生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件

化學(xué)檢測(cè)技術(shù)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院生化檢測(cè)分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院生化檢測(cè)分析1化學(xué)檢測(cè)是根據(jù)物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量測(cè)定的方法?；瘜W(xué)檢測(cè)是根據(jù)物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量測(cè)2第一節(jié)糖類的化學(xué)檢測(cè)碳水化合物統(tǒng)稱為糖類，是由碳、氫、氧三種元素組成的一大類化合物。自然界中糖類包括多糖、雙糖、單糖單糖和某些雙糖具有游離羰基——還原糖多糖和蔗糖等無(wú)還原性——非還原糖一、定義和分類第一節(jié)糖類的化學(xué)檢測(cè)碳水化合物統(tǒng)稱為糖類，是由碳、氫、氧3二、糖類的化學(xué)檢測(cè)原理糖類化學(xué)檢測(cè)主要是利用游離羰基的還原性質(zhì)，與試劑（氧化劑）進(jìn)行氧化還原反應(yīng)而進(jìn)行測(cè)定的。非還原糖必須轉(zhuǎn)化為還原糖再進(jìn)行測(cè)定。最常用的試劑：斐林（Fehling）試劑二、糖類的化學(xué)檢測(cè)原理糖類化學(xué)檢測(cè)主要是利用游離羰基的還原性4斐林試劑基本組成：A：CuSO4溶液B：NaOH和酒石酸鉀鈉溶液使用時(shí)A、B等體積混合(生成酒石酸鉀鈉銅）酒石酸鉀鈉銅是氧化劑，可與還原糖的游離羰基發(fā)生氧化還原反應(yīng)，而進(jìn)行糖的測(cè)定。斐林試劑基本組成：酒石酸鉀鈉銅是氧化劑，可與還原糖的游離羰基5三、測(cè)定糖常用方法1、蘭－愛(ài)農(nóng)（Lane-Eynon）法本方法又稱次甲基藍(lán)法、置換法、直接滴定法用次甲基藍(lán)作為指示劑，直接用還原糖滴定到斐林試劑中進(jìn)行測(cè)定的方法。紅色三、測(cè)定糖常用方法1、蘭－愛(ài)農(nóng)（Lane-Eynon）法紅色6由于次甲基藍(lán)氧化能力比二價(jià)銅弱，待二價(jià)銅全部還原后，過(guò)量1滴還原糖使次甲基藍(lán)還原，藍(lán)色消失?。獺2O＋＋HCL藍(lán)色無(wú)色多糖或其他非還原糖需轉(zhuǎn)化為還原糖后再滴定。如淀粉，可用酸解或酶解。由于次甲基藍(lán)氧化能力比二價(jià)銅弱，待二價(jià)銅全部還原后，過(guò)量1滴72、斐林試劑快速法（GB法）：

在斐林試劑中加入亞鐵氰化鉀（黃血鹽）。紅色的氧化亞銅沉淀與亞鐵氰化鉀絡(luò)合生成可溶性的復(fù)鹽，反應(yīng)終點(diǎn)為藍(lán)色消失，淡黃色出現(xiàn)。本方法是在藍(lán)一愛(ài)農(nóng)容量法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，其特點(diǎn)是試劑用量少，操作和計(jì)算都比較簡(jiǎn)便、快速，滴定終點(diǎn)明顯，反應(yīng)終點(diǎn)比蘭－愛(ài)農(nóng)法更為明顯。本法是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)分析方法。2、斐林試劑快速法（GB法）：本方法是在藍(lán)一愛(ài)農(nóng)容83、次碘酸鈉法4、銅試劑法3、次碘酸鈉法9第二節(jié)蛋白質(zhì)和氨基酸的化學(xué)檢測(cè)

蛋白質(zhì)是復(fù)雜的含氮有機(jī)化合物，所含的主要化學(xué)元素為C、H、O、N,在某些蛋白質(zhì)中還含有微量的P、Cu、Fe、I等元素，但含氮?jiǎng)t是蛋白質(zhì)區(qū)別其他有機(jī)化合物的主要標(biāo)志。第二節(jié)蛋白質(zhì)和氨基酸的化學(xué)檢測(cè)蛋10

不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，故各種不同的蛋白質(zhì)其含氮量也不同。

一般蛋白質(zhì)含氮量為16%，即一份氮素相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值（6.25）稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。

含氮量每克N相當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)

肉、蛋、豆16％6.25面粉17.6％5.70奶品15.7％6.38花生18.2％5.50鮭精蛋白31.5％3.17不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，故各種不同的蛋白11蛋白質(zhì)含有多個(gè)肽鍵，因此可用雙縮脲試劑及由其發(fā)展而來(lái)的福林－酚試劑進(jìn)行蛋白質(zhì)的測(cè)定。蛋白質(zhì)的基本組成單位是氨基酸。通過(guò)末端氨基酸分析，則可弄清蛋白質(zhì)中氨基酸的種類和排列順序。蛋白質(zhì)含有多個(gè)肽鍵，因此可用雙縮脲試劑及由其發(fā)展而來(lái)的福林－12一、定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量凱氏定氮法或微量凱氏定氮法（經(jīng)典的，仲裁的）1.原理

樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。一、定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量凱氏定氮法或微量凱氏定氮法（13蛋白質(zhì)nH2O濃H2SO4

nRCHCOOHNH2（1）+H2SO4＝(NH4)2SO4+CO2+SO2+H2ORCHCOOHNH2（2）（3）

(NH4)2SO4+2NaOH＝2NH3+Na2SO4+2H2O蛋白質(zhì)nH2O濃H2SO4nRCHCO14（4）

2NH3+H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O（5）

(NH4)2B4O7+5H2O+2HCl＝2NH4Cl+4H3BO3（4）2NH3+H3BO3＝(NH4)2B4O715消化：取一定量樣品放進(jìn)凱氏定氮瓶，加入一定量K2SO4、

CuSO4、濃H2SO4，通風(fēng)廚內(nèi)進(jìn)行。消化結(jié)束，消化液全部移入100mL容量瓶定容。消化蒸餾滴定與計(jì)算2.操作要點(diǎn)消化：消化蒸餾滴定與計(jì)算2.操作要點(diǎn)16A.硫酸鉀的作用

加入硫酸鉀可以提高溶液的沸點(diǎn)而加快有機(jī)物的分解，它與硫酸鉀作用生成硫酸氫鉀可提高反應(yīng)溫度其反應(yīng)式如下：

K2SO4+H2SO4=2KHSO4

2KHSO4K2SO4+H2O↑+SO3

一般純硫酸的沸點(diǎn)在340℃左右，而添加硫酸鉀后，可使溫度提高到400℃以上，原因主要在于隨著消化過(guò)程中硫酸不斷地被分解，水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大，故沸點(diǎn)升高。

但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過(guò)高，又會(huì)引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而造成損失：

（NH4）2SO4

NH3↑+(NH4)HSO42(NH4)HSO42NH3↑+2SO3↑+2H2OA.硫酸鉀的作用加入硫酸鉀可以提高溶液的沸點(diǎn)而加快有17B.硫酸銅的作用①催化劑

此反應(yīng)不斷進(jìn)行，待有機(jī)物被消化完后，不再有硫酸亞銅（褐色）生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色。②可以指示消化終點(diǎn)的到達(dá)。C+2CuSO4Cu2SO4+SO2↑+CO2↑Cu2SO4+2Ｈ2SO42CuSO4+SO2+2H2OB.硫酸銅的作用①催化劑C+2CuSO418生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件19生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件20（2）蒸餾、吸收（2）蒸餾、吸收21生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件22（2）蒸餾、吸收接收瓶?jī)?nèi)加入2%硼酸溶液10ml及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下；準(zhǔn)確吸取10.0ml樣品消化稀釋液由小玻杯流入反應(yīng)室，并以10ml水洗滌小玻杯使流入反應(yīng)室內(nèi)，塞緊小玻杯的棒狀玻塞。將10ml40%氫氧化鈉溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其緩緩流入反應(yīng)室，立即將玻塞蓋緊，并加水于小玻杯以防漏氣。蒸餾5min，移動(dòng)接受瓶，使冷凝管下端離開(kāi)液面，再蒸餾1min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部。（2）蒸餾、吸收接收瓶?jī)?nèi)加入2%硼酸溶液10ml及混合指示23（3）滴定全部蒸餾完畢后，用0.0100N標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定接收瓶中收集的氨量，直至硼酸-指示劑混合液由綠色變成淡紫紅色，即為滴定終點(diǎn)。（4）計(jì)算蛋白質(zhì)含量＝樣品的總氮量×6.25（3）滴定全部蒸餾完畢后，用0.0100N標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定接243、自動(dòng)凱氏定氮法（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時(shí)消化8個(gè)樣品，30分鐘可消化完畢。（3）自動(dòng)：自動(dòng)加堿蒸餾，自動(dòng)吸收和滴定，自動(dòng)數(shù)字顯示裝置。可計(jì)算總氮百分含量并記錄，12分鐘完成1個(gè)樣。3、自動(dòng)凱氏定氮法（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，25生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件26生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件27二、雙縮脲試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵，因此有雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)（多肽）＋CuSO4、NaOH→紫紅色化合物（銅－鈉雙縮脲絡(luò)合物）顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，與蛋白質(zhì)的分子量和氨基酸組成無(wú)關(guān)。二、雙縮脲試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵，因此有雙28三、福林－酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量雙縮脲法的發(fā)展，靈敏100倍，需時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)雙縮脲反應(yīng)有干擾的物質(zhì)對(duì)其影響更大，酚類和檸檬酸也有干擾。堿性銅試劑—雙縮脲反應(yīng)稀釋的苯酚試劑—與酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸反應(yīng)呈藍(lán)色兩種呈色反應(yīng)可疊加三、福林－酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量雙縮脲法的發(fā)展，靈敏10029四、氨基酸的測(cè)定（一）茚三酮比色法1.原理

氨基酸在堿性條件下與茚三酮作用生成藍(lán)紫色化合物，其顏色深淺與氨基酸含量成正比，測(cè)定反應(yīng)物的吸光度（λ570nm）可計(jì)算出樣品中氨基酸含量。四、氨基酸的測(cè)定（一）茚三酮比色法30生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件312.試劑

2%茚三酮pH8.04磷酸緩沖溶液氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液3.儀器分光光度計(jì)2.試劑32蛋白質(zhì)經(jīng)鹽酸水解成為游離氨基酸，經(jīng)氨基酸分析儀的離子交換柱分離后，與茚三酮溶液產(chǎn)生顏色反應(yīng)，再通過(guò)分光光度計(jì)比色測(cè)定氨基酸含量。（二）氨基酸自動(dòng)分析儀法蛋白質(zhì)經(jīng)鹽酸水解成為游離氨基酸，經(jīng)氨基酸33生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件34生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件35生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件36生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件37生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件38操作：（1）雙縮脲試劑的配制CuSO4、酒石酸鉀鈉、NaOH、0.1%KI(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1％標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白(mL)00.20.40.60.81.0蒸餾水(mL)1.00.80.60.40.20雙縮脲試劑(mL)444444室溫反應(yīng)30min測(cè)A540(3)樣品測(cè)定1mL＋4mL雙縮脲試劑，30min，測(cè)A540操作：39操作：（1）福林－酚試劑的配制甲液：堿性銅試劑（A、NaOH、NaCO3,B、CuSO4和酒石酸鉀鈉)乙液：稀釋的苯酚試劑（2）標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液配制結(jié)晶牛血清蛋白溶于0.9％NaCl或用酪蛋白（凱氏定氮法測(cè)定含量）（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作（4）樣品測(cè)定1mL樣品（含P15～500μg）＋5mL甲液，室溫10min，＋乙液0.5mL，混勻，室溫30min，測(cè)A500~750操作：40蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)檢測(cè)概念：免疫化學(xué)檢測(cè)、抗體、抗原、凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)檢測(cè)方法：（1）凝集反應(yīng)效價(jià)測(cè)定，細(xì)菌、病毒分類（2）沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)、界面（環(huán)狀）試驗(yàn)、免疫擴(kuò)散、免疫電泳、免疫親和層析、免疫熒光檢測(cè)等蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)檢測(cè)概念：免疫化學(xué)檢測(cè)、抗體、抗原、凝集反應(yīng)41氨基酸含量測(cè)定方法1茚三酮顯色法微酸性條件下，氨基酸茚三酮反應(yīng)生成紫色化合物，亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）茚三酮反應(yīng)生成黃色化合物取1mL樣品溶液（含氨基酸0.1～50ug)加1mL緩沖液（pH5.0～6.7），再加1mL茚三酮顯色液，100℃水浴15min，自來(lái)水冷卻后，加入3mL60％乙醇溶液，測(cè)定OD570，脯氨酸或羥脯氨酸測(cè)OD440氨基酸含量測(cè)定方法1茚三酮顯色法422甲醛滴定法測(cè)定氨基酸氨基酸是兩性電解質(zhì)，不能用一般酸堿指示劑通過(guò)氫氧化鈉來(lái)測(cè)定。加進(jìn)甲醛生成羥甲基衍生物，可以用堿滴定。注意：需用過(guò)量中性甲醛。2甲醛滴定法測(cè)定氨基酸氨基酸是兩性電解質(zhì)，不能用一般酸堿指43三核酸的化學(xué)檢測(cè)根據(jù)核酸所含的磷及戊糖的化學(xué)性質(zhì)，可用定磷法、二苯胺法和地衣酚法等進(jìn)行檢測(cè)。1定磷法測(cè)定核酸含量（1）核酸的消化（2）磷的測(cè)定定磷試劑，45℃水浴25min，冷卻至室溫測(cè)OD650無(wú)機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)液作標(biāo)準(zhǔn)曲線（3）核酸含量的計(jì)算一般DNA含磷9.5％,RNA含磷9.2％，RNA量＝（總磷量－無(wú)機(jī)磷量）×10.9DNA量＝（總磷量－無(wú)機(jī)磷量）×10.5三核酸的化學(xué)檢測(cè)根據(jù)核酸所含的磷及戊糖的化學(xué)性質(zhì)，可用定磷442二苯胺法測(cè)定DNA含量DNA中的2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)，在595nm處有最大吸收峰。在40～400μg范圍內(nèi)，OD595與DNA濃度成正比。少量乙醛可提高反應(yīng)靈敏度。（1）二苯胺試劑的配制（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作（3）樣品DNA含量測(cè)定2二苯胺法測(cè)定DNA含量DNA中的2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中453地衣酚法測(cè)定RNA含量核糖核酸在濃鹽酸和三氯化鐵的存在下，與3，5－二羥甲苯（地衣酚）反應(yīng)，生成綠色物質(zhì)。一定濃度范圍內(nèi)，OD670與RNA濃度成正比。所有戊糖均可進(jìn)行此反應(yīng)，注意干擾（如DNA）。操作：地衣酚試劑配制；標(biāo)準(zhǔn)曲線制作；樣品RNA測(cè)定3地衣酚法測(cè)定RNA含量核糖核酸在濃鹽酸和三氯化鐵的存在下46思考題1如何區(qū)別還原糖與非還原糖？舉出常見(jiàn)的還原糖與非還原糖。2有哪些定糖方法？熟悉各種方法的原理，所用試劑和操作要點(diǎn)。3如何測(cè)定薯類淀粉含量？4蛋白質(zhì)含量測(cè)定有哪些方法？熟悉各種方法的原理，所用試劑和操作要點(diǎn)。5如何用滴定法測(cè)定氨基酸含量？7如何用定磷法測(cè)定DNA或RNA含量？8二苯胺測(cè)定DNA和地衣酚測(cè)定RNA原理？9三瓶未知液分別為蛋白質(zhì)、糖和RNA，如何鑒定？思考題1如何區(qū)別還原糖與非還原糖？舉出常見(jiàn)的還原糖與非還原47生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件48生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件49生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件502碘量法I2→NaIO(氧化劑），其氧化能力較弱，僅適用于醛糖的測(cè)定，與酮糖不起反應(yīng)操作要點(diǎn)：（1）標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉溶液配制，0.05mol/L，沸騰后冷卻水配制，存放在棕色瓶中，一周后用標(biāo)準(zhǔn)重鉻酸鉀標(biāo)定。（2）標(biāo)準(zhǔn)碘液配制，0.1mol/L（3）空白滴定：空白液，用硫代硫酸鈉滴定試劑中全部碘2碘量法I2→NaIO(氧化劑），其氧化能力較弱，僅適用51碘量瓶中，10mL0.1mol/L碘液＋15mL0.1mol/LNaOH＋5mL空白液，搖勻后暗反應(yīng)15min＋1mL1mol/L硫酸溶液，用0.05mol/L硫代硫酸鈉滴定至淺黃色，加0.2mL0.5％淀粉液作指示劑，滴定至藍(lán)色消失，記錄V0(4)樣品滴定：以5mL樣品液代替空白液，V1(5)計(jì)算：醛糖含量＝（V0－V1）C×M×n注意：暗反應(yīng)后需酸化再滴定，滴定時(shí)開(kāi)始輕搖（碘揮發(fā)），后再搖（淀粉吸附碘）配合次甲基藍(lán)法測(cè)定某些糖含量（如果糖）碘量瓶中，10mL0.1mol/L碘液＋15mL0.1mo523銅試劑法將還原糖與二價(jià)銅離子反應(yīng)生成的Cu2O用碘氧化，再用硫代硫酸鈉滴定反應(yīng)液中剩余的碘而測(cè)定樣品還原糖的含量。（1）銅試劑的配制主要提供二價(jià)銅離子及碘（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作3銅試劑法將還原糖與二價(jià)銅離子反應(yīng)生成的Cu2O用碘氧化，53（a)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液的配制0.1%或0.05％（根據(jù)所用銅離子試劑定）（b)三角瓶編號(hào)123456葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（mL)012345蒸餾水（mL)543210銅試劑（mL)555555沸水浴10min，冷卻至室溫（c)各加入0.5mol/L硫酸5mL，振蕩，待紅色Cu2O完全溶解后，用硫代硫酸鈉滴定至終點(diǎn)，記錄耗用量V(d)繪標(biāo)準(zhǔn)曲線葡萄糖含量（mg）為縱坐標(biāo)，（V0-V)為橫坐標(biāo)（a)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液的配制54操作要點(diǎn)（1）斐林試劑的標(biāo)定（a）標(biāo)定預(yù)備試驗(yàn)A、B各5mL＋10mL水（250mL三角瓶中）搖勻，加熱至沸騰，＋2滴1％次甲基藍(lán)溶液，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液滴定至藍(lán)色消失，耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液（0.1％或0.2％）V1mL。（b）標(biāo)定A、B各5mL＋10mL水（250mL三角瓶中）搖勻，從滴定管中預(yù)先加入（V1-1)mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液，搖勻后加熱加熱至沸騰，＋2滴1％次甲基藍(lán)溶液，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液滴定至藍(lán)色消失（滴定在1min內(nèi)完成），記錄消耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液的總毫升數(shù)V0操作要點(diǎn)（1）斐林試劑的標(biāo)定55(2)定糖（a）定糖預(yù)備試驗(yàn)A、B各5mL＋10mL樣品糖液（250mL三角瓶中）搖勻，加熱至沸騰，＋2D1％次甲基藍(lán)溶液，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液滴定至藍(lán)色消失，耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液（0.1％或0.2％）V2mL。（b）定糖A、B各5mL＋10mL樣品糖液（250mL三角瓶中）搖勻，補(bǔ)加（V0-V2）mL水，并從滴定管中預(yù)先加入（V2-1)mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液，搖勻后加熱加熱至沸騰，＋2D1％次甲基藍(lán)溶液，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液滴定至藍(lán)色消失（滴定在1min內(nèi)完成），記錄消耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液的總毫升數(shù)V(2)定糖56(3)計(jì)算還原糖含量（以葡萄糖計(jì)）＝（V0-V)×c×(1/10)×n注意：（a）AB分開(kāi)儲(chǔ)存，防止Cu2+變化，臨用混合（b）單標(biāo)移液管吸液準(zhǔn)確，外壁也需擦干凈（c）體積需控制在一定范圍內(nèi)，對(duì)pH有影響（d）煮沸時(shí)間要一致（e）注意指示劑加入時(shí)間和加入量一致（f）滴定速度一致（后滴定0.5～1mL，1min內(nèi)完成）（g）產(chǎn)物Cu2O不穩(wěn)定，次甲基藍(lán)變色也不穩(wěn)定，暴露于空氣或沸騰顏色變化，滴定過(guò)程不能搖動(dòng)，不可中途中止加熱。(3)計(jì)算574.測(cè)定方法（1）樣品處理稱樣→加水、活性炭→加熱提取→過(guò)濾→濾液定容（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線制備與樣品測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液(200μg/mL)樣液標(biāo)準(zhǔn)或樣液體積,ml0.00.51.01.52.02.52.0加入25mL比色管，加水至4.0ml加1mL茚三酮水浴加熱15min迅速冷卻，定容至25mL，靜置15min測(cè)定吸光度（λ570nm)0A1A2A3A4A5Ai5.結(jié)果計(jì)算4.測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)溶液(200μg/mL)樣液標(biāo)準(zhǔn)或樣液體積58化學(xué)檢測(cè)技術(shù)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院生化檢測(cè)分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院生化檢測(cè)分析59化學(xué)檢測(cè)是根據(jù)物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量測(cè)定的方法?；瘜W(xué)檢測(cè)是根據(jù)物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量測(cè)60第一節(jié)糖類的化學(xué)檢測(cè)碳水化合物統(tǒng)稱為糖類，是由碳、氫、氧三種元素組成的一大類化合物。自然界中糖類包括多糖、雙糖、單糖單糖和某些雙糖具有游離羰基——還原糖多糖和蔗糖等無(wú)還原性——非還原糖一、定義和分類第一節(jié)糖類的化學(xué)檢測(cè)碳水化合物統(tǒng)稱為糖類，是由碳、氫、氧61二、糖類的化學(xué)檢測(cè)原理糖類化學(xué)檢測(cè)主要是利用游離羰基的還原性質(zhì)，與試劑（氧化劑）進(jìn)行氧化還原反應(yīng)而進(jìn)行測(cè)定的。非還原糖必須轉(zhuǎn)化為還原糖再進(jìn)行測(cè)定。最常用的試劑：斐林（Fehling）試劑二、糖類的化學(xué)檢測(cè)原理糖類化學(xué)檢測(cè)主要是利用游離羰基的還原性62斐林試劑基本組成：A：CuSO4溶液B：NaOH和酒石酸鉀鈉溶液使用時(shí)A、B等體積混合(生成酒石酸鉀鈉銅）酒石酸鉀鈉銅是氧化劑，可與還原糖的游離羰基發(fā)生氧化還原反應(yīng)，而進(jìn)行糖的測(cè)定。斐林試劑基本組成：酒石酸鉀鈉銅是氧化劑，可與還原糖的游離羰基63三、測(cè)定糖常用方法1、蘭－愛(ài)農(nóng)（Lane-Eynon）法本方法又稱次甲基藍(lán)法、置換法、直接滴定法用次甲基藍(lán)作為指示劑，直接用還原糖滴定到斐林試劑中進(jìn)行測(cè)定的方法。紅色三、測(cè)定糖常用方法1、蘭－愛(ài)農(nóng)（Lane-Eynon）法紅色64由于次甲基藍(lán)氧化能力比二價(jià)銅弱，待二價(jià)銅全部還原后，過(guò)量1滴還原糖使次甲基藍(lán)還原，藍(lán)色消失！＋＋H2O＋＋HCL藍(lán)色無(wú)色多糖或其他非還原糖需轉(zhuǎn)化為還原糖后再滴定。如淀粉，可用酸解或酶解。由于次甲基藍(lán)氧化能力比二價(jià)銅弱，待二價(jià)銅全部還原后，過(guò)量1滴652、斐林試劑快速法（GB法）：

在斐林試劑中加入亞鐵氰化鉀（黃血鹽）。紅色的氧化亞銅沉淀與亞鐵氰化鉀絡(luò)合生成可溶性的復(fù)鹽，反應(yīng)終點(diǎn)為藍(lán)色消失，淡黃色出現(xiàn)。本方法是在藍(lán)一愛(ài)農(nóng)容量法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，其特點(diǎn)是試劑用量少，操作和計(jì)算都比較簡(jiǎn)便、快速，滴定終點(diǎn)明顯，反應(yīng)終點(diǎn)比蘭－愛(ài)農(nóng)法更為明顯。本法是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)分析方法。2、斐林試劑快速法（GB法）：本方法是在藍(lán)一愛(ài)農(nóng)容663、次碘酸鈉法4、銅試劑法3、次碘酸鈉法67第二節(jié)蛋白質(zhì)和氨基酸的化學(xué)檢測(cè)

蛋白質(zhì)是復(fù)雜的含氮有機(jī)化合物，所含的主要化學(xué)元素為C、H、O、N,在某些蛋白質(zhì)中還含有微量的P、Cu、Fe、I等元素，但含氮?jiǎng)t是蛋白質(zhì)區(qū)別其他有機(jī)化合物的主要標(biāo)志。第二節(jié)蛋白質(zhì)和氨基酸的化學(xué)檢測(cè)蛋68

不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，故各種不同的蛋白質(zhì)其含氮量也不同。

一般蛋白質(zhì)含氮量為16%，即一份氮素相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值（6.25）稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。

含氮量每克N相當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)

肉、蛋、豆16％6.25面粉17.6％5.70奶品15.7％6.38花生18.2％5.50鮭精蛋白31.5％3.17不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，故各種不同的蛋白69蛋白質(zhì)含有多個(gè)肽鍵，因此可用雙縮脲試劑及由其發(fā)展而來(lái)的福林－酚試劑進(jìn)行蛋白質(zhì)的測(cè)定。蛋白質(zhì)的基本組成單位是氨基酸。通過(guò)末端氨基酸分析，則可弄清蛋白質(zhì)中氨基酸的種類和排列順序。蛋白質(zhì)含有多個(gè)肽鍵，因此可用雙縮脲試劑及由其發(fā)展而來(lái)的福林－70一、定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量凱氏定氮法或微量凱氏定氮法（經(jīng)典的，仲裁的）1.原理

樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。一、定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量凱氏定氮法或微量凱氏定氮法（71蛋白質(zhì)nH2O濃H2SO4

nRCHCOOHNH2（1）+H2SO4＝(NH4)2SO4+CO2+SO2+H2ORCHCOOHNH2（2）（3）

(NH4)2SO4+2NaOH＝2NH3+Na2SO4+2H2O蛋白質(zhì)nH2O濃H2SO4nRCHCO72（4）

2NH3+H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O（5）

(NH4)2B4O7+5H2O+2HCl＝2NH4Cl+4H3BO3（4）2NH3+H3BO3＝(NH4)2B4O773消化：取一定量樣品放進(jìn)凱氏定氮瓶，加入一定量K2SO4、

CuSO4、濃H2SO4，通風(fēng)廚內(nèi)進(jìn)行。消化結(jié)束，消化液全部移入100mL容量瓶定容。消化蒸餾滴定與計(jì)算2.操作要點(diǎn)消化：消化蒸餾滴定與計(jì)算2.操作要點(diǎn)74A.硫酸鉀的作用

加入硫酸鉀可以提高溶液的沸點(diǎn)而加快有機(jī)物的分解，它與硫酸鉀作用生成硫酸氫鉀可提高反應(yīng)溫度其反應(yīng)式如下：

K2SO4+H2SO4=2KHSO4

2KHSO4K2SO4+H2O↑+SO3

一般純硫酸的沸點(diǎn)在340℃左右，而添加硫酸鉀后，可使溫度提高到400℃以上，原因主要在于隨著消化過(guò)程中硫酸不斷地被分解，水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大，故沸點(diǎn)升高。

但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過(guò)高，又會(huì)引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而造成損失：

（NH4）2SO4

NH3↑+(NH4)HSO42(NH4)HSO42NH3↑+2SO3↑+2H2OA.硫酸鉀的作用加入硫酸鉀可以提高溶液的沸點(diǎn)而加快有75B.硫酸銅的作用①催化劑

此反應(yīng)不斷進(jìn)行，待有機(jī)物被消化完后，不再有硫酸亞銅（褐色）生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色。②可以指示消化終點(diǎn)的到達(dá)。C+2CuSO4Cu2SO4+SO2↑+CO2↑Cu2SO4+2Ｈ2SO42CuSO4+SO2+2H2OB.硫酸銅的作用①催化劑C+2CuSO476生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件77生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件78（2）蒸餾、吸收（2）蒸餾、吸收79生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件80（2）蒸餾、吸收接收瓶?jī)?nèi)加入2%硼酸溶液10ml及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下；準(zhǔn)確吸取10.0ml樣品消化稀釋液由小玻杯流入反應(yīng)室，并以10ml水洗滌小玻杯使流入反應(yīng)室內(nèi)，塞緊小玻杯的棒狀玻塞。將10ml40%氫氧化鈉溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其緩緩流入反應(yīng)室，立即將玻塞蓋緊，并加水于小玻杯以防漏氣。蒸餾5min，移動(dòng)接受瓶，使冷凝管下端離開(kāi)液面，再蒸餾1min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部。（2）蒸餾、吸收接收瓶?jī)?nèi)加入2%硼酸溶液10ml及混合指示81（3）滴定全部蒸餾完畢后，用0.0100N標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定接收瓶中收集的氨量，直至硼酸-指示劑混合液由綠色變成淡紫紅色，即為滴定終點(diǎn)。（4）計(jì)算蛋白質(zhì)含量＝樣品的總氮量×6.25（3）滴定全部蒸餾完畢后，用0.0100N標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定接823、自動(dòng)凱氏定氮法（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時(shí)消化8個(gè)樣品，30分鐘可消化完畢。（3）自動(dòng)：自動(dòng)加堿蒸餾，自動(dòng)吸收和滴定，自動(dòng)數(shù)字顯示裝置?？捎?jì)算總氮百分含量并記錄，12分鐘完成1個(gè)樣。3、自動(dòng)凱氏定氮法（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，83生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件84生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件85二、雙縮脲試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵，因此有雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)（多肽）＋CuSO4、NaOH→紫紅色化合物（銅－鈉雙縮脲絡(luò)合物）顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，與蛋白質(zhì)的分子量和氨基酸組成無(wú)關(guān)。二、雙縮脲試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵，因此有雙86三、福林－酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量雙縮脲法的發(fā)展，靈敏100倍，需時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)雙縮脲反應(yīng)有干擾的物質(zhì)對(duì)其影響更大，酚類和檸檬酸也有干擾。堿性銅試劑—雙縮脲反應(yīng)稀釋的苯酚試劑—與酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸反應(yīng)呈藍(lán)色兩種呈色反應(yīng)可疊加三、福林－酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量雙縮脲法的發(fā)展，靈敏10087四、氨基酸的測(cè)定（一）茚三酮比色法1.原理

氨基酸在堿性條件下與茚三酮作用生成藍(lán)紫色化合物，其顏色深淺與氨基酸含量成正比，測(cè)定反應(yīng)物的吸光度（λ570nm）可計(jì)算出樣品中氨基酸含量。四、氨基酸的測(cè)定（一）茚三酮比色法88生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件892.試劑

2%茚三酮pH8.04磷酸緩沖溶液氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液3.儀器分光光度計(jì)2.試劑90蛋白質(zhì)經(jīng)鹽酸水解成為游離氨基酸，經(jīng)氨基酸分析儀的離子交換柱分離后，與茚三酮溶液產(chǎn)生顏色反應(yīng)，再通過(guò)分光光度計(jì)比色測(cè)定氨基酸含量。（二）氨基酸自動(dòng)分析儀法蛋白質(zhì)經(jīng)鹽酸水解成為游離氨基酸，經(jīng)氨基酸91生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件92生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件93生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件94生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件95生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件96操作：（1）雙縮脲試劑的配制CuSO4、酒石酸鉀鈉、NaOH、0.1%KI(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1％標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白(mL)00.20.40.60.81.0蒸餾水(mL)1.00.80.60.40.20雙縮脲試劑(mL)444444室溫反應(yīng)30min測(cè)A540(3)樣品測(cè)定1mL＋4mL雙縮脲試劑，30min，測(cè)A540操作：97操作：（1）福林－酚試劑的配制甲液：堿性銅試劑（A、NaOH、NaCO3,B、CuSO4和酒石酸鉀鈉)乙液：稀釋的苯酚試劑（2）標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液配制結(jié)晶牛血清蛋白溶于0.9％NaCl或用酪蛋白（凱氏定氮法測(cè)定含量）（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作（4）樣品測(cè)定1mL樣品（含P15～500μg）＋5mL甲液，室溫10min，＋乙液0.5mL，混勻，室溫30min，測(cè)A500~750操作：98蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)檢測(cè)概念：免疫化學(xué)檢測(cè)、抗體、抗原、凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)檢測(cè)方法：（1）凝集反應(yīng)效價(jià)測(cè)定，細(xì)菌、病毒分類（2）沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)、界面（環(huán)狀）試驗(yàn)、免疫擴(kuò)散、免疫電泳、免疫親和層析、免疫熒光檢測(cè)等蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)檢測(cè)概念：免疫化學(xué)檢測(cè)、抗體、抗原、凝集反應(yīng)99氨基酸含量測(cè)定方法1茚三酮顯色法微酸性條件下，氨基酸茚三酮反應(yīng)生成紫色化合物，亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）茚三酮反應(yīng)生成黃色化合物取1mL樣品溶液（含氨基酸0.1～50ug)加1mL緩沖液（pH5.0～6.7），再加1mL茚三酮顯色液，100℃水浴15min，自來(lái)水冷卻后，加入3mL60％乙醇溶液，測(cè)定OD570，脯氨酸或羥脯氨酸測(cè)OD440氨基酸含量測(cè)定方法1茚三酮顯色法1002甲醛滴定法測(cè)定氨基酸氨基酸是兩性電解質(zhì)，不能用一般酸堿指示劑通過(guò)氫氧化鈉來(lái)測(cè)定。加進(jìn)甲醛生成羥甲基衍生物，可以用堿滴定。注意：需用過(guò)量中性甲醛。2甲醛滴定法測(cè)定氨基酸氨基酸是兩性電解質(zhì)，不能用一般酸堿指101三核酸的化學(xué)檢測(cè)根據(jù)核酸所含的磷及戊糖的化學(xué)性質(zhì)，可用定磷法、二苯胺法和地衣酚法等進(jìn)行檢測(cè)。1定磷法測(cè)定核酸含量（1）核酸的消化（2）磷的測(cè)定定磷試劑，45℃水浴25min，冷卻至室溫測(cè)OD650無(wú)機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)液作標(biāo)準(zhǔn)曲線（3）核酸含量的計(jì)算一般DNA含磷9.5％,RNA含磷9.2％，RNA量＝（總磷量－無(wú)機(jī)磷量）×10.9DNA量＝（總磷量－無(wú)機(jī)磷量）×10.5三核酸的化學(xué)檢測(cè)根據(jù)核酸所含的磷及戊糖的化學(xué)性質(zhì)，可用定磷1022二苯胺法測(cè)定DNA含量DNA中的2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)，在595nm處有最大吸收峰。在40～400μg范圍內(nèi)，OD595與DNA濃度成正比。少量乙醛可提高反應(yīng)靈敏度。（1）二苯胺試劑的配制（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作（3）樣品DNA含量測(cè)定2二苯胺法測(cè)定DNA含量DNA中的2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中1033地衣酚法測(cè)定RNA含量核糖核酸在濃鹽酸和三氯化鐵的存在下，與3，5－二羥甲苯（地衣酚）反應(yīng)，生成綠色物質(zhì)。一定濃度范圍內(nèi)，OD670與RNA濃度成正比。所有戊糖均可進(jìn)行此反應(yīng)，注意干擾（如DNA）。操作：地衣酚試劑配制；標(biāo)準(zhǔn)曲線制作；樣品RNA測(cè)定3地衣酚法測(cè)定RNA含量核糖核酸在濃鹽酸和三氯化鐵的存在下104思考題1如何區(qū)別還原糖與非還原糖？舉出常見(jiàn)的還原糖與非還原糖。2有哪些定糖方法？熟悉各種方法的原理，所用試劑和操作要點(diǎn)。3如何測(cè)定薯類淀粉含量？4蛋白質(zhì)含量測(cè)定有哪些方法？熟悉各種方法的原理，所用試劑和操作要點(diǎn)。5如何用滴定法測(cè)定氨基酸含量？7如何用定磷法測(cè)定DNA或RNA含量？8二苯胺測(cè)定DNA和地衣酚測(cè)定RNA原理？9三瓶未知液分別為蛋白質(zhì)、糖和RNA，如何鑒定？思考題1如何區(qū)別還原糖與非還原糖？舉出常見(jiàn)的還原糖與非還原105生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件106生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件107生化分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件1082碘量法I2→NaIO(氧化劑），其氧化能力較弱，僅適用于醛糖的測(cè)定，與酮糖不起反應(yīng)操作要點(diǎn)：（1）標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉溶液配制，0.05mol/L，沸騰后冷卻水配制，存放在棕色瓶中，一周后用標(biāo)準(zhǔn)重鉻酸鉀標(biāo)定。（2）標(biāo)準(zhǔn)碘液配制，0.1mol/L（3）空白滴定：空白液，用硫代硫酸鈉滴定試劑中全部碘2碘量法I2→NaIO(氧化劑），其氧化能力較弱，僅適用109碘量瓶中，10mL0.1mol/L碘液＋15mL0.1mol/LNaOH＋5mL空白液，搖勻后暗反應(yīng)15min＋1mL1mol/L硫酸溶液，用0.05mol/L硫代硫酸鈉滴定至淺黃色，加0.2mL0.5％淀粉液作指示劑，滴定至藍(lán)色消失，記錄V0(4)樣品滴定：以5mL樣品液代