DB51∕T 2906-2022 豬蓋塔病毒分離與鑒定技術(shù)規(guī)范

ICS11.220CCSICS11.220CCSB41四 川 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB51/T2906—2022豬蓋塔病毒分離與鑒定技術(shù)規(guī)范Technicalspecificationforisolationandidentificationofswinegaetavirus2022-05-20發(fā)布 2022-07-01實(shí)施四川省市場(chǎng)監(jiān)督管理局 發(fā)布DB51/T2906DB51/T2906—2022標(biāo)準(zhǔn)下載目 次前言 II112范引文件 13語(yǔ)定義 14略語(yǔ) 15劑設(shè)備 15.1主試劑 15.2主儀設(shè)備 26品采、存輸 2豬臨發(fā)特征 2臨樣的集 2保與輸 27毒細(xì)分培養(yǎng) 2生安措施 2樣的理 2單細(xì)制備 27.4接細(xì)胞 27.5病收獲 38毒酸RT-PCR鑒定 3核提和轉(zhuǎn)錄 3RT-PCR39果定 49.1RT-PCR 49.2病分鑒定 4附錄A（范）試配制 5附錄B（料）豬蓋塔毒CAP因增列 6I前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由四川省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出、歸口并解釋。本文件主要起草單位：四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)。本文件主要起草人：陳斌、朱玲、鐘攀、陳弟詩(shī)、周明忠、徐志文、鄧飛、邵靚、李麗、周莉媛、張睿、謝嘉賓、王英、文豪、徐凱、黃先奇、陳亮、張國(guó)華、李莎莎、吉色曲伍、孫賢剛、江朝源。本文件首次發(fā)布。II豬蓋塔病毒分離與鑒定技術(shù)規(guī)范范圍本文件規(guī)定了豬源蓋塔病毒分離與鑒定方法。本文件適用于豬及其產(chǎn)品中蓋塔病毒病原分離和鑒定、實(shí)驗(yàn)室診斷、監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。（GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣本采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義?？s略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。BHK-21：乳倉(cāng)鼠腎源細(xì)胞CPE：細(xì)胞病變DMEM：細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液DNAmarker：DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記FBS：胎牛血清GETV：蓋塔病毒HEPES：4-羥乙基哌嗪乙磺酸PBS：磷酸緩沖液RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)GB/T6682BHK-21、DMEMFBS、HEPES1mol/L0.01mol/LpH7.0~7.4PBS(參A)；RNAPCR（2×）。1微量可調(diào)移液器、二氧化碳恒溫箱、組織破碎儀、高速離心機(jī)、PCR儀、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽、凝膠成像儀、倒置生物顯微鏡。，10采取疑似豬蓋塔病毒感染的淋巴結(jié)、胎盤、羊水、死胎、肺、肝、腎、小腦等靶組織約2g~5g或血液樣品1mL~2mL，組織裝入無(wú)菌自封樣品袋或離心管，血液裝入抗凝血管中待檢。采集的樣品應(yīng)按照NY/T541（2℃~824h24h20℃GETV分離鑒定時(shí)，應(yīng)在高等級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室操作，按照GB19489（所有部分）的規(guī)定執(zhí)行。取0.5g~11mL~1.5mLPBSDMEM作3:1（V/W）稀釋。反復(fù)凍融3次后，43000r/min離心10min，取上清液，以0.22μm1.5mL70DMEM作3次后，3000r/min10minμm1.5mL，-70℃按常規(guī)法將BHK-21細(xì)胞分裝在25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶分裝含8%FBS的DMEM培養(yǎng)基5mL，細(xì)胞濃度應(yīng)為2×105個(gè)/mL~3×105個(gè)/mL，培養(yǎng)48h。20.2mLBHK-21（5mL2瓶~42~4瓶。37吸附1h，2ml含2%FBS的DMEM37℃、CO248hCPE12h~48hCPE，感染BHK-2112hCPE4℃3000r/min10min，收獲701代72hCPE1mL/4mL培養(yǎng)12h~48h3RT-PCR采用RNA/cDNA，于-20RT-PCR引物引物針對(duì)GETVCAP基因保守區(qū)域。上游引物（10μmol/L）：5’-ACCGAAGAAGCCGAAGAA-3’；下游引物（10μmol/L）：5’-GCACTCRAGGTCATACTTG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為316bp。反應(yīng)體系見(jiàn)表1，反應(yīng)體系可根據(jù)表中各組分比例適當(dāng)調(diào)整。表1 RT-PCR應(yīng)系PCR反應(yīng)試劑體積(μL)2×TaqPCRmasterMix5上游引物（10μmol/L）0.5下游引物（10μmol/L）0.5cDNA模板1ddH2O3反應(yīng)程序見(jiàn)表2。表2 RT-PCR應(yīng)序步驟時(shí)間和溫度循環(huán)數(shù)（個(gè)）預(yù)變性5min、95℃1變性30s、95℃35退火30s、56℃延伸30s、72℃延伸7min、72℃13取適量擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像儀中觀察結(jié)果。RT-PCR示例1：陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)大小為316bp的特異性擴(kuò)增條帶，陰性對(duì)照無(wú)條帶，說(shuō)明對(duì)照成立。若樣品電泳結(jié)果出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照大小一致的特異性擴(kuò)增條帶，則判定為GETV核酸陽(yáng)性；若樣品電泳結(jié)果未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，則判定為GETV核酸陰性。B.1CPEGETVRT-PCRGETV3CPE5GETV為陰性，則判定為GETV3CPEGETV4附錄A（A.1 0.01mol/LpH7.0-7.4PBSNaCl8gKCl0.2gNa2HPO4?12H2O3.58gKH2PO40.27g滅菌雙蒸水800mLNaOH或者HCl調(diào)pH值7.0至7.4，滅菌雙蒸水定容至1000mL,121℃、15min高壓鍋滅菌冷卻，置常溫或4℃?zhèn)溆谩AE（50三羥甲基甲烷堿（Trisbase）242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L（pH8.0）乙二胺四乙酸（EDTA）100mL蒸餾水100mL待上述混合物完全溶解后，加蒸餾水至1000mL，置4℃冰箱中備用，如配制1%的瓊脂糖凝膠和用作電泳緩沖液，則用蒸餾水稀釋50倍，成TAE電泳緩沖液。1.0瓊脂糖1.0g1×TAE緩沖液100mL0.5ug/mL溴化乙錠5uL0.5mm4mm5附錄B（資料性）豬源蓋塔病毒CAP基因擴(kuò)增序列B.1 CAPACCGAAGAAGCCGAAGAAAAAGCCGCAAAAAGCGAAGGCTAAGAAAAACGAACAGCAAAAGAAGAACGAGAACAAGAAACCACCACCTAAGCAGAAGAACCCGGCTAAGAAGAAGAAACCAGGAAAAAGGGAACGCAT