基因工程在生物肥料上的開發(fā)利用

基因論文題目：基因工程在生物肥料上的開發(fā)利用學(xué)生姓名：學(xué)號：專業(yè)年級：生物技術(shù)2010級所在學(xué)院：基因工程在生物肥料上的開發(fā)應(yīng)用xxx（xxx學(xué)院，xx，xxxx）摘要在當(dāng)今世界世界人口的不斷增長,自然資源的耗減和環(huán)境污染等問題的頻頻出現(xiàn)促使人們把追求人與自然和諧相處推上當(dāng)今社會發(fā)展主要的位置，現(xiàn)今，低碳環(huán)保型生活是廣大群眾所競相追逐的的潮流，而且生態(tài)文明建設(shè)也已經(jīng)成為全球性的時代的潮流?，F(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)應(yīng)用過程中出現(xiàn)的一些生態(tài)問題對農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展已構(gòu)成嚴重威脅[1]。對于建立綠色環(huán)保型生態(tài)農(nóng)業(yè)也日趨重要。綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)模式既適應(yīng)了社會發(fā)展和人類文明進步的要求，同時也為微生物肥料提供了廣闊的發(fā)展空間，實踐也證明生物肥料在土壤肥力的提高與保持、營養(yǎng)元素的轉(zhuǎn)化、提高化肥利用率、促進作物生長、拮抗土傳病害，環(huán)境凈化與生態(tài)系統(tǒng)的平衡等方面起著重要的作用。而且,生物肥料在環(huán)境保護及產(chǎn)量方面,并不低于化肥。因此生物肥料在綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、資源節(jié)約和環(huán)境友好型社會建設(shè)中將發(fā)揮越來越重要的作用，市場潛力巨大，研究和開發(fā)微生物肥料具有重要的經(jīng)濟、社會和環(huán)境效益。目前，我國微生物肥料生產(chǎn)的發(fā)展機遇是前所未有的。生物肥料也會在未來的中國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中起到不可替代的作用。關(guān)鍵詞:微生物肥料;生態(tài)文明;可持續(xù)發(fā)展1生物肥料的簡介生物肥料是指一類含有活微生物的特定制劑，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，能夠獲得特定的肥料效應(yīng)。由于生物肥料在培肥地力，提高化肥利用率，抑制農(nóng)作物對硝態(tài)氮、重金屬、農(nóng)藥的吸收，凈化和修復(fù)土壤，降低農(nóng)作物病害發(fā)生，促進農(nóng)作物秸稈和城市垃圾的腐熟利用，保護環(huán)境以及提高農(nóng)作物產(chǎn)品品質(zhì)和食品安全等方面表現(xiàn)出不可替代的作用，發(fā)展前景良好。目前，生物肥料可分為兩類：一類是狹義的生物肥料，是指含有特定微生物活體的制品，一般應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，通過其中所含微生物的生命活動，增加植物養(yǎng)分的供應(yīng)量或促進植物生長，提高產(chǎn)量，改變農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)及農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境；另一類則是廣義的生物肥料，是指通過其中的微生物的生命活動，不但能提高植物營養(yǎng)元素的供應(yīng)量，還能產(chǎn)生植物生長激素，促進植物對營養(yǎng)元素的吸收利用或有拮抗某些病原微生物的致病作用，減輕農(nóng)作物病蟲害而促進作物產(chǎn)量的增加。生物肥料的種類很多，現(xiàn)在推廣應(yīng)用的主要有根瘤菌類肥料、固氮菌類肥料、解磷解鉀菌類肥料、抗生菌類肥料和真菌類肥料等等[2]。2與生物肥料相關(guān)微生物目前，自然界中可進行生物固氮的微生物種屬范圍分布較廣，按其固氮方式主要可分成自生固氮、共生固氮和聯(lián)合固氮微生物3種：⑴自生固氮微生物，能獨立固氮，主要分布于細菌和藍細菌的不同科、屬及生理群中，如紅螺菌、紅硫細菌、綠硫細菌和梭狀芽胞桿菌等都是自生固氮菌，利用光能或化能固定氮素；⑵共生固氮微生物，主要通過與宿主植物形成共生固氮體系，進行生物固氮，根據(jù)固氮微生物的寄主植物類型又分為與豆科植物共生和非豆科植物共生2種；⑶聯(lián)合固氮微生物，主要是聚集在根表或通過植物根部傷口定植到根內(nèi)，不形成根瘤狀特異化結(jié)構(gòu)的一種特殊共生固氮體系，其中聯(lián)合固氮微生物以根際分泌物為碳源和能源，而植物則得到固氮菌固定的氮及分泌的生物活性物質(zhì)[3]。3生物肥料的主要作用目前社會上對生物肥料的看法存在一定的誤解或偏見。有看法認為,生物肥料的肥效很高，把它當(dāng)成萬能肥料，甚至認為可以取代化肥,有看法則認為菌肥根本無效，或者與復(fù)合化肥中營養(yǎng)元素相比，認為其養(yǎng)分不足。合理使用生物肥料既可以補充化肥的不足，又可以減少環(huán)境污染和保護生態(tài)環(huán)境。生物肥料的作用是多方面的。它可以作為綠色農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)的肥料、土壤凈化劑、土壤改良劑,不僅能提高土壤肥力,還可促進土壤的良性循環(huán);此外,生物肥料的施用可以提高化肥利用率,對減少經(jīng)濟浪費和保護環(huán)境起到一定的作用。生物肥料的重要作用如下：⑴生物固氮微肥中的根瘤菌、固氮菌等微生物能將空氣中的氮固定并轉(zhuǎn)化供農(nóng)作物吸收利用。據(jù)統(tǒng)計，固氮菌每667m2能固定45kg氮，全世界每年生物固氮總量約為13t，因此，開發(fā)利用生物固氮是低成本制造氮肥的重要途徑。⑵降低環(huán)境污染、提高產(chǎn)品品質(zhì)微生物肥料中含多種解磷、鉀微生物，如芽抱桿菌、假單胞菌，它們可以將土壤中的難溶的有機或無機磷或鉀分解為植物可以吸收利用的可溶性磷、鉀，從而提高了土壤的肥力和肥料的利用率，使農(nóng)作物的安全性提高，環(huán)境得到保護。⑶促進農(nóng)作物生長一些微生物細菌在生長繁殖過程中可產(chǎn)生大量的各類植物生長激素，能夠調(diào)節(jié)植物的生長，部分激素還能打破種子休眠，促進生根、發(fā)芽，使作物提前成熟，這些特點都是化肥所不具備的。⑷抗病、抗旱，增產(chǎn)增收施用微生物肥料后，在植物根基區(qū)，有益細菌形成優(yōu)勢群體，抑制病原微生物的人侵，提高植株的抗病能力;同時，合理施用微生物肥料會改善土壤結(jié)構(gòu)，減少板結(jié)，增強土壤肥力，增產(chǎn)增收[4]。⑸提高化肥利用率微生物肥料與化肥混合施用,既可增產(chǎn)又減少化肥用量,降低成本,亦可改善土壤及農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì),減少污染,發(fā)展綠色食品。中國綠色食品發(fā)展中心已將微生物肥料列入生產(chǎn)綠色食品允許使用的肥料。⑹改良土壤生物肥料中有益微生物能產(chǎn)生糖類物質(zhì)與植物粘液、礦物膠體和有機膠體結(jié)合在一起,可以改善土壤團粒結(jié)構(gòu),提高土壤肥力,增強土壤物理性能和減少土壤顆粒損失,在一定條件下還能參與腐殖質(zhì)形成,增進腐殖酸含量,改善土壤腐殖酸的品質(zhì),減少環(huán)境污染[5]。4生物肥料的應(yīng)用前景生物肥料可以節(jié)約能源，降低生產(chǎn)成本，且其不僅用量少，而且本身具有無毒無害，沒有環(huán)境污染的特點，而且生物肥料在作物增產(chǎn)和品質(zhì)改善等方面具有重要的積極作用，故其擁有廣闊的前景，具體如下：⑴適用品種多，市場需量大適宜施用微生物肥料的作物種類繁多，各種豆科作物、糧食作物、蔬菜瓜果等都可以應(yīng)用微生物肥料提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)。據(jù)不完全，我國目前微生物肥料年產(chǎn)量在10萬~40萬t，與同期化肥相比，微不足道，微生物肥料市場容量是相當(dāng)大的。⑵生產(chǎn)成本低，應(yīng)用效果好化肥生產(chǎn)成本的提高，價格上漲幅度過快，令廣大農(nóng)民難以接受，且效果差，污染環(huán)境。微生物肥料以生物固氮為例，它可以持續(xù)不斷供應(yīng)氮素營養(yǎng)，并且能夠減少環(huán)境污染和溫室效應(yīng)，污染少，成本低。⑶生產(chǎn)無公害綠色食品，減少環(huán)境污染的需要隨著綠色農(nóng)業(yè)(生態(tài)農(nóng)業(yè))的發(fā)展，生產(chǎn)安全、無公害的綠色食品已成為一個發(fā)展趨勢。并且由于大量使用化肥，土壤性質(zhì)惡化，土壤質(zhì)量下降，地下水污染等問題日益突出；消納城市廢棄物的壓力愈來愈大，因此，無污染的微生物肥料的綜合利用和開發(fā)顯示出它的應(yīng)用優(yōu)勢和良好發(fā)展前景。⑷通過篩選優(yōu)良菌種、改進生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)設(shè)備為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的微生物肥料創(chuàng)造了條件，而且基因工程新菌株的出現(xiàn)使微生物肥料的廣泛應(yīng)用成為可能。近年來興起的植物根際促生細菌(PGPR)的研究和開發(fā)，更為微生物肥料的應(yīng)用開辟了廣闊前景[6-8]。5基因工程對生物肥料菌株的改造5.1材料和方法5.1.1供試菌株快生型大豆根瘤菌15067、土著大豆根瘤菌、大腸桿菌(E.coli)DH5α5.1.2質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體pTR102、質(zhì)粒載體pUC19(含有l(wèi)ac啟動子)、質(zhì)粒載體pET-28a、輔助質(zhì)粒pRK2073。5.1.3nifA基因的克隆以快生型大豆根瘤菌15067的基因組DNA為模板,采用同源序列克隆法,設(shè)計nifA基因全長的特異性引物(P1,P2),采用PCR方法,擴增目的基因nifA基因全長。對回收的DNA片段進行純化,并進行連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中,采用PCR方法進行簽定,將陽性克隆測序。5.1.4表達載體pTR-Plac-nifA的構(gòu)建將nifA基因全長連入質(zhì)粒載體pUC19中l(wèi)ac啟動子下游,構(gòu)建重組載體pUC19-nifA;設(shè)計引物(P3,P4),PCR擴增帶有l(wèi)ac啟動子的nifA基因(Plac-nifA)片段。將其連入pET-28a多克隆位點處,構(gòu)建重組載體pET-28a-Plac-nifA;設(shè)計引物(P5,P6),PCR擴增帶有l(wèi)ac啟動子的nifA基因以及T7終止子(Plac-nifA-T7)片段,并將該片段連到luxAB基因標(biāo)記的質(zhì)粒載體pTR102,構(gòu)建表達載體pTR-Plac-nifA。5.1.5大豆根瘤菌基因工程菌株的構(gòu)建采用三親本雜交的方法,將表達載體pTR102-Plac-nifA轉(zhuǎn)化土著大豆根瘤菌。由于重組載體pTR-Plac-nifA上含有發(fā)光酶基因luxAB,利用癸醛對培養(yǎng)的平板中的大豆根瘤菌轉(zhuǎn)移接合子進行發(fā)光性檢測,并用X光片進行結(jié)果記錄[9]。5.2討論目前在根瘤菌中已發(fā)現(xiàn)三類固氮基因:結(jié)瘤基因(nod)、固氮基因(nif)和共生固氮基因(fix)。對根瘤菌中的這三個基因加以改造可以提高固氮能力。也可以通過加入某些促進因子是固氮基因能夠高效率表達，增加固氮效率。土著根瘤菌的固氮能力較低,根瘤菌的固氮過程主要由nif基因簇控制,其中nifA基因是最重要的正調(diào)節(jié)基因,對根瘤菌的固氮和結(jié)瘤生理過程起著決定性的作用。利用基因工程方法構(gòu)建重組根瘤菌菌株主要路線有兩條:一是提高根瘤菌的固氮效率;二是增強根瘤菌的強競爭結(jié)瘤能力。上述研究采用分子生物學(xué)及基因工程手段增加nifA基因的額外拷貝數(shù),構(gòu)建高效固氮根瘤菌工程菌株,該菌與豆科植物共生,在根部形成根瘤,可以為植物提供生長所需要的部分氮素,提高大豆植株的固氮結(jié)瘤能力,同時nifA基因誘導(dǎo)宿主防衛(wèi)反應(yīng)基因的表達[10-12]。同時在構(gòu)建載體中引入luxAB標(biāo)記基因,該基因具有簡便、快速、準(zhǔn)確、直觀的特點,可顯著提高重組子篩選的效率及根瘤檢測的準(zhǔn)確性。為了生產(chǎn)無污染的綠色農(nóng)產(chǎn)品,構(gòu)建既能利用大氣中的有效資源,又能抗病的基因工程菌株,既降低了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本,又減輕了環(huán)境污染,也促進了生態(tài)平衡,有利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,這將成為今后生物固氮研究領(lǐng)域中的發(fā)展方向和追求目標(biāo)。氮素營養(yǎng)對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的決定性作用眾所周知,在我國農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中氮素限制普遍存在,但同時氮肥浪費造成的污染卻在不斷加劇,因此共生固氮在提供氮素、減少污染及受損生態(tài)系統(tǒng)功能恢復(fù)中的作用將會更加引人注目,今后的理論研究應(yīng)集中在以下方面:①共生固氮植物對生態(tài)系統(tǒng)中植被格局、地上和地下生態(tài)過程的作用,影響共生固氮速率的因素極其生態(tài)學(xué)機制;②對豆科植物及其根瘤菌的遺傳結(jié)構(gòu)改造,提高豆科植物共生固氮體系的抗逆能力,選育和培育高效、抗逆性和適應(yīng)性強的共生體系③豆科植物細胞中特異的結(jié)瘤信號傳導(dǎo)通路嫁接到其他非豆科植物根瘤菌生長信號通路上,在非豆科植物特別是主要農(nóng)作物中構(gòu)建共生固氮體系,打破根瘤菌的宿主專一性,以實現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[13]。而且目前也存在著基因工程安全性問題，要在建立嚴格的篩選體系，篩選出目標(biāo)效能穩(wěn)定抗逆性好的菌株。而且通過基因工程的技術(shù)手段構(gòu)建的基因工程菌株一定要符合安全性要求，以免造成生態(tài)入侵等嚴重的生態(tài)危機。在基因工程后期生產(chǎn)中要提高生產(chǎn)工藝，確保產(chǎn)品質(zhì)量。生物肥料的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也有待于進一步完善。參考文獻[1]孟瑤,徐鳳花,孟慶有,顧萬榮.中國微生物肥料研究及應(yīng)用進展[J].土壤肥料科學(xué),2008,24（6）:276-283.[2]張彥，孫磊，盧麗娜.微生物肥料在綠色農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用.第三屆微生物資源學(xué)術(shù)暨國家微生物資源平臺運行服務(wù)研討會會議論文摘要.[3]何元勝,胡曉峰,岳寧,周佳,陳俊秋,弓新國.微生物肥料的作用機理及其應(yīng)用前景[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,13-16.[4]張強,秦濤,張紅艷,阮祥穩(wěn).微生物肥料的研究應(yīng)用進展[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,42（增）:159-160.[5]葉光祎,劉友林,尹增松.微生物肥料發(fā)展?fàn)顩r及前景[J].云南農(nóng)業(yè),1999,7;22.[6]趙娟娟.微生物肥料的作用及應(yīng)用前景[J].土肥水利,46.[7]袁田,熊格生,劉志,賀利熊.微生物肥料的研究進展[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,（7）:44-47[8]盛玉婷.微生物肥料的發(fā)展現(xiàn)狀及前景[J].安徽農(nóng)學(xué)通報,2008,14(11):80-81.[9]李海英,張喜波,劉金玲,于海鵬,楊樂,蒙明明,賈珊珊.導(dǎo)入額外拷貝nifA基因的大豆根瘤菌工程菌株的構(gòu)建[J].黑龍江大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報,2010,27