異檸檬酸裂解酶（ICL）活性檢測試劑盒說明書-微量法UPLC-MS-5074

電話：400-998-2324郵箱：service_uplc_ms@163.com網(wǎng)址：本產(chǎn)品僅供科學(xué)研究使用！請勿用于臨床、診斷、食品、化妝品檢測等用途！-上海液質(zhì)檢測技術(shù)有限公司第第頁異檸檬酸裂解酶（ICL）活性檢測試劑盒說明書注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。貨號：UPLC-MS-5074規(guī)格：100T/96S產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系工作人員。

微量法試劑名稱規(guī)格保存條件提取液液體110mL×1瓶4℃保存試劑一液體5mL×1瓶4℃保存試劑二液體4mL×1瓶4℃保存試劑三粉劑×2瓶-20℃保存試劑四粉劑×2瓶-20℃保存試劑五液體40μL×1支4℃保存試劑六液體5mL×1瓶4℃保存試劑七粉劑×1支4℃保存溶液的配制：1、提取液：臨用前將試劑七加入到提取液中，勿放于-20℃；22.5mL-20℃2融；35mL-20℃24、試劑五：使用前需先離心。根據(jù)用量按照試劑五:蒸餾水為1:8的體積比例充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配；5、工作液配制：按試劑一：試劑二：試劑三：試劑四：試劑五=29:35:42:42:3的比例將各試劑混合后備用（共151μL，1T的量），根據(jù)樣本數(shù)量現(xiàn)用現(xiàn)配。產(chǎn)品說明：ICL（EC）主要存在于植物和微生物中，油料作物種子在萌發(fā)過程中，通過乙醛酸循環(huán)及其他過程將脂肪轉(zhuǎn)變成碳水化合物。ICL是乙醛酸循環(huán)的關(guān)鍵酶之一。ICL催化異檸檬酸降解為乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在340nm下有特征吸收峰，監(jiān)測340nm吸光度的減小速率可間接反應(yīng)ICL活性。注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。需自備的儀器和用品：紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。操作步驟：一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）15001mL（200W31030次15000g420置冰上待測。20.1g1mL提取液進行冰浴勻漿；15000g，4℃20冰上待測。二、測定步驟紫外分光光度計/酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。樣本測定試劑測定管工作液（μL）151樣本（μL）7試劑六（μL）42將上述試劑按順序加入微量石英比色皿/96UV340nmA137℃（哺乳動物）25℃（其它物種）2分鐘（37℃或迅速取出比色皿并擦干，340nm210A2ΔA=A1-A2。三、ICL活性計算用微量石英比色皿測定的計算公式如下1、組織中ICL活力的計算：按樣本蛋白濃度計算：單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。ICL（U/mgprot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷(V樣本×Cpr)÷T=2297×ΔA÷Cpr按樣本質(zhì)量計算：單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。ICL（U/g質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷(W÷V提取×V樣本)÷T=2297×ΔA÷WV反應(yīng)時間，2min；109：單位換算系數(shù)，1mol=109nmol。2、細菌或培養(yǎng)細胞中ICL活力的計算：按樣本蛋白濃度計算：單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。ICL（U/mgprot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷(V樣本×Cpr)÷T=2297×ΔA÷Cpr按細菌或細胞數(shù)量計算：單位的定義：每1萬個細菌或細胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。ICL（U/104cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷(500÷V提取×V樣本)÷T=4.59×ΔAVd：微量石英比色皿光徑，1cm；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；V提?。杭尤胩崛∫后w積，1mL；500：細菌或細胞數(shù)量，500萬；T：反應(yīng)時間，2min；109：單位換算系數(shù)，1mol=109nmol。用96孔板測定的計算公式如下1、組織中ICL活力的計算：按樣本蛋白濃度計算：單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。ICL（U/mgprot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷(V樣本×Cpr)÷T=3828×ΔA÷Cpr按樣本質(zhì)量計算：單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。ICL（U/g質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷(W÷V提取×V樣本)÷T=3828×ΔA÷WV孔UV反應(yīng)時間，2min；109：單位換算系數(shù)，1mol=109nmol。2、細菌或培養(yǎng)細胞中ICL活力的計算：按樣本蛋白濃度計算：單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。ICL（U/mgprot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷(V樣本×Cpr)÷T=3828×ΔA÷Cpr按細菌或細胞數(shù)量計算：單位的定義：每1萬個細菌或細胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。ICL（U/104cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷(500÷V提取