團(tuán)之間的磷酸二酯鍵的形成。只能連接切口（nickornike）不能連接缺口（gap）2、DNA連接酶作用：負(fù)責(zé)雙鏈DNA中相鄰3`-OH與5`-89平頭雙鏈DNA片段的連接操作粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接平頭末端的連接則屬于分子間的連接提高平頭末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）

加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)

平頭雙鏈DNA片段的連接操作粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接90平頭末端人工粘性末端的連接C3'

GG5'

G3'C5'C3'GT4-DNA連接酶TdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT3'C退火C3'

TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA

3'

GG3'

AAAAAAAAAAC5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGC3'

5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG平頭末端人工粘性末端的連接C3'GG5'G3'C91同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'

5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

退火GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGGCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAG同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接5'5'GAATTCCTTA92同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

TACTAG

5'5'

GATCAT5'

退火GCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATT4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT5'

TGATCAACTAGT5'

BclIIGCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接BamHI5'5'GGATCCC93不同粘性末端的連接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

CTGCAG5'

GACGTC3'

T4-DNAligaseCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC5'

CTGCAGGACGTC5'

PstI3'

T4-DNApol切平5'

CG5'

GCKlenow補(bǔ)平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGGCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC不同粘性末端的連接BamHI5'5'GGATCCCCTAG94DNA連接酶的反應(yīng)條件：Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃4-16hr1UDNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下15℃反應(yīng)1小時(shí)，完全連接1mgl-DNA（HindIII片段）所需的酶量DNA連接酶的反應(yīng)條件：Tris-HCl50-100m95重組率重組率的定義重組率=含有外源DNA的重組分子數(shù)/載體分子總數(shù)在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下，重組率一般為25-75%

提高重組率的方法：①提高外源DNA片段與載體的分子比：5:1-10:1②載體DNA分子在連接前先除去磷酸基團(tuán)③平頭末端增加同聚物尾巴重組率重組率的定義重組率=含有外源DNA的重組分子數(shù)96轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的定義

轉(zhuǎn)化率是每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。由于在一般的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)規(guī)模下，每個(gè)受體細(xì)胞最多只能接受一個(gè)載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，受體細(xì)胞接納DNA的個(gè)數(shù)，即克隆數(shù)轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的定義轉(zhuǎn)化率是每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化97轉(zhuǎn)化率的計(jì)算例如，pUC18對(duì)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108，即每微克pUC18中只有108個(gè)分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。一微克pUC18共有3.4X1011個(gè)分子（6.02X1017/2686X660），也就是說(shuō)，每3400個(gè)pUC18分子才有一個(gè)分子進(jìn)入受體細(xì)胞。

另一方面，在實(shí)際操作過(guò)程中，轉(zhuǎn)化一微克pUC18共需2ml感受態(tài)細(xì)胞，大約含有2X1010個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，也就是說(shuō)，每200個(gè)細(xì)胞只有一個(gè)細(xì)胞能接納pUC18DNA轉(zhuǎn)化率的計(jì)算例如，pUC18對(duì)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108，即每98轉(zhuǎn)化率的影響因素（1）載體及DNA重組分子方面：

載體本身的性質(zhì)與插入片段的大?。?）受體細(xì)胞方面：

受體細(xì)胞必須與載體相匹配，例如：pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM83株，轉(zhuǎn)化率很低；但對(duì)大腸桿菌ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高轉(zhuǎn)化率的影響因素（1）載體及DNA重組分子方面：載體本身99轉(zhuǎn)化率的影響因素（3）轉(zhuǎn)化方法方面：

Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化106-107/mg

DNA

l-DNA轉(zhuǎn)染107-108/mgDNA

電穿孔轉(zhuǎn)化106-109/mgDNA

轉(zhuǎn)化率的影響因素（3）轉(zhuǎn)化方法方面：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化1003.大腸桿菌DNA聚合酶I5‘→3‘的DNA聚合酶活性5‘→3‘的核酸外切酶活性3‘→5‘的核酸外切酶活性大腸桿菌DNA聚合酶I的基本性質(zhì)：3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-OH5‘pppdNMg2+3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…

C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNApolI3.大腸桿菌DNA聚合酶I5‘→3‘的DNA聚合酶活性5‘101缺口前移標(biāo)記法大腸桿菌DNA聚合酶I的基本用途：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘

Mg2+5‘dNTP5‘pppdA（a-32P-dATP）5‘…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’制備32P標(biāo)記的探針DNaseIDNApolI3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘缺口前移標(biāo)記法大腸桿菌DNA聚合酶I的基本用途：5‘…102大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本性質(zhì)：大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶Klenow酶仍擁有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klen103大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端DNA片段的同位素末端標(biāo)記cDNA第二鏈的合成雙脫氧末端終止法測(cè)定DNA序列大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klen1044.反轉(zhuǎn)錄酶：依賴于RNA的DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈3’AAAAAAAAAAAA5’mRNA反轉(zhuǎn)錄酶Mg2+dNTP5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNA4.反轉(zhuǎn)錄酶：依賴于RNA的DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：105反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈反轉(zhuǎn)錄酶3’RNA5’

DNA3’5’3’RNA5’

DNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶5’

DNA3’反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：反轉(zhuǎn)錄酶3’RNA5’DNA3’1065.堿性磷酸酯酶來(lái)自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP）來(lái)自大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（BAP）5‘pOH3‘

DNAorRNA5‘pppdN5‘pppNBAP/CIPOH3‘

5‘HO5‘HOdN5‘HON從DNA或RNA的三磷酸核苷酸上除去5`磷酸根殘基5.堿性磷酸酯酶來(lái)自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP）來(lái)107堿性磷酸酯酶從DNA或RNA的三磷酸核苷酸上除去5`磷酸根殘基用于5`端標(biāo)記32P用于防止載體的粘性末端的自連堿性磷酸酯酶從DNA或RNA的三磷酸核苷酸上除去5`磷酸根殘108防止載體的粘性末端的自連防止載體的粘性末端的自連109T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）5‘HO3‘HOOH3‘OH5‘T4-PNPMg2+

pppATP（g-32P-ATP）5‘p3‘HOOH3‘p5‘用于探針的末端同位素標(biāo)記：T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA的5‘-OH上加上磷酸基團(tuán)T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）5‘HO3‘HOO1106.末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）TdT的基本特性：不需要模板的DNA聚合酶，隨機(jī)摻入dNTPs5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTMg2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAA

OH3‘p5‘

6.末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）TdT的基本特性：不需要模板的D111用于人工接頭探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶的用途用于人工接頭末端轉(zhuǎn)移酶的用途1127.單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本反應(yīng)：內(nèi)切單鏈DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’S1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-CT-T-G-A-G-G-A-G-T…3’5‘…G-C-T-CA-G-C-T-CT-T-G-A-GG-A-G-T…3’5‘dNMPs或5‘NMPs7.單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本反應(yīng)：內(nèi)切單鏈113S1的用途：合成CDNA時(shí)切除單鏈環(huán)S1的用途：合成CDNA時(shí)切除單鏈環(huán)114S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1mapping）DNAmRNA雜交S1EcoRIS1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1mappi115第二章基因工程載體和工具酶湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院袁婺洲第二章基因工程載體和工具酶湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院116本章目錄2.1載體2.1.1質(zhì)粒載體2.1.2噬菌體載體2.1.3其他載體2.2工具酶2.2.1限制性核酸內(nèi)切酶2.2.2DNA聚合酶和Klenow大片段2.2.3DNA連接酶2.2.4堿性磷酸酶2.2.5末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶本章目錄2.1載體117第二章基因工程載體和工具酶第一節(jié)載體第二章基因工程載體和工具酶第一節(jié)載體118載體的功能及特征運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件載體的功能及特征運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)119克隆載體應(yīng)具備的條件具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）

具有合適的篩選標(biāo)記具有較高的外源DNA的裝載能力具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)整合位點(diǎn)克隆載體應(yīng)具備的條件具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移1201.質(zhì)粒plasmid細(xì)菌染色體外的遺傳因子，閉合環(huán)狀雙鏈DNA大?。?-200kb能自主復(fù)制，但要利用寄主細(xì)胞復(fù)制染色體的同一組酶系復(fù)制分松弛型和嚴(yán)謹(jǐn)型兩種

松弛型：10-200拷貝（加氯霉素?cái)U(kuò)增）嚴(yán)謹(jǐn)型：1-10拷貝有某些基因，如抗藥性基因，對(duì)寄主的生長(zhǎng)是有利的1.質(zhì)粒plasmid細(xì)菌染色體外的遺傳因子，閉合環(huán)狀雙121天然質(zhì)粒天然質(zhì)粒122第二章基因工程載體和工具酶課件123PcopcopP/OrepreporiCopRep質(zhì)粒的自主復(fù)制性：ColE1、pMB1、pSC101等不同啟動(dòng)子pMB1質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)控制松弛型質(zhì)粒啟動(dòng)子的突變質(zhì)粒的基本特征PcopcopP/OrepreporiCopRep質(zhì)粒的自主1242.質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性。質(zhì)粒的基本特征以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容2.質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不1253.攜帶特殊的遺傳標(biāo)記：抗生素標(biāo)記基因1)氨芐青霉素抗性基因2)四環(huán)素抗性基因3)氯霉素抗性基因4)卡那霉素和新霉素抗性基因5）lacZ’基因質(zhì)粒的基本特征3.攜帶特殊的遺傳標(biāo)記：抗生素標(biāo)記基因1)氨芐青霉素抗性基因2)四環(huán)素抗性基因3)氯霉素抗性基因4)卡那霉素和新霉素抗性基因5）lacZ’基因3.攜帶特殊的遺傳標(biāo)記：抗生素標(biāo)記基因1)氨芐青霉素抗性基126LacZ基因的顯色原理：LacZ基因的顯色原理：127第二章基因工程載體和工具酶課件128第二章基因工程載體和工具酶課件129第二章基因工程載體和工具酶課件130LacZ基因表達(dá)的藍(lán)白斑菌落LacZ基因表達(dá)的藍(lán)白斑菌落131基因工程質(zhì)粒：PlasmidpBR322松馳型質(zhì)粒Ampr，Tetr多種限制性酶切位點(diǎn)全長(zhǎng)4362bp基因工程質(zhì)粒：PlasmidpBR322松馳型質(zhì)粒132PlasmidpBR322結(jié)構(gòu)圖4363bpPlasmidpBR322結(jié)構(gòu)圖4363bp133pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)來(lái)源pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)來(lái)源134Plasmidplink322在pBR322基礎(chǔ)上改建，增加了一個(gè)多接頭（polylinker），即增加了多克隆位點(diǎn)。全長(zhǎng)3.8kbPlasmidplink322在pBR322基礎(chǔ)上改建，135Plasmidplink322Plasmidplink322136

pUC質(zhì)粒(UniversityofCalifornia)

pUC質(zhì)粒是由大腸桿菌pBR322質(zhì)粒與M13噬菌體改建而成的雙鏈DNA質(zhì)粒載體

pUC18/pUC19全長(zhǎng)2674bp，有Amp抗性基因，一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)ori。帶有l(wèi)acZ的N端標(biāo)記序列；因在復(fù)制起點(diǎn)ori區(qū)域內(nèi)缺失rop基因（改進(jìn)的pMB1復(fù)制子），細(xì)胞即使生長(zhǎng)在無(wú)氯霉素環(huán)境中也可形成高拷貝數(shù)（500-700）。宿主菌攜帶β－半乳糖苷酶C端序列。重組子菌落是白色，空轉(zhuǎn)化子是藍(lán)色。pUC質(zhì)粒(UniversityofCalifo137PlasmidpUC18/pUC19

結(jié)構(gòu)

PlasmidpUC18/pUC19結(jié)構(gòu)138改建質(zhì)粒的要求：盡可能使質(zhì)?？s小，以便插入更大的外源DNA片段；增加多種酶切位點(diǎn)；增加標(biāo)記基因；提高外源DNA的表達(dá)水平；增加質(zhì)粒在受體細(xì)胞中的拷貝數(shù)改建質(zhì)粒的要求：盡可能使質(zhì)?？s小，以便插入更大的外源DNA片139轉(zhuǎn)化子的篩選方法遺傳標(biāo)記篩選（載體與目的基因本身）DNA片段大小檢測(cè)核酸分子雜交目的基因表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)轉(zhuǎn)化子的篩選方法遺傳標(biāo)記篩選（載體與目的基因本身）140pBR322質(zhì)?？寺⊥庠椿虻倪^(guò)程

pBR322質(zhì)粒克隆外源基因的過(guò)程141載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)抗藥性篩選法ROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIAprpBR3224363bpori將外源DNA片段插在EcoRI位點(diǎn)：非重組子呈Apr、Tcr重組子呈Apr、Tcr將外源DNA片段插在BamHI位點(diǎn)：非重組子呈Apr、Tcr重組子呈Apr、Tcs載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)抗藥性篩選法ROPROISalIBamH142載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)顯色篩選法pUC18AprlacZ'oriApr

+X-gal重組子（Apr+lacZ-）

將外源基因克隆在pUC18的lacZ’標(biāo)記基因內(nèi)部，使之滅活，此時(shí)重組子呈Apr、lacZ-，白色菌落；而非重組子則呈Apr、lacZ+，藍(lán)色菌落載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)顯色篩選法pUC18AprlacZ'oriA143DNA片段大小檢測(cè)全酶解圖譜法：pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBBEP4.0kb1.0kb0.8kb用BamHI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA電泳觀察酶解產(chǎn)物片段：重組子：2.7kb+4.0kb非重組子：2.7kbDNA片段大小檢測(cè)全酶解圖譜法：pUC182.7kbHi144DNA片段大小檢測(cè)全酶解圖譜法：pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBP4.0kb1.0kb0.8kb用EcoRI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA目的重組子：

3.0kb+3.7kb

或者：

1.0kb+5.7kb用PstI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA目的重組子：3.2kb+3.5kb或者：0.8kb+5.9kbDNA片段大小檢測(cè)全酶解圖譜法：pUC182.7kbHi145質(zhì)粒DNA提取的策略質(zhì)粒DNA的提取細(xì)菌細(xì)胞破碎----堿使染色體DNA變性-----離心分離------收集質(zhì)粒DNA-----純化------保存真核細(xì)胞DNA的提取研磨使細(xì)胞破碎-----蛋白酶K去核蛋白----分離蛋白質(zhì)與DNA------純化-----沉淀------純度檢測(cè)質(zhì)粒DNA提取的策略質(zhì)粒DNA的提取146質(zhì)粒DNA的純化RNA酶去RNASDS-蛋白復(fù)合物蛋白酶K去蛋白質(zhì)酚-氯仿抽提純化試劑盒紫外分光光度計(jì)測(cè)A260與A280值：1·8或2·0質(zhì)粒DNA的純化RNA酶去RNA147質(zhì)粒DNA沉淀二倍體積的無(wú)水乙醇與DNA相混合。使乙醇的終含量占67%左右。室溫靜置30分鐘。乙醇沉淀時(shí)，加NaAcorNaCl至終濃度為0·1-0·25M，是為了中和DNA分子在堿性條件下所帶的負(fù)電荷，減少DNA分子同性電荷的相斥力。0·6倍體積的異丙醇沉淀，-20°C半小時(shí)。質(zhì)粒DNA沉淀二倍體積的無(wú)水乙醇與DNA相混合。使乙醇的終含148DNA分離

瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳氯化銫密度梯度離心DNA分離

瓊脂糖凝膠電泳149DNA濃度檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳0.05-0.1μgEB-標(biāo)準(zhǔn)DNA濃度比較:1ng紫外分光光度計(jì)測(cè)A260:0.1-1ideal,0.05-1.5accepted純度:分光光度計(jì)不但能確定核酸的濃度，還可以通過(guò)A260/A280估計(jì)核酸純度。純DNA其比值為1.8，純RNA為2.0。如比值高于1.8，說(shuō)明DNA樣品中含RNA，而樣品中的酚和蛋白質(zhì)將會(huì)導(dǎo)致比值降低。DNA濃度檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳0.05-0.1μg150EB與DNAEB與DNA151DNA大小測(cè)量凝膠上與標(biāo)準(zhǔn)分子量比較λHindIII100bpladder自己的markerDNA大小測(cè)量凝膠上與標(biāo)準(zhǔn)分子量比較152在紫外透射儀下看DNA時(shí)，DNA亮度與哪些因素有關(guān)？DNA濃度DNA大小波長(zhǎng)純度EB量等有關(guān)在紫外透射儀下看DNA時(shí)，DNA亮度與哪些因素有關(guān)？DNA濃153DNA電泳結(jié)果分析DNA電泳結(jié)果分析1542.λ噬菌體λ噬菌體DNA是線性雙鏈DNA分子，48.5kb噬菌體λ粒子，DNA線性雙鏈，帶有12bp的粘性末端，稱為cos位點(diǎn)。噬菌體感染細(xì)菌以后，雙鏈DNA分子通過(guò)COS位點(diǎn)成環(huán)狀Λ基因組三個(gè)區(qū)域：左側(cè)：包括外殼蛋白基因，20kb

中間區(qū)：18kb

右側(cè)：復(fù)制及裂解基因，12kbλDNA+外源DNA之和必須在39-53kb之間，所以可插入7-21kb的外源片段

2.λ噬菌體λ噬菌體DNA是線性雙鏈DNA分子，48.1555’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l-DNAλ噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTG156λ-DNA載體的構(gòu)建：刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)野生型的l-DNA鏈上有5個(gè)EcoRI位點(diǎn)和7個(gè)HindIII位點(diǎn)，

不利于重組操作，必須刪除至1-2個(gè)同時(shí)，為了便于各種來(lái)源的DNA片段的克隆，還需要增

加一些單一的酶切位點(diǎn)除了簡(jiǎn)單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增加酶位點(diǎn)λ-DNA載體的構(gòu)建：刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)野生型的l-DNA鏈157λ-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記與質(zhì)粒不同，野生型λ-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是l-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容l-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類：免疫功能類標(biāo)記顏色反應(yīng)類標(biāo)記λ-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記與質(zhì)粒不同，野生型λ-158λ-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記lacZlacZ基因編碼b-半乳糖苷酶，能催化無(wú)色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物；而空載體l-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑λ-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記lacZlacZ基因159(一)插入型載體(一)插入型載體160第二章基因工程載體和工具酶課件161在Charon4載體中克隆外源DNA在Charon4載體中克隆外源DNA1623.M13單鏈?zhǔn)删wM13噬菌體的生物學(xué)特性：

生物結(jié)構(gòu)M13噬菌體的外型呈絲狀M13

噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成

M13

DNA全長(zhǎng)6407個(gè)核苷酸M13DNA上至少有10個(gè)基因2700個(gè)外殼蛋白分子M13

噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長(zhǎng)

3.M13單鏈?zhǔn)删wM13噬菌體的生物學(xué)特性：生物結(jié)構(gòu)M163第二章基因工程載體和工具酶課件164大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13DNA載體的構(gòu)建：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列載體lacZ‘polylinker大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13DNA載體的構(gòu)建：I165DNA測(cè)序片段的擴(kuò)增DNA測(cè)序片段的擴(kuò)增1664.柯斯質(zhì)粒cosmid1978年由Collins和Hohn改建正常的質(zhì)粒與噬菌體的cos位點(diǎn)構(gòu)成有Amp，Tet抗性基因Cos位點(diǎn)可識(shí)別噬菌體的外殼蛋白，可被包裝4.柯斯質(zhì)粒cosmid1978年由Collins和Ho167柯斯質(zhì)粒（cosmid）的結(jié)構(gòu)pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalI1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段裝載范圍為31-45kb柯斯質(zhì)粒（cosmid）的結(jié)構(gòu)pHC796400bpTcr168柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：能像l-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞

裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：能像l-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)169柯斯質(zhì)粒的克隆過(guò)程柯斯質(zhì)粒的克隆過(guò)程1705.人工微小染色體

YAC,yeastartificialchromosomeBAC,bacteriaartificialchromosomePAC,P1artificialchromosomeMAC,mammalcellartificialchromosomeFosmid,F因子改建而來(lái)5.人工微小染色體YAC,yeastartificia171酵母人工染色體（YAC）YAC載體應(yīng)含有下列元件：

酵母染色體的端粒序列

pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色體的復(fù)制子

酵母染色體的中心粒序列

酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記大腸桿菌的復(fù)制子

大腸桿菌的選擇標(biāo)記YAC載體的裝載量為350-400kb酵母人工染色體（YAC）YAC載體應(yīng)含有下列元件：酵母染色172YAC的構(gòu)建YAC的構(gòu)建173酵母人工染色體的應(yīng)用酵母人工染色體的應(yīng)用174克隆載體的發(fā)展歷史：第一代：環(huán)狀質(zhì)粒，裝載幾個(gè)到十幾個(gè)kb片段;第二代：經(jīng)過(guò)改建的病毒，裝載能力２０kb左右;第三代：cosmid,裝載能力30-40kb;第四代:YAC,裝載能力1-2Mb;第五代:新型載體:BAC,PAC,MAC,Fosmid等,裝載能力80-200kb克隆載體的發(fā)展歷史：第一代：環(huán)狀質(zhì)粒，裝載幾個(gè)到十幾個(gè)kb片1756.穿梭質(zhì)粒載體（shuttleplasmidvector）

是一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號(hào)，因而可在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。6.穿梭質(zhì)粒載體（shuttleplasmidvect176大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體1777.表達(dá)載體表達(dá)載體是將目的基因在人工控制下置于生物宿主中大量生產(chǎn)的載體.表達(dá)載體三個(gè)系統(tǒng):1.DNA復(fù)制及質(zhì)粒DNA的篩選:有DNA復(fù)制起點(diǎn)ori,及Amp,Tet抗性基因2.目的基因的轉(zhuǎn)錄:這一系統(tǒng)包括啟動(dòng)子,抑制物基因和轉(zhuǎn)錄終止子.啟動(dòng)子位于目的基因的上游,常用的如Placz等.3.蛋白質(zhì)的翻譯:包括核糖體識(shí)別位點(diǎn)SD,翻譯起始密碼子和終止密碼子.7.表達(dá)載體表達(dá)載體是將目的基因在人工控制下置于生物宿主中178第二章基因工程載體和工具酶課件179

pQE30載體屬于PDS質(zhì)粒家族大腸桿菌T5啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)表達(dá)的蛋白帶有一個(gè)六聚組氨酸接頭pQE30載體180GEX-4T-1原核表達(dá)載體：具有可高效誘導(dǎo)表達(dá)的tac啟動(dòng)子；采用溫和洗脫條件可將融合蛋白從親和介質(zhì)中洗脫下來(lái)，最大限度減少對(duì)蛋白活性的影響；具有專一性的凝血酶識(shí)別位點(diǎn)，可從融合產(chǎn)物中得到純化的目標(biāo)蛋白

GEX-4T-1原核表達(dá)載體：181含有氨芐青霉素抗性的pDNA3.1(-)真核表達(dá)質(zhì)粒吉?dú)W霉素含有氨芐青霉素抗性的pDNA3.1(-)真核表達(dá)質(zhì)粒吉?dú)W霉182第二章基因工程載體和工具酶課件183第二章基因工程載體和工具酶第二節(jié)工具酶第二章基因工程載體和工具酶第二節(jié)工具酶184用于核酸操作的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶堿性磷酸酯酶末端轉(zhuǎn)移酶用于核酸操作的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶1851.限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈主要存在于原核細(xì)菌中，細(xì)菌的限制與修飾作用，幫助細(xì)菌限制外來(lái)DNA的入侵1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出

HindII和HindIII

1.限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割186限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名種名株名HindIII

EcoRIHaemophilus

influenzae

d嗜血流感桿菌d株同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶EscherichiacoliR限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名187限制性核酸內(nèi)切酶的種類1986年,615

種限制酶,98種甲基化酶；

1998年,10000種細(xì)菌或古細(xì)菌中存在3000種酶;2005年1月，共發(fā)現(xiàn)4342種限制酶和甲基化酶，其中限制酶有3681

種，商業(yè)化的限制酶有588

種，在Ⅱ型限制酶中共有221種特異性。限制性核酸內(nèi)切酶的種類1986年,615種限制酶,9188限制性核酸內(nèi)切酶的分類主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATPMg2+SAMATPMg2+SAMMg2+識(shí)別序列TGAN8TGCT回文對(duì)稱序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位點(diǎn)距識(shí)別序列1kb處識(shí)別序列內(nèi)或附近距識(shí)別序列下游隨機(jī)性切割特異性切割24-26bp處限制性核酸內(nèi)切酶的分類主要特性189II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性①識(shí)別雙鏈DNA分子中4-8對(duì)堿基的特定序列②大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè)③識(shí)別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型回文結(jié)構(gòu)5‘…GCT

GAATTC

GAG…3’3‘…CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI的識(shí)別序列EcoRI的切割位點(diǎn)II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性①識(shí)別雙鏈DNA分子中4190第二章基因工程載體和工具酶課件191EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…

G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…

G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C

…5’

退火4-7℃5‘…

G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHPEcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-192PstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C

…5’PstI37℃5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A-OH