果蔬中脂氧合酶活性的測定

果蔬中脂氧合酶活性的測定一、目的要求了解脂氧合酶的作用，掌握果蔬組織中脂氧合酶活性的測定方法。二、基本原理脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）是一種含非血紅素鐵的蛋白質，專一催化具有順、順-1,4-戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸的加氧反應，生成具有共軛雙鍵的過氧化物。LOX在植物中普遍存在，其作用的底物主要為來自細胞質膜的多元不飽和脂肪酸如亞油酸、甲基亞油酸、亞麻酸及花生四烯酸等。LOX與果蔬細胞脂質過氧化作用、后熟衰老過程的啟動和逆境脅迫、傷誘導、病原侵染信號的產生和識別等關系密切，被認為是引起果蔬后熟衰老的一類重要的酶。LOX能催化含有順、順-1,4-戊二烯結構的多不飽和脂肪酸的加合氧分子反應，生成的初期產物具有共軛二烯結構，產物中的共軛雙鍵在波長234nm處具有特征吸收。因此，利用分光光度計法可以測定LOX酶活性大小。三、材料、儀器及試劑（一）材料芒果、番茄、桃、獼猴桃等。（二）儀器及用具研缽、高速冷凍離心機、移液器、離心管、紫外分光光度計、容量瓶（100mL、1000mL）、試管、計時器。（三）試劑1．亞油酸鈉溶液方法一：稱取亞油酸鈉（Sigma產品），直接配制100mmol/L亞油酸鈉溶液。方法二：取0.5mL亞油酸（化學純），加入到10mL蒸餾水中，再加入0.25mLTween-20，搖勻。再逐滴滴加1mol/LNaOH，搖動至溶液變得清亮。然后用蒸餾水稀釋至100mL，即為0.5%亞油酸溶液。2．100mmol/L、pH6.8磷酸鈉緩沖液母液A（200mmol/LNa2HPO4溶液）：稱取35.61gNa2HPO4·2H2O或53.65gNa2HPO4·7H2O或71.64gNa2HPO4·12H2O，用蒸餾水溶解，定容至1000mL。母液B（200mmol/LNaH2PO4溶液）：稱取27.6gNaH2PO4·H2O或31.2gNaH2PO4·2H2O用蒸餾水溶解，定容至1000mL。取49.0mL母液A和51.0mL母液B混合后，調節(jié)pH至6.8，稀釋、定容至200mL。3．提取緩沖液（含1%TritonX-100和4%PVPP）取1mLTritonX-100和4gPVPP，加入到100mL100mmol/L、pH6.8磷酸鈉緩沖液中，搖勻，置于4℃冰箱預冷。4．100mmol/L、pH5.5醋酸緩沖液母液A（200mmol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸餾水稀釋至1000mL。母液B（200mmol/L醋酸鈉溶液）：稱取16.4g無水醋酸鈉（或稱取27.2g三水合乙酸鈉），用蒸餾水溶解、定容至1000mL。取68mL母液A和432mL母液B混合后，調節(jié)pH至5.5，加蒸餾水稀釋至1000mL。四、實驗步驟（一）酶液提取稱取5.0g果蔬組織置于研缽內，加入5.0mL經4℃預冷的提取緩沖液，在冰浴條件下研磨勻漿，然后轉入離心管于4℃、12000×g離心30min，收集上清夜用于LOX活性測定。（二）活性測定方法一：取2.75mL100mmol/L、pH5.5醋酸緩沖液，加入50μL100mmol/L亞油酸鈉，在30℃保溫10min，加入200μL粗酶液，混勻。以蒸餾水為參比調零，在反應15s時開始記錄反應體系在波長234nm處吸光度值為初始值，然后每隔30s記錄一次，連續(xù)測定，至少獲取6個點的數據。重復三次。方法二：取2.7mL50mmol/L、pH6.8磷酸緩沖液，加入100μL0.5%亞油酸溶液，在30℃保溫10min，再加入200μL粗酶液，混勻，按照上述方法測定混合液在234nm處吸光度值。五、實驗結果與計算1．將測定的數據填入下表重復次數樣品重量W(g)提取液體積V(mL)吸取樣品液體積Vs(mL)234nm吸光度值樣品中LOX活性(0.01△OD234·min-1·g-1FW)OD0OD1OD2OD3OD4OD5△OD計算值平均值±標準偏差1232．計算結果記錄反應體系在234nm處的吸光度值，制作OD234值隨時間變化曲線，根據曲線的初始線性部分計算每分鐘吸光度變化值△OD234。然后，以每克鮮重（FW）果蔬樣品每分鐘吸光度變化值增加0.01時為1個LOX活性單位（U），則U=0.01△OD234·min-1·g-1FW。計算公式：式中：△OD234——反應混合液的吸光度變化值；△t——酶促反應時間，min；V——樣品提取液總體積，mL；Vs——測定時所取樣品提取液體積，mL；W——樣品重量，g。脂氧合酶活性還可以每分鐘反應體系在波長234nm處吸光度值變化增加0.01時所需的