第十三章遺傳重組方式和轉(zhuǎn)座子的遺傳分課件

第十三章

遺傳重組方式和轉(zhuǎn)座子的遺傳分析教師：張光祥Email:zhgx-163@163.com生物的遺傳重組概述同源性重組位點(diǎn)特異性重組轉(zhuǎn)座因子及其遺傳效應(yīng)拷貝選擇的重組方式簡(jiǎn)介第十三章

遺傳重組方式和轉(zhuǎn)座子的遺傳分析教師：張光祥生物的遺1第一節(jié)、生物的遺傳重組概述一、遺傳重組的定義、類(lèi)型1、定義：遺傳重組就是已有基因的重新組合或洗牌,其本質(zhì)就是DNA分子的重新組合、DNA序列的替換和拼接。2、自發(fā)的遺傳重組包括五種類(lèi)型：自由組合：不同染色體上的基因之間的重新組合;同源重組：連鎖遺傳中講到的染色體交換;位點(diǎn)特異性重組：依靠一小段特定序列和特定的酶系統(tǒng)進(jìn)行整合(插入)和切出(環(huán)出)過(guò)程。轉(zhuǎn)座：不依賴于同源序列，而是借助于特定重復(fù)序列形成的DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，在轉(zhuǎn)座酶的參與下通過(guò)DNA鏈的切割與重新連接，以此實(shí)現(xiàn)DNA片斷的位置轉(zhuǎn)移；拷貝選擇:病毒在以RNA為模板合成DNA時(shí),如果模板鏈與其它RNA單鏈分子有局部靠近,DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）具有從一條模板鏈轉(zhuǎn)換到另一條鏈上并在新的模板鏈上繼續(xù)轉(zhuǎn)錄合成DNA的能力。由此可從病毒的兩種變體RNA序列產(chǎn)生一個(gè)新的病毒變體。第一節(jié)、生物的遺傳重組概述一、遺傳重組的定義、類(lèi)型1、定義：2自由組合和同源重組主要通過(guò)有性生殖實(shí)現(xiàn)。有性生殖和無(wú)性繁殖兩種方式，哪一種對(duì)生物更有利？3、遺傳重組與有性生殖的關(guān)系英國(guó)羅斯林研究所1997年2月22日宣布用體細(xì)胞克隆綿羊獲得成功，克隆綿羊“多利”成為動(dòng)物界最耀眼的“明星”，在世界上引起巨大震動(dòng)；美國(guó)Clonaid公司02年12月26日宣布，人類(lèi)首個(gè)克隆嬰兒于當(dāng)晚降生，引起世界范圍的極大關(guān)注和對(duì)克隆人的激烈爭(zhēng)論。有兩個(gè)理由讓物種應(yīng)該青睞無(wú)性生殖。首先，在為資源進(jìn)行的斗爭(zhēng)中，無(wú)性生殖物種能輕易地戰(zhàn)勝有性生殖物種。其次,精子和卵子僅包含了雙親各方一半的基因,有性生殖的生物個(gè)體只能將自身50%的基因傳遞給下一代。無(wú)性生殖卻可達(dá)到100%的傳遞率。一個(gè)自稱“無(wú)性族”(asexual)追風(fēng)族群悄然出現(xiàn),討論無(wú)性生活的網(wǎng)站也急劇增加,在歐美日一度成為時(shí)常。然而，有性生殖的最大優(yōu)越性就是基因重組。自由組合和同源重組主要通過(guò)有性生殖實(shí)現(xiàn)。有性生殖和無(wú)性繁殖兩3二、基因重組的生物學(xué)意義如果沒(méi)有遺傳重組,每個(gè)染色體中的基因都會(huì)永遠(yuǎn)固定在一起同生死、共命運(yùn)。然而,基因突變總是不可避免的,且一般是有害的,遲早會(huì)有一些突變基因是害群之馬,使整個(gè)染色體都不能傳遞下去。即使突變基因的有害程度有限,久而久之也會(huì)量變到質(zhì)變,危及到個(gè)體的生存與繁殖能力?；蛑亟M意義可歸結(jié)到一個(gè)“變”字,具體有三條:1、打破連鎖：能夠使有害突變與緊密連鎖的有利突變或重要基因分開(kāi)，從而提供了淘汰有害突變和不良基因、積累有利基因的機(jī)會(huì)。二、基因重組的生物學(xué)意義如果沒(méi)有遺傳重組,每個(gè)染色體中的基因42、保持和發(fā)揮種群內(nèi)遺傳多樣性遺傳多樣性使得種群內(nèi)具有各種各樣的個(gè)體特征特性，但總體來(lái)說(shuō)都是與其生態(tài)環(huán)境相適應(yīng)的。通過(guò)遺傳重組可以產(chǎn)生個(gè)體特征特性更加豐富多彩的子代群體，為適應(yīng)環(huán)境變化提供了更多機(jī)遇；3、有可能產(chǎn)生新的表型變異類(lèi)型通過(guò)基因重組還可能因?yàn)檫B鎖關(guān)系的改變等原因，產(chǎn)生出基因位置效應(yīng)，進(jìn)而出現(xiàn)新的表型變異類(lèi)型。如果沒(méi)有遺傳重組，個(gè)體類(lèi)型就固定下來(lái)，在自然選擇的作用下就會(huì)逐漸單一化，以不變應(yīng)萬(wàn)變是不能長(zhǎng)期堅(jiān)持的。很多在當(dāng)前環(huán)境條下的不利隱性基因也失去了在環(huán)境條件發(fā)生變化后顯露生手的機(jī)會(huì)。2008年8月四川師大生科院張光祥2、保持和發(fā)揮種群內(nèi)遺傳多樣性遺傳多樣性使得種群內(nèi)具有各種各5還有大量的遺傳現(xiàn)象仍是未解之謎，其中有不少與基因重組有關(guān)。比如：Y染色體上有無(wú)足夠的基因重組行為？基因重組的前提是要有兩份拷貝同時(shí)出現(xiàn)在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)，Y染色體上的基因有這種機(jī)會(huì)嗎？請(qǐng)關(guān)注有關(guān)Y染色體的嚴(yán)肅研究。病毒新變種的出現(xiàn)究竟有哪些具體模式？是否還有不為人知的機(jī)制？基因組重排、染色體結(jié)構(gòu)的演化又有哪些具體模式？是否還有不為人知的機(jī)制？其中，病毒起到了哪些具體作用？體細(xì)胞重組的分子機(jī)制與特點(diǎn)也知之甚少。轉(zhuǎn)座子、病毒、附加體、胞質(zhì)基因組等的重組行為？三、研究基因重組的意義1、人類(lèi)對(duì)基因重組機(jī)制的認(rèn)識(shí)還十分膚淺2008年8月四川師大生科院張光祥還有大量的遺傳現(xiàn)象仍是未解之謎，其中有不少與基因重組有關(guān)。比62、研究基因重組有利于更加深入地了解復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象對(duì)基因重組問(wèn)題缺乏了解→困惑難除→荒唐迷思比如X和Y染色體之間不能像一對(duì)同源染色體一樣進(jìn)行頻繁而有效的交換重組。況且，為了產(chǎn)生大量的雄配子，雄性生殖細(xì)胞的分裂和DNA的復(fù)制更為頻繁。而大多數(shù)突變的發(fā)生就與DNA鏈的復(fù)制等暴露機(jī)會(huì)有關(guān)。所以有人估計(jì)，在大概5000代也就是12.5萬(wàn)年后，男人的生殖能力將大約只有現(xiàn)在的1％，最終，男性將不再具有自然生育能力。2005年4月還出版了一本書(shū)《亞當(dāng)?shù)脑{咒：沒(méi)有男人的未來(lái)》，書(shū)中對(duì)男人和他們脆弱的Y染色體作了悲觀的評(píng)述。為此，還有人提出了一個(gè)將男性從人類(lèi)生殖的程序中排除出去的所謂解決方案，就是通過(guò)兩個(gè)卵子的結(jié)合來(lái)生殖，使人類(lèi)成為只有一種性別的女兒國(guó)世界。嚴(yán)肅的科學(xué)研究有助于化解偽科學(xué)問(wèn)題的困擾。2、研究基因重組有利于更加深入地了解復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象對(duì)基因重7第二節(jié)、同源性重組一、同源性重組(homologousrecombination)概述概念、特點(diǎn)、對(duì)等互換式和單向置換式；發(fā)生同源性重組的三個(gè)基本條件。二、真核生物的同源重組Holliday模型、基因轉(zhuǎn)換、Meselson-Radding模型簡(jiǎn)介體細(xì)胞重組三、細(xì)菌的同源重組細(xì)菌部分合子中的重組過(guò)程細(xì)菌整合外源轉(zhuǎn)化DNA的基本特點(diǎn)與可能機(jī)制2008年8月四川師大生科院張光祥第二節(jié)、同源性重組一、同源性重組(homologousre8一、同源性重組概述1、概念：兩個(gè)同源DNA分子或區(qū)段經(jīng)聯(lián)會(huì)和交換而實(shí)現(xiàn)的交換重組，即普遍性重組（generalizedrecombination）。2、同源性重組的兩個(gè)特點(diǎn)：（1）、DNA聯(lián)會(huì)和重組無(wú)嚴(yán)格的堿基序列特異性，兩條DNA只要有足夠長(zhǎng)的同源區(qū)（序列相同或接近），重組就可在同源聯(lián)會(huì)區(qū)的任何一點(diǎn)發(fā)生?；蚪M內(nèi)的重復(fù)序列→不對(duì)稱聯(lián)會(huì)→重復(fù)、缺失等;遠(yuǎn)緣雜交子代→同源聯(lián)會(huì)→交換重組→代換系；基因搶、微注射等引入的外源DNA→同源重組→整合。（2）、至少涉及聯(lián)會(huì)處一個(gè)DNA片段的斷裂過(guò)程。因此,許多DNA損傷的因素均可促進(jìn)同源重組的發(fā)生。一、同源性重組概述1、概念：兩個(gè)同源DNA分子或區(qū)段經(jīng)聯(lián)會(huì)和93、同源性重組的兩種類(lèi)型（1）、雙向重組：一次重組可產(chǎn)生兩個(gè)重組子；減數(shù)分裂時(shí)，同源染色體聯(lián)會(huì)保證了高頻率的雙向重組。（2）、單向重組：一次重組僅產(chǎn)生一個(gè)重組子；轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、性導(dǎo)和某些病毒的重組等均屬同源重組，但在部分合子中進(jìn)行,不是遺傳物質(zhì)的對(duì)等互換,僅受體發(fā)生重組,因而它們是單向置換式同源性重組。2008年8月四川師大生科院張光祥3、同源性重組的兩種類(lèi)型（1）、雙向重組：2008年8月四川104、發(fā)生同源重組的三個(gè)基本條件兩個(gè)DNA分子的同源區(qū)必須進(jìn)行同源聯(lián)會(huì)(synapsis)。同源區(qū)越長(zhǎng)越有利，同源區(qū)太短，越難于發(fā)生重組。GGggggGGggGGGGggGGggggGGggggGGGG比如糞盤(pán)菌屬的糞生糞殼菌子囊孢子,G黑,g白：GgGgGggGGggGMII分離ggggGGGGGGGGggggMI分離大腸桿菌：活體重組至少要有20-40bp同源區(qū)；與l噬菌體或質(zhì)粒重組要求313bp同源區(qū)。枯草桿菌基因組與質(zhì)粒重組需要的370bp同源區(qū)。哺乳動(dòng)物：150bp以上同源區(qū)。除了同源性要求外，還需要特定蛋白質(zhì)或酶的參與。2008年8月四川師大生科院張光祥4、發(fā)生同源重組的三個(gè)基本條件兩個(gè)DNA分子的同源區(qū)必須進(jìn)行115、同源重組的基本過(guò)程DNA雙螺旋配對(duì)在兩條同源鏈對(duì)應(yīng)部位切開(kāi)自由末端交換連接連接缺口處未實(shí)現(xiàn)重組連接并完成重組分支遷移拆分后的狀況切開(kāi)兩條互換單鏈形成局部異源雙鏈拆分方式1在分支所在位置切開(kāi)另外兩條鏈拆分方式2分支遷移可向左或向右;遷移距離少則幾十、上百bp,多則可到2kb左右；分支遷移后的拆分可看作一修復(fù)過(guò)程:切開(kāi)兩條單鏈兩條雙螺旋被拆分連接酶封連缺口。2008年8月四川師大生科院張光祥5、同源重組的基本過(guò)程DNA雙螺旋配對(duì)在兩條同源鏈自由末端交12二、真核生物的同源性重組真核生物的染色質(zhì)狀態(tài)對(duì)重組影響，比如異染色質(zhì)及其附近區(qū)域就很少發(fā)生重組。盡管兩條DNA分子間的同源聯(lián)會(huì)和同源性重組沒(méi)有嚴(yán)格的堿基序列特異性，但也存在重組熱點(diǎn)，即某類(lèi)序列發(fā)生重組的概率高于其他序列。真核生物的同源性重組除了對(duì)等互換以外，也有單向重組，如基因組與外源DNA片斷、環(huán)狀DNA小分子(載體)等的同源性重組。HollidayR為了解釋對(duì)等互換式同源性重組的發(fā)生過(guò)程，于1964年提出了Holliday模型。Meselson-Radding為了解釋單向置換式同源性重組的發(fā)生過(guò)程，于1975年提出Meselson-Radding模型。2008年8月四川師大生科院張光祥二、真核生物的同源性重組真核生物的染色質(zhì)狀態(tài)對(duì)重組影響，比如13拆分方式1拆分方式21、Holliday模型ABabABabABabABab切開(kāi)ABab侵入ABab連接ABab分支遷移ABab交叉橋結(jié)構(gòu)Holliday中間體ABba旋轉(zhuǎn)變構(gòu)ABbaABab拆分結(jié)果連接ABbaABab拆分結(jié)果ABab連接拆分方式1拆分1、Holliday模型ABabABa142、基因轉(zhuǎn)換(Geneconversion)⑴、交換重組例外情況的發(fā)現(xiàn)糞生糞殼菌子囊孢子:G黑,g白。MI分離ggggGGGGGGGGggggGg但是,1962年Kitani等在觀察MI型和MII型子囊總共達(dá)127000個(gè)的同時(shí),還發(fā)現(xiàn)了少數(shù)例外。發(fā)生頻率比突變高得多。GGggGGGG2:6型13個(gè)6:2型98個(gè)ggggGGggGGgggGGG3:5型20個(gè)GgggGGgg5:3型108個(gè)gGg/GG/gMⅡ分離ggGGGGggGGggggGGGGggggGGggggGGGGgG2、基因轉(zhuǎn)換(Geneconversion)⑴、交換重組例15⑵、對(duì)異常子囊現(xiàn)象的解釋同源染色體聯(lián)會(huì)時(shí),一個(gè)等位基因轉(zhuǎn)變成了另一等位基因,或被非姊妹染色單體的那個(gè)等位基因置換了。GggGGggGGggGGggGg+ggGGggGGgggggggggggggg2:6++GGggGGGGGGggGGGGgg++++++6:2GGgggGGGGggGGgGGggg+++++5:3GgggGGggGgggGGggggggg3:5+++GggGGggGggGGggGG異常4:4g++++gggg+gg+gg+++++g+/g+g+/gg++/gg+/g⑵、對(duì)異常子囊現(xiàn)象的解釋同源染色體聯(lián)會(huì)時(shí),一個(gè)等位基因轉(zhuǎn)變16⑶、異常子囊的產(chǎn)生機(jī)制等位基因B

G等位基因bACT異常的4:4Gg交換發(fā)生在某個(gè)基因的內(nèi)部時(shí)，按照Holliday模型，在交換發(fā)生部位將產(chǎn)生異源雙鏈區(qū)。異源雙鏈區(qū)通常會(huì)及時(shí)得到修復(fù)。5+:3-3+:5-6+:2-2+:6-親本型4:4⑶、異常子囊的產(chǎn)生機(jī)制等位基因BG等位基因bACT異常173、單向置換式重組Holliday模型不僅解釋了非姊妹染色單體間的互換，也解釋了偶爾出現(xiàn)的不均等分離現(xiàn)象(基因轉(zhuǎn)變現(xiàn)象)。⑴.單鏈切斷⑵.合成新鏈置換舊鏈⑶.單鏈入侵，新鏈繼續(xù)合成⑷.泡切除、不對(duì)稱異源雙鏈區(qū)⑸.鏈同化連接（碎鏈吸收）⑹.異構(gòu)化形成Holliday結(jié)構(gòu)⑺.分支遷移。然而，對(duì)于單向的不對(duì)稱重組現(xiàn)象，Meselson-Radding于1975年提出置換式重組模型：⑴.⑵.⑶.⑷.⑸.⑹.⑺.2008年8月四川師大生科院張光祥3、單向置換式重組Holliday模型不僅解釋了非姊妹染色單184、體細(xì)胞交換重組發(fā)生在有絲分裂過(guò)程中的非姊妹染色單體互換叫體細(xì)胞交換(somaticcrossingover)或有絲分裂交換(mitoticcrossingover)。但是，CurtStern1936年首次發(fā)現(xiàn)，個(gè)別雌果蠅雜合體身上出現(xiàn)了黃斑、焦剛毛斑，以及焦剛毛斑與黃斑相連的孿生斑。yy+++su果蠅有灰體(y+)對(duì)黃體(y)、直剛毛(su+)對(duì)焦剛毛(sn)兩對(duì)性狀，兩對(duì)基因都位于X染色體上。×↓y++suy+這兩對(duì)基因的雌果蠅雜合體應(yīng)該表現(xiàn)為灰體長(zhǎng)直剛毛。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這些斑塊是在個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程中體細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了非姊妹染色單體交換的結(jié)果。2008年8月四川師大生科院張光祥4、體細(xì)胞交換重組發(fā)生在有絲分裂過(guò)程中的非姊妹染色單體互換叫19果蠅體細(xì)胞交換×yy+++suy++suysusu++y++全部體細(xì)胞未交換野生型y++suysusu++y++++ysu+ysu+單個(gè)黃斑suy+++ysu+y++susu+y++ysu+孿生斑y++suysu++suy++su++y+ysu+單個(gè)焦剛毛斑→♂F1y+y++su♀F1黃體直剛毛野生型2008年8月四川師大生科院張光祥果蠅體細(xì)胞交換×yy+++suy++suysusu+20三、細(xì)菌的同源重組細(xì)菌的同源重組包括：部分合子中的重組過(guò)程結(jié)合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、性導(dǎo)等形成部分合子轉(zhuǎn)化等導(dǎo)入的外源DNA的重組過(guò)程F+→Hfr2008年8月四川師大生科院張光祥三、細(xì)菌的同源重組細(xì)菌的同源重組包括：2008年8月四川師大211、細(xì)菌部分合子中的重組過(guò)程⑶.Holliday結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化；⑴.

RecB、RecC、RecD和核酸酶構(gòu)成復(fù)合體RecBCD；RecBCD在聯(lián)會(huì)的兩DNA上識(shí)別chi位點(diǎn)(GCTGGTGG),然后各切斷一條單鏈。E.coli基因組內(nèi)約4kb有一chi位點(diǎn)⑵.RecA蛋白結(jié)合到單鏈DNA上，激活其重組活性；兩條斷開(kāi)的單鏈5`-端被RecA包裹成起來(lái)，交換位置后重新連接，形成“交叉”或四分枝樣的Holliday結(jié)構(gòu)。交叉點(diǎn)向前或向后滑動(dòng)動(dòng)相當(dāng)一段距離(即分枝遷移),形成局部異源雙鏈區(qū),同時(shí)產(chǎn)生一定的正超螺旋扭力;Holliday結(jié)構(gòu)能夠通過(guò)旋轉(zhuǎn)發(fā)生立體異構(gòu)，使“橋”鏈(即連接兩條螺旋的交叉部分)轉(zhuǎn)變?yōu)椤巴獠俊辨?。?將變構(gòu)后的“外部”鏈切開(kāi)兩條螺旋被拆分連接酶封連缺口。2008年8月四川師大生科院張光祥1、細(xì)菌部分合子中的重組過(guò)程⑶.Holliday結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)222、細(xì)菌部分合子同源重組示意圖chi位點(diǎn)：GCTGGTGG2、細(xì)菌部分合子同源重組示意圖chi位點(diǎn)：GCTGGTGG233、細(xì)菌外源轉(zhuǎn)化DNA的整合⑴.基本特點(diǎn)整合(重組)就是指單鏈的轉(zhuǎn)化DNA與受體DNA對(duì)應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行置換，穩(wěn)定地進(jìn)入到受體基因組DNA中。整合(重組)對(duì)同源DNA具有特異性。對(duì)于異源DNA，視親緣關(guān)系遠(yuǎn)近也可發(fā)生不同頻率整合。2008年8月四川師大生科院張光祥3、細(xì)菌外源轉(zhuǎn)化DNA的整合⑴.基本特點(diǎn)整合(重組)就是指24⑵、細(xì)菌遺傳轉(zhuǎn)化的可能方式2008年8月四川師大生科院張光祥⑵、細(xì)菌遺傳轉(zhuǎn)化的可能方式2008年8月四川師大生科院張光祥25第三節(jié)、位點(diǎn)特異性重組一、位點(diǎn)特異性重組的概念位點(diǎn)特異性重組依賴于不同DNA雙螺旋之間很短（幾個(gè)至十幾個(gè)bp）的特定同源序列的。這種特定的序列實(shí)質(zhì)就是能發(fā)動(dòng)位點(diǎn)特異性重組的酶進(jìn)行識(shí)別與結(jié)合的位點(diǎn)。位點(diǎn)特異性重組的結(jié)果是不同DNA分子間的合并（如一個(gè)序列插入另一序列中）或重排。位點(diǎn)特異性重組是一類(lèi)廣泛存在的DNA重組方式，如噬菌體的溶源性反應(yīng)、一些病毒在宿主基因組上的整合、一些基因在DNA水平上的表達(dá)調(diào)控、抗體多樣性的產(chǎn)生等。2008年8月四川師大生科院張光祥第三節(jié)、位點(diǎn)特異性重組一、位點(diǎn)特異性重組的概念位點(diǎn)特異性重組26二、l噬菌體的位點(diǎn)特異性重組1.噬菌體的位點(diǎn)特異性重組，是指噬菌體基因組整合到宿主菌基因組上成為原噬菌體的過(guò)程，也包括原噬菌體從宿主菌基因組上獨(dú)立出來(lái)的過(guò)程。l噬菌體的基因組通過(guò)att位點(diǎn)整合到細(xì)菌染色體，這是一種典型的位點(diǎn)特異性重組過(guò)程。2.噬菌體的位點(diǎn)特異性重組顯然并不包括兩個(gè)噬菌體DNA分子間的重組。red

crocIIOpOri噬菌體顆粒的形成

頭部尾部b2區(qū)與存活無(wú)關(guān)

免疫調(diào)控溶源/裂解復(fù)制晚期控制裂解AWBCDENu3F1F2ZUVGTHMLKIJ

intxisexo

CIIINcIQSR全長(zhǎng)48502

bp

整合.切除與重組Nulatt噬菌體的附著區(qū)二、l噬菌體的位點(diǎn)特異性重組1.噬菌體的位點(diǎn)特異性重組，是273、噬菌體att位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)⑴.l噬菌體的att位點(diǎn)叫attP。通過(guò)缺失實(shí)驗(yàn)證明，attP至少要約250bp長(zhǎng)，太短將使其功能喪失。attP可繞在整合酶分子的周?chē)?，?lèi)似核小體的結(jié)構(gòu)。⑵.

E.coli的att位點(diǎn)叫attB，約23bp長(zhǎng)即有功能。⑶.attB和attP有一個(gè)相同的15bp核心序列，用Ｏ表示。Ｏ在中間,兩側(cè)的序列稱為臂。(-GCTTTTTTATACTAA-)⑷.attB的兩個(gè)臂分別是B和B’，attB的結(jié)構(gòu)記為BOB`。attP的兩個(gè)臂分別是P和P’，attP的結(jié)構(gòu)記為POP`。體外實(shí)驗(yàn)使用四種成份的混合物：純的整合酶；IHF；鎂離子；噬菌體DNA（具有att和COS末端序列）。–160–140–120–100–80–60–40–20020406080PP’GTTCAGCTTTTTTATACTAAGTTGGCAAGTCGAAAAAATATGATTCAACC2008年8月四川師大生科院張光祥3、噬菌體att位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)⑴.l噬菌體的att位點(diǎn)叫a284、l噬菌體的整合噬菌體在宿主基因組上的整合過(guò)程通過(guò)專一性識(shí)別att位點(diǎn)核心序列的整合酶（Int）進(jìn)行。⑷.整合是非可逆反應(yīng)。⑴.對(duì)核心序列具有強(qiáng)烈親和力的Int識(shí)別attB和attP，并與核心序列結(jié)合；⑵.Int的拓?fù)洚悩?gòu)酶活性使兩條雙鏈都斷開(kāi)一條單鏈，瞬間旋轉(zhuǎn)后交換連接，形成Holliday中間體；⑶.在另兩條單鏈之間發(fā)生同樣的“切開(kāi)—連接”過(guò)程，從而完成雙鏈間的重組。–160–140–120–100–80–60–40–20020406080PP’GTTCAGCTTTTTTATACTAAGTTGGCAAGTCGAAAAAATATGATTCAACCInt識(shí)別序列4、l噬菌體的整合噬菌體在宿主基因組上的整合過(guò)程通過(guò)專一性295、l噬菌體的切離⑴.原病毒兩側(cè)各有一個(gè)雜種att位點(diǎn),左側(cè)由BOP’組成,叫attL；右側(cè)由POB’組成,叫attR。⑵.切離過(guò)程識(shí)別attL和attR，還需要整合酶(Int)、整合宿主因子(IHF)和切除酶(Xis)參與。⑶.切離也是非可逆反應(yīng)。⑸.整合過(guò)程需宿主輔助因子IHF的配合。每一次整合的重組過(guò)程需要20－40個(gè)整合酶分子和約70個(gè)IHF分子。說(shuō)明這兩種蛋白不僅僅是酶(起催化作用)，而且在形成某種復(fù)合物結(jié)構(gòu)中起著重要作用。2008年8月四川師大生科院張光祥5、l噬菌體的切離⑴.原病毒兩側(cè)各有一個(gè)雜種att位點(diǎn),左側(cè)30三、RNA病毒在宿主基因組上的整合反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制需要利用宿主細(xì)胞的很多資源，包括DNA復(fù)制系統(tǒng)的利用。所以病毒具有反轉(zhuǎn)錄酶基因，將自身RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。病毒基因組cDNA有兩個(gè)去向，一是不斷大量復(fù)制并表達(dá)外殼蛋白，然后包裝和釋放；二是整合到宿主基因組內(nèi)。病毒編碼的整合酶可特異地識(shí)別反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(longterminalrepeat,LTR)，然后完成整合。RNA病毒在宿主基因組上的整合過(guò)程也屬于位點(diǎn)特異性重組。2008年8月四川師大生科院張光祥三、RNA病毒在宿主基因組上的整合反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制需要利用宿31四、細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組舉例沙門(mén)氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變：H片斷hixrH1hinPPH2PH2hixH2鞭毛蛋白H片斷hixrH1hinPPH2PH2hixHinH2鞭毛蛋白阻遏蛋白hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特異位點(diǎn)重組（倒位）。H片段上有兩個(gè)啟動(dòng)子P,其一驅(qū)動(dòng)hin基因表達(dá)，另一正向時(shí)驅(qū)動(dòng)H2和rH1基因表達(dá)，倒位時(shí)H2和rH1不表達(dá)。rH1為H1的阻遏蛋白基因。2008年8月四川師大生科院張光祥四、細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組舉例沙門(mén)氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變：32五、免疫球蛋白基因的位點(diǎn)特異性重排重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點(diǎn)上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號(hào)序列(recombinationsignalsequence,RSS)。CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCAC(12/23)TGTTTTTGG重組信號(hào)序列RSS輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：LVJCLV

D

JC此重排的重組酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有兩個(gè)，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和RAG2。V片段J片段RSSRSS間隔DNA單鏈切開(kāi)RAG1RAG2OHOH分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)轉(zhuǎn)移核苷酸修復(fù)、連接V片段J片段2008年8月四川師大生科院張光祥五、免疫球蛋白基因的位點(diǎn)特異性重排重鏈(IgH)基因的V-D33第四節(jié)、轉(zhuǎn)座因子及其遺傳效應(yīng)基因組是相對(duì)穩(wěn)定的，各種序列通常處于相對(duì)恒定的位置。因此，可以通過(guò)遺傳圖標(biāo)示基因的基因座。一、轉(zhuǎn)座因子的概要1、概念：轉(zhuǎn)座因子(transposable

factor)是基因組內(nèi)有明確界限、不必借助噬菌體或質(zhì)粒就可從一個(gè)部位直接轉(zhuǎn)移到另一個(gè)部位的DNA序列,這個(gè)過(guò)程稱為轉(zhuǎn)座或轉(zhuǎn)座作用(transposition)。轉(zhuǎn)座因子又叫轉(zhuǎn)位元、可轉(zhuǎn)座元件(transposableelement)等。轉(zhuǎn)座因子的三種類(lèi)型：插入因子轉(zhuǎn)座子(transposon)即復(fù)合型可轉(zhuǎn)座因子病毒型轉(zhuǎn)座因子，包括可轉(zhuǎn)座噬菌體（transposablephage）。2008年8月四川師大生科院張光祥第四節(jié)、轉(zhuǎn)座因子及其遺傳效應(yīng)基因組是相對(duì)穩(wěn)定的，各種序列通常342、轉(zhuǎn)座因子的特點(diǎn)⑴.轉(zhuǎn)座子每次移動(dòng)都帶著轉(zhuǎn)座必需的基因一起躍遷,所以轉(zhuǎn)座子又稱跳躍基因(jumpinggene)。⑵.轉(zhuǎn)座的發(fā)生無(wú)需轉(zhuǎn)座子和靶位點(diǎn)之間的序列同源性。⑶.轉(zhuǎn)座發(fā)生頻率通常很低,而且轉(zhuǎn)座插入點(diǎn)是隨機(jī)的。⑷.各種轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座皆需轉(zhuǎn)座酶(transposase)。⑸.轉(zhuǎn)座子兩端都有重復(fù)序列，轉(zhuǎn)座需要識(shí)別靶序列。2008年8月四川師大生科院張光祥2、轉(zhuǎn)座因子的特點(diǎn)⑴.轉(zhuǎn)座子每次移動(dòng)都帶著轉(zhuǎn)座必需的基因一起353、轉(zhuǎn)座子的發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座元件首先由BarbaraMcClintock于40年代在玉米的遺傳研究中發(fā)現(xiàn)的，她稱之為控制元件（controllingelement），因?yàn)樗粌H能夠在基因組內(nèi)轉(zhuǎn)移，而且還能夠改變基因的活性并引起功能的改變?，F(xiàn)在認(rèn)為轉(zhuǎn)座子存在于地球上所有的生物。轉(zhuǎn)座子的擴(kuò)增可能通過(guò)產(chǎn)生有害的結(jié)果而得到平衡。2008年8月四川師大生科院張光祥3、轉(zhuǎn)座子的發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座元件首先由BarbaraMcClint36二、轉(zhuǎn)座因子的簡(jiǎn)介1、IS因子（insertionsequences）IS是最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座因子。IS元件是細(xì)菌染色體和質(zhì)粒的正常組成部分。最早被鑒定的轉(zhuǎn)座元件是細(xì)菌操縱子中的自主插入序列。166bp166bpAATCACCCTTCCACGCTTATTC……GAATAAGCGTGGAAGGCCAATCTTAGTGGGAAGGTGCGAATAAG……CTTATTCGCACCTTCCGGTTAG插入的IS因子IS5IS元件是獨(dú)立的結(jié)構(gòu)單位，每個(gè)元件只編碼為自身轉(zhuǎn)座所需要的蛋白質(zhì)：轉(zhuǎn)座酶。IS元件的末端為短的反向末端重復(fù)序列（invertedterminalrepeats），通常這兩個(gè)拷貝密切相關(guān)，但并不完全一樣。24bp700～2000bp24bpIR轉(zhuǎn)座酶基因IR基因組中IS因子在插入部位識(shí)別的DNA靶序列：YGGGTTTAGTGGTTACCCAAATCACCAA轉(zhuǎn)座后靶部位變成兩個(gè)正向重復(fù)序列。二、轉(zhuǎn)座因子的簡(jiǎn)介1、IS因子（insertionsequ372、復(fù)合型轉(zhuǎn)座因子：轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子是兩端各有一個(gè)IS，帶有藥物抗性等基因的可轉(zhuǎn)移序列。左邊的IS叫左臂(L),右邊的IS叫右臂(R)。L和R有些是相同的，有些是不同的；有些轉(zhuǎn)座子的兩個(gè)IS都有編碼功能，有的僅一個(gè)IS具有編碼功能。轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)座酶抗生素抗性基因、毒素基因等IS模體IS模體轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)座酶抗生素抗性基因、毒素基因等IS模體IS模體IR轉(zhuǎn)座酶基因IRIS轉(zhuǎn)座酶IRIR轉(zhuǎn)座酶IRIRtet-R基因Tn10四環(huán)素抗性基因b-內(nèi)酰胺酶阻遏蛋白轉(zhuǎn)座酶基因IRIRTn3復(fù)合型轉(zhuǎn)座子隨著中央序列的增長(zhǎng),轉(zhuǎn)座的頻率降低。2、復(fù)合型轉(zhuǎn)座因子：轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子是兩端各有一個(gè)IS，帶有藥物383、真核生物的轉(zhuǎn)座因子果蠅的卡巴粒是研究得最清楚的。全長(zhǎng)約5kb，兩端各有一個(gè)276bp的正向末端重復(fù)，每個(gè)末端重復(fù)的兩端又各有一個(gè)反向重復(fù)序列。卡巴元件識(shí)別基因組DNA內(nèi)的一種5bp靶序列,并在此插入。在卡巴家族內(nèi)成員之間的差異很小,具有差異的核苷酸數(shù)小于5%卡巴內(nèi)只有一個(gè)4227bp的讀碼框?？ò驮诩?xì)胞的拷貝數(shù)因果蠅品系不同而異，變化在20至60之間。⑴、果蠅的三種可轉(zhuǎn)座因子的結(jié)構(gòu)特征比較2008年8月四川師大生科院張光祥3、真核生物的轉(zhuǎn)座因子果蠅的卡巴粒是研究得最清楚的。全長(zhǎng)約539⑵、玉米C座位的轉(zhuǎn)座子插入突變真核生物的轉(zhuǎn)座因子無(wú)論結(jié)構(gòu)還是轉(zhuǎn)座活動(dòng)都要復(fù)雜一些，也常常引起插入突變。玉米籽粒色斑、果蠅復(fù)眼顏色變異、啤酒酵母接合型轉(zhuǎn)換等，都與轉(zhuǎn)座因子在染色體上的轉(zhuǎn)座有關(guān)。玉米上除了Ac–Ds系統(tǒng)外，Spm轉(zhuǎn)座因子也包括自主轉(zhuǎn)座因子和非自主轉(zhuǎn)座因子兩個(gè)組成部分。玉米C座位的轉(zhuǎn)座子插入突變圖解顯性基因C→有色糊粉層Ds因子插入C座，使其突變?yōu)閏-m，糊粉層無(wú)色編碼轉(zhuǎn)座酶的Ac存在時(shí)，可引起Ds在某些細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)座，產(chǎn)生回復(fù)突變，結(jié)果使整個(gè)籽粒呈現(xiàn)出在無(wú)色背景下散布著有色斑點(diǎn)。⑵、玉米C座位的轉(zhuǎn)座子插入突變真核生物的轉(zhuǎn)座因子無(wú)論結(jié)構(gòu)還是404、病毒型轉(zhuǎn)座因子⑴、可轉(zhuǎn)座的噬菌體：Mu噬菌體是大腸桿菌的溫和噬菌體，溶源化后，能起到轉(zhuǎn)座子的作用。和轉(zhuǎn)座子一樣，它也含有與轉(zhuǎn)座有關(guān)的基因和反向重復(fù)序列。攜帶有tnpA、tnpB基因，末端有E.coliDNA,近鄰類(lèi)似IS序列，具有高頻的轉(zhuǎn)座作用。轉(zhuǎn)位時(shí)復(fù)制宿主靶位點(diǎn)4～15bp的小段DNA形成兩端的正向重復(fù)序列(轉(zhuǎn)座子的特點(diǎn))。Mu能夠整合進(jìn)寄主染色體，催化一系列染色體重新排列。2008年8月四川師大生科院張光祥4、病毒型轉(zhuǎn)座因子⑴、可轉(zhuǎn)座的噬菌體：Mu噬菌體是大腸桿菌的41⑵、真核生物中的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（Retrotransposon）又叫反轉(zhuǎn)錄子（Retroposon）?；蚪MDNA上的反轉(zhuǎn)錄子↓轉(zhuǎn)錄RNA反轉(zhuǎn)錄DNA插入到基因組的其他座位上↓↓轉(zhuǎn)座最大的特點(diǎn)是：通過(guò)轉(zhuǎn)錄成RNA后再反轉(zhuǎn)錄成DNA的過(guò)程產(chǎn)生一個(gè)游離于基因組DNA的反轉(zhuǎn)錄子拷貝。所以，反轉(zhuǎn)座是經(jīng)RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座過(guò)程。必須經(jīng)過(guò)RNA中間體的轉(zhuǎn)座過(guò)程是真核生物所特有的。反轉(zhuǎn)錄子廣泛存在于真核生物中，其序列結(jié)構(gòu)與反轉(zhuǎn)錄病毒的原病毒具有非常相似的一般結(jié)構(gòu)特征。在高等生物的基因組DNA中有很多不活躍的反轉(zhuǎn)錄子序列，有些具有大量拷貝。很可能是曾經(jīng)發(fā)生RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座事件或原病毒留下來(lái)的。2008年8月四川師大生科院張光祥⑵、真核生物中的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（Retrotra42反轉(zhuǎn)錄子及反轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期比較LTRisanabbreviationforlong-terminalrepeat.Reproductivecyclesofretrovirusesandretroposons.Onlyretrovirusescangenerateinfectiousparticles.Retroposonsareconfinedtoanintracellularcycle2008年8月四川師大生科院張光祥反轉(zhuǎn)錄子及反轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期比較LTRisanabb43酵母的Ty轉(zhuǎn)座元件就是一種反轉(zhuǎn)座子Ty是transposonyeast的縮寫(xiě)。Ty的轉(zhuǎn)座頻率大大低于細(xì)菌的轉(zhuǎn)座子。典型的Ty元件有6.3k，其中兩端各有一個(gè)330bp的正向重復(fù)序列叫(delta)。Ty元件包含兩個(gè)讀碼框(下圖左)，兩個(gè)基因重疊13個(gè)氨基酸。實(shí)驗(yàn)證明Ty元件的轉(zhuǎn)座是通過(guò)RNA介導(dǎo)的（下圖右）2008年8月四川師大生科院張光祥酵母的Ty轉(zhuǎn)座元件就是一種反轉(zhuǎn)座子Ty是transposo44三、轉(zhuǎn)座方式轉(zhuǎn)座子插入到一個(gè)新的部位的通常步驟是：在靶DNA上制造一個(gè)交錯(cuò)的切口，然后轉(zhuǎn)座子與突出的單鏈末端相連接，并填充切口。插入部位產(chǎn)生靶DNA正向重復(fù)的鏈的切口之間的交錯(cuò)區(qū)長(zhǎng)度決定了正向重復(fù)的長(zhǎng)度。原因就是交錯(cuò)末端的產(chǎn)生和填充。2008年8月四川師大生科院張光祥三、轉(zhuǎn)座方式轉(zhuǎn)座子插入到一個(gè)新的部位的通常步驟是：在靶DNA451、復(fù)制型轉(zhuǎn)座復(fù)制型轉(zhuǎn)座涉及到兩種類(lèi)型的酶參與：一是轉(zhuǎn)座酶，它在原轉(zhuǎn)座子的末端起作用。另一種為拆分酶(Resolvase)，利用兩個(gè)轉(zhuǎn)座子拷貝進(jìn)行交換重組而拆分。復(fù)制型轉(zhuǎn)座是產(chǎn)生一個(gè)轉(zhuǎn)座子拷貝，轉(zhuǎn)移到受體位點(diǎn)，供體位點(diǎn)序列不變。因此，供體和受體位點(diǎn)都有一個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座子，轉(zhuǎn)座伴隨著轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的增加。1、復(fù)制型轉(zhuǎn)座復(fù)制型轉(zhuǎn)座涉及到兩種類(lèi)型的酶參與：復(fù)制型轉(zhuǎn)座是462、非復(fù)制轉(zhuǎn)座非復(fù)制轉(zhuǎn)座中轉(zhuǎn)座子僅從供體位點(diǎn)向受體位點(diǎn)做物理性移動(dòng)，從而在供體位點(diǎn)造成鏈的斷裂，若斷裂不被修復(fù)，后果將是致命的。插入序列(IS)和復(fù)合轉(zhuǎn)座子Tn10和Tn5的轉(zhuǎn)座就是利用的這種機(jī)制。這種轉(zhuǎn)座過(guò)程中涉及到轉(zhuǎn)座子從供體DNA的釋放，機(jī)制需要一個(gè)轉(zhuǎn)座酶。2、非復(fù)制轉(zhuǎn)座非復(fù)制轉(zhuǎn)座中轉(zhuǎn)座子僅從供體位點(diǎn)向受體位點(diǎn)做物理473、保守性轉(zhuǎn)座保守性轉(zhuǎn)座與λ噬菌體的整合、刪除機(jī)制非常相似,并且轉(zhuǎn)座酶與λ的整合酶具有相關(guān)性。運(yùn)用這一機(jī)制的轉(zhuǎn)座子較大，不僅可以轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)座子本身，而且還以將供體菌的DNA轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌。盡管起初將其歸類(lèi)為轉(zhuǎn)座子，但更確切地應(yīng)被稱為附加體(Episome)。有些轉(zhuǎn)座子只采用一種方式轉(zhuǎn)座，其它轉(zhuǎn)座子則可利用多種途徑轉(zhuǎn)座。元件IS1和IS903既可以非復(fù)制型方式也可以復(fù)制型方式轉(zhuǎn)座。保守性轉(zhuǎn)座只是序列的直接移動(dòng)，沒(méi)有核苷酸鍵的損失，原位點(diǎn)沒(méi)有鏈斷裂。3、保守性轉(zhuǎn)座保守性轉(zhuǎn)座與λ噬菌體的整合、刪除機(jī)制非常相似,484、轉(zhuǎn)座與重組的關(guān)系⑴.以復(fù)制型轉(zhuǎn)座說(shuō)明轉(zhuǎn)座作用其實(shí)就是DNA分子的一種重組過(guò)程。第一步.在轉(zhuǎn)座酶作用下形成共整合體切口端交叉插入并連接復(fù)制補(bǔ)缺最先復(fù)制靶序列在轉(zhuǎn)座子和靶位點(diǎn)間共價(jià)連接形成共整合體(相當(dāng)于重組子)OHOH轉(zhuǎn)座子兩端被轉(zhuǎn)座酶切開(kāi)OHOH靶序列兩端被轉(zhuǎn)座酶切開(kāi)轉(zhuǎn)座子靶序列4、轉(zhuǎn)座與重組的關(guān)系⑴.以復(fù)制型轉(zhuǎn)座說(shuō)明轉(zhuǎn)座作用其實(shí)就是DN49第二步.共整合體由拆分酶進(jìn)行(Resolvase)拆分許多DNA可移動(dòng)元件如IS元件、原核和真核轉(zhuǎn)座子以及細(xì)菌Mu噬菌體都以基本相似的機(jī)制從進(jìn)行轉(zhuǎn)座。逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA的DNA拷貝的插入也是相同的機(jī)制。免疫球蛋白重組的第一步機(jī)制也相似。拆分酶利用兩個(gè)轉(zhuǎn)座子拷貝進(jìn)行類(lèi)似同源重組而拆分第二步.共整合體由拆分酶進(jìn)行(Resolvase)拆分許多50⑵、Hfr的形成就是利用兩個(gè)基因組上IS的同源性重組實(shí)現(xiàn)的野生型的E.coli菌株K-12有8個(gè)IS1,6個(gè)IS2,5個(gè)IS3。由于IS元件的可轉(zhuǎn)座特性，不同菌株具有的ISE數(shù)目不等。2008年8月四川師大生科院張光祥⑵、Hfr的形成就是利用兩個(gè)基因組上IS的同源性重組實(shí)現(xiàn)的野51四、轉(zhuǎn)座子作用可能會(huì)導(dǎo)致DNA重排轉(zhuǎn)座子在其起始區(qū)附近插入另一拷貝時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致DNA重排。宿主系統(tǒng)可能會(huì)在轉(zhuǎn)座子的兩拷貝間采取相應(yīng)的重組，而正向重復(fù)和倒轉(zhuǎn)重復(fù)產(chǎn)生的后果相同。由于拆分酶利用兩個(gè)轉(zhuǎn)座子拷貝進(jìn)行類(lèi)似同源重組而拆分,轉(zhuǎn)座作用是一類(lèi)特殊的重組機(jī)制；轉(zhuǎn)座子作用產(chǎn)生的重復(fù)序列可以導(dǎo)致DNA重排，DNA重排也是按類(lèi)似交換重組的方式進(jìn)行的。四、轉(zhuǎn)座子作用可能會(huì)導(dǎo)致DNA重排轉(zhuǎn)座子在其起始區(qū)附近插入52五、轉(zhuǎn)座子的利用⑴.Ac/Ds(GUS)結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的水稻啟動(dòng)子捕獲系統(tǒng)植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，2005，第31卷第06期⑵轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法克隆分離植物基因胡英考，生物技術(shù)通報(bào)，2003年第02期⑶大規(guī)模誘發(fā)植物基因突變?nèi)斯?gòu)建的轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入植物基因組中，通過(guò)轉(zhuǎn)座子的隨機(jī)轉(zhuǎn)座，建立一種含有大量突變基因，包括轉(zhuǎn)座子已被固定和未被固定的植物轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽突變基因庫(kù)。大規(guī)模地發(fā)現(xiàn)功能基因。2008年8月四川師大生科院張光祥五、轉(zhuǎn)座子的利用⑴.Ac/Ds(GUS)結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的水稻啟動(dòng)子53SystemsforinsertionalmutagenesisTheAcT-DNAvectorcontainsanindoleacetamidehydrolase(IAAH)genethatconferssensitivitytonaphthaleneacetamide(NAM).DscarriestheNPTIIgenethatconferskanamycinresistance,canbepositivelyselectedusingkanamycin.PageDR,20022008年8月四川師大生科院張光祥Systemsforinsertionalmutage54第五節(jié)、拷貝選擇的重組方式簡(jiǎn)介病毒變種A的基因組RNA病毒變種A的基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程短暫停頓模板轉(zhuǎn)換繼續(xù)逆轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶基因組RNA重組的DNA單鏈第五節(jié)、拷貝選擇的重組方式簡(jiǎn)介病毒變種A的基因組RNA病毒變55TheEnd！TheEnd！56演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！57第十三章

遺傳重組方式和轉(zhuǎn)座子的遺傳分析教師：張光祥Email:zhgx-163@163.com生物的遺傳重組概述同源性重組位點(diǎn)特異性重組轉(zhuǎn)座因子及其遺傳效應(yīng)拷貝選擇的重組方式簡(jiǎn)介第十三章

遺傳重組方式和轉(zhuǎn)座子的遺傳分析教師：張光祥生物的遺58第一節(jié)、生物的遺傳重組概述一、遺傳重組的定義、類(lèi)型1、定義：遺傳重組就是已有基因的重新組合或洗牌,其本質(zhì)就是DNA分子的重新組合、DNA序列的替換和拼接。2、自發(fā)的遺傳重組包括五種類(lèi)型：自由組合：不同染色體上的基因之間的重新組合;同源重組：連鎖遺傳中講到的染色體交換;位點(diǎn)特異性重組：依靠一小段特定序列和特定的酶系統(tǒng)進(jìn)行整合(插入)和切出(環(huán)出)過(guò)程。轉(zhuǎn)座：不依賴于同源序列，而是借助于特定重復(fù)序列形成的DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，在轉(zhuǎn)座酶的參與下通過(guò)DNA鏈的切割與重新連接，以此實(shí)現(xiàn)DNA片斷的位置轉(zhuǎn)移；拷貝選擇:病毒在以RNA為模板合成DNA時(shí),如果模板鏈與其它RNA單鏈分子有局部靠近,DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）具有從一條模板鏈轉(zhuǎn)換到另一條鏈上并在新的模板鏈上繼續(xù)轉(zhuǎn)錄合成DNA的能力。由此可從病毒的兩種變體RNA序列產(chǎn)生一個(gè)新的病毒變體。第一節(jié)、生物的遺傳重組概述一、遺傳重組的定義、類(lèi)型1、定義：59自由組合和同源重組主要通過(guò)有性生殖實(shí)現(xiàn)。有性生殖和無(wú)性繁殖兩種方式，哪一種對(duì)生物更有利？3、遺傳重組與有性生殖的關(guān)系英國(guó)羅斯林研究所1997年2月22日宣布用體細(xì)胞克隆綿羊獲得成功，克隆綿羊“多利”成為動(dòng)物界最耀眼的“明星”，在世界上引起巨大震動(dòng)；美國(guó)Clonaid公司02年12月26日宣布，人類(lèi)首個(gè)克隆嬰兒于當(dāng)晚降生，引起世界范圍的極大關(guān)注和對(duì)克隆人的激烈爭(zhēng)論。有兩個(gè)理由讓物種應(yīng)該青睞無(wú)性生殖。首先，在為資源進(jìn)行的斗爭(zhēng)中，無(wú)性生殖物種能輕易地戰(zhàn)勝有性生殖物種。其次,精子和卵子僅包含了雙親各方一半的基因,有性生殖的生物個(gè)體只能將自身50%的基因傳遞給下一代。無(wú)性生殖卻可達(dá)到100%的傳遞率。一個(gè)自稱“無(wú)性族”(asexual)追風(fēng)族群悄然出現(xiàn),討論無(wú)性生活的網(wǎng)站也急劇增加,在歐美日一度成為時(shí)常。然而，有性生殖的最大優(yōu)越性就是基因重組。自由組合和同源重組主要通過(guò)有性生殖實(shí)現(xiàn)。有性生殖和無(wú)性繁殖兩60二、基因重組的生物學(xué)意義如果沒(méi)有遺傳重組,每個(gè)染色體中的基因都會(huì)永遠(yuǎn)固定在一起同生死、共命運(yùn)。然而,基因突變總是不可避免的,且一般是有害的,遲早會(huì)有一些突變基因是害群之馬,使整個(gè)染色體都不能傳遞下去。即使突變基因的有害程度有限,久而久之也會(huì)量變到質(zhì)變,危及到個(gè)體的生存與繁殖能力?；蛑亟M意義可歸結(jié)到一個(gè)“變”字,具體有三條:1、打破連鎖：能夠使有害突變與緊密連鎖的有利突變或重要基因分開(kāi)，從而提供了淘汰有害突變和不良基因、積累有利基因的機(jī)會(huì)。二、基因重組的生物學(xué)意義如果沒(méi)有遺傳重組,每個(gè)染色體中的基因612、保持和發(fā)揮種群內(nèi)遺傳多樣性遺傳多樣性使得種群內(nèi)具有各種各樣的個(gè)體特征特性，但總體來(lái)說(shuō)都是與其生態(tài)環(huán)境相適應(yīng)的。通過(guò)遺傳重組可以產(chǎn)生個(gè)體特征特性更加豐富多彩的子代群體，為適應(yīng)環(huán)境變化提供了更多機(jī)遇；3、有可能產(chǎn)生新的表型變異類(lèi)型通過(guò)基因重組還可能因?yàn)檫B鎖關(guān)系的改變等原因，產(chǎn)生出基因位置效應(yīng)，進(jìn)而出現(xiàn)新的表型變異類(lèi)型。如果沒(méi)有遺傳重組，個(gè)體類(lèi)型就固定下來(lái)，在自然選擇的作用下就會(huì)逐漸單一化，以不變應(yīng)萬(wàn)變是不能長(zhǎng)期堅(jiān)持的。很多在當(dāng)前環(huán)境條下的不利隱性基因也失去了在環(huán)境條件發(fā)生變化后顯露生手的機(jī)會(huì)。2008年8月四川師大生科院張光祥2、保持和發(fā)揮種群內(nèi)遺傳多樣性遺傳多樣性使得種群內(nèi)具有各種各62還有大量的遺傳現(xiàn)象仍是未解之謎，其中有不少與基因重組有關(guān)。比如：Y染色體上有無(wú)足夠的基因重組行為？基因重組的前提是要有兩份拷貝同時(shí)出現(xiàn)在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)，Y染色體上的基因有這種機(jī)會(huì)嗎？請(qǐng)關(guān)注有關(guān)Y染色體的嚴(yán)肅研究。病毒新變種的出現(xiàn)究竟有哪些具體模式？是否還有不為人知的機(jī)制？基因組重排、染色體結(jié)構(gòu)的演化又有哪些具體模式？是否還有不為人知的機(jī)制？其中，病毒起到了哪些具體作用？體細(xì)胞重組的分子機(jī)制與特點(diǎn)也知之甚少。轉(zhuǎn)座子、病毒、附加體、胞質(zhì)基因組等的重組行為？三、研究基因重組的意義1、人類(lèi)對(duì)基因重組機(jī)制的認(rèn)識(shí)還十分膚淺2008年8月四川師大生科院張光祥還有大量的遺傳現(xiàn)象仍是未解之謎，其中有不少與基因重組有關(guān)。比632、研究基因重組有利于更加深入地了解復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象對(duì)基因重組問(wèn)題缺乏了解→困惑難除→荒唐迷思比如X和Y染色體之間不能像一對(duì)同源染色體一樣進(jìn)行頻繁而有效的交換重組。況且，為了產(chǎn)生大量的雄配子，雄性生殖細(xì)胞的分裂和DNA的復(fù)制更為頻繁。而大多數(shù)突變的發(fā)生就與DNA鏈的復(fù)制等暴露機(jī)會(huì)有關(guān)。所以有人估計(jì)，在大概5000代也就是12.5萬(wàn)年后，男人的生殖能力將大約只有現(xiàn)在的1％，最終，男性將不再具有自然生育能力。2005年4月還出版了一本書(shū)《亞當(dāng)?shù)脑{咒：沒(méi)有男人的未來(lái)》，書(shū)中對(duì)男人和他們脆弱的Y染色體作了悲觀的評(píng)述。為此，還有人提出了一個(gè)將男性從人類(lèi)生殖的程序中排除出去的所謂解決方案，就是通過(guò)兩個(gè)卵子的結(jié)合來(lái)生殖，使人類(lèi)成為只有一種性別的女兒國(guó)世界。嚴(yán)肅的科學(xué)研究有助于化解偽科學(xué)問(wèn)題的困擾。2、研究基因重組有利于更加深入地了解復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象對(duì)基因重64第二節(jié)、同源性重組一、同源性重組(homologousrecombination)概述概念、特點(diǎn)、對(duì)等互換式和單向置換式；發(fā)生同源性重組的三個(gè)基本條件。二、真核生物的同源重組Holliday模型、基因轉(zhuǎn)換、Meselson-Radding模型簡(jiǎn)介體細(xì)胞重組三、細(xì)菌的同源重組細(xì)菌部分合子中的重組過(guò)程細(xì)菌整合外源轉(zhuǎn)化DNA的基本特點(diǎn)與可能機(jī)制2008年8月四川師大生科院張光祥第二節(jié)、同源性重組一、同源性重組(homologousre65一、同源性重組概述1、概念：兩個(gè)同源DNA分子或區(qū)段經(jīng)聯(lián)會(huì)和交換而實(shí)現(xiàn)的交換重組，即普遍性重組（generalizedrecombination）。2、同源性重組的兩個(gè)特點(diǎn)：（1）、DNA聯(lián)會(huì)和重組無(wú)嚴(yán)格的堿基序列特異性，兩條DNA只要有足夠長(zhǎng)的同源區(qū)（序列相同或接近），重組就可在同源聯(lián)會(huì)區(qū)的任何一點(diǎn)發(fā)生。基因組內(nèi)的重復(fù)序列→不對(duì)稱聯(lián)會(huì)→重復(fù)、缺失等;遠(yuǎn)緣雜交子代→同源聯(lián)會(huì)→交換重組→代換系；基因搶、微注射等引入的外源DNA→同源重組→整合。（2）、至少涉及聯(lián)會(huì)處一個(gè)DNA片段的斷裂過(guò)程。因此,許多DNA損傷的因素均可促進(jìn)同源重組的發(fā)生。一、同源性重組概述1、概念：兩個(gè)同源DNA分子或區(qū)段經(jīng)聯(lián)會(huì)和663、同源性重組的兩種類(lèi)型（1）、雙向重組：一次重組可產(chǎn)生兩個(gè)重組子；減數(shù)分裂時(shí)，同源染色體聯(lián)會(huì)保證了高頻率的雙向重組。（2）、單向重組：一次重組僅產(chǎn)生一個(gè)重組子；轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、性導(dǎo)和某些病毒的重組等均屬同源重組，但在部分合子中進(jìn)行,不是遺傳物質(zhì)的對(duì)等互換,僅受體發(fā)生重組,因而它們是單向置換式同源性重組。2008年8月四川師大生科院張光祥3、同源性重組的兩種類(lèi)型（1）、雙向重組：2008年8月四川674、發(fā)生同源重組的三個(gè)基本條件兩個(gè)DNA分子的同源區(qū)必須進(jìn)行同源聯(lián)會(huì)(synapsis)。同源區(qū)越長(zhǎng)越有利，同源區(qū)太短，越難于發(fā)生重組。GGggggGGggGGGGggGGggggGGggggGGGG比如糞盤(pán)菌屬的糞生糞殼菌子囊孢子,G黑,g白：GgGgGggGGggGMII分離ggggGGGGGGGGggggMI分離大腸桿菌：活體重組至少要有20-40bp同源區(qū)；與l噬菌體或質(zhì)粒重組要求313bp同源區(qū)?？莶輻U菌基因組與質(zhì)粒重組需要的370bp同源區(qū)。哺乳動(dòng)物：150bp以上同源區(qū)。除了同源性要求外，還需要特定蛋白質(zhì)或酶的參與。2008年8月四川師大生科院張光祥4、發(fā)生同源重組的三個(gè)基本條件兩個(gè)DNA分子的同源區(qū)必須進(jìn)行685、同源重組的基本過(guò)程DNA雙螺旋配對(duì)在兩條同源鏈對(duì)應(yīng)部位切開(kāi)自由末端交換連接連接缺口處未實(shí)現(xiàn)重組連接并完成重組分支遷移拆分后的狀況切開(kāi)兩條互換單鏈形成局部異源雙鏈拆分方式1在分支所在位置切開(kāi)另外兩條鏈拆分方式2分支遷移可向左或向右;遷移距離少則幾十、上百bp,多則可到2kb左右；分支遷移后的拆分可看作一修復(fù)過(guò)程:切開(kāi)兩條單鏈兩條雙螺旋被拆分連接酶封連缺口。2008年8月四川師大生科院張光祥5、同源重組的基本過(guò)程DNA雙螺旋配對(duì)在兩條同源鏈自由末端交69二、真核生物的同源性重組真核生物的染色質(zhì)狀態(tài)對(duì)重組影響，比如異染色質(zhì)及其附近區(qū)域就很少發(fā)生重組。盡管兩條DNA分子間的同源聯(lián)會(huì)和同源性重組沒(méi)有嚴(yán)格的堿基序列特異性，但也存在重組熱點(diǎn)，即某類(lèi)序列發(fā)生重組的概率高于其他序列。真核生物的同源性重組除了對(duì)等互換以外，也有單向重組，如基因組與外源DNA片斷、環(huán)狀DNA小分子(載體)等的同源性重組。HollidayR為了解釋對(duì)等互換式同源性重組的發(fā)生過(guò)程，于1964年提出了Holliday模型。Meselson-Radding為了解釋單向置換式同源性重組的發(fā)生過(guò)程，于1975年提出Meselson-Radding模型。2008年8月四川師大生科院張光祥二、真核生物的同源性重組真核生物的染色質(zhì)狀態(tài)對(duì)重組影響，比如70拆分方式1拆分方式21、Holliday模型ABabABabABabABab切開(kāi)ABab侵入ABab連接ABab分支遷移ABab交叉橋結(jié)構(gòu)Holliday中間體ABba旋轉(zhuǎn)變構(gòu)ABbaABab拆分結(jié)果連接ABbaABab拆分結(jié)果ABab連接拆分方式1拆分1、Holliday模型ABabABa712、基因轉(zhuǎn)換(Geneconversion)⑴、交換重組例外情況的發(fā)現(xiàn)糞生糞殼菌子囊孢子:G黑,g白。MI分離ggggGGGGGGGGggggGg但是,1962年Kitani等在觀察MI型和MII型子囊總共達(dá)127000個(gè)的同時(shí),還發(fā)現(xiàn)了少數(shù)例外。發(fā)生頻率比突變高得多。GGggGGGG2:6型13個(gè)6:2型98個(gè)ggggGGggGGgggGGG3:5型20個(gè)GgggGGgg5:3型108個(gè)gGg/GG/gMⅡ分離ggGGGGggGGggggGGGGggggGGggggGGGGgG2、基因轉(zhuǎn)換(Geneconversion)⑴、交換重組例72⑵、對(duì)異常子囊現(xiàn)象的解釋同源染色體聯(lián)會(huì)時(shí),一個(gè)等位基因轉(zhuǎn)變成了另一等位基因,或被非姊妹染色單體的那個(gè)等位基因置換了。GggGGggGGggGGggGg+ggGGggGGgggggggggggggg2:6++GGggGGGGGGggGGGGgg++++++6:2GGgggGGGGggGGgGGggg+++++5:3GgggGGggGgggGGggggggg3:5+++GggGGggGggGGggGG異常4:4g++++gggg+gg+gg+++++g+/g+g+/gg++/gg+/g⑵、對(duì)異常子囊現(xiàn)象的解釋同源染色體聯(lián)會(huì)時(shí),一個(gè)等位基因轉(zhuǎn)變73⑶、異常子囊的產(chǎn)生機(jī)制等位基因B

G等位基因bACT異常的4:4Gg交換發(fā)生在某個(gè)基因的內(nèi)部時(shí)，按照Holliday模型，在交換發(fā)生部位將產(chǎn)生異源雙鏈區(qū)。異源雙鏈區(qū)通常會(huì)及時(shí)得到修復(fù)。5+:3-3+:5-6+:2-2+:6-親本型4:4⑶、異常子囊的產(chǎn)生機(jī)制等位基因BG等位基因bACT異常743、單向置換式重組Holliday模型不僅解釋了非姊妹染色單體間的互換，也解釋了偶爾出現(xiàn)的不均等分離現(xiàn)象(基因轉(zhuǎn)變現(xiàn)象)。⑴.單鏈切斷⑵.合成新鏈置換舊鏈⑶.單鏈入侵，新鏈繼續(xù)合成⑷.泡切除、不對(duì)稱異源雙鏈區(qū)⑸.鏈同化連接（碎鏈吸收）⑹.異構(gòu)化形成Holliday結(jié)構(gòu)⑺.分支遷移。然而，對(duì)于單向的不對(duì)稱重組現(xiàn)象，Meselson-Radding于1975年提出置換式重組模型：⑴.⑵.⑶.⑷.⑸.⑹.⑺.2008年8月四川師大生科院張光祥3、單向置換式重組Holliday模型不僅解釋了非姊妹染色單754、體細(xì)胞交換重組發(fā)生在有絲分裂過(guò)程中的非姊妹染色單體互換叫體細(xì)胞交換(somaticcrossingover)或有絲分裂交換(mitoticcrossingover)。但是，CurtStern1936年首次發(fā)現(xiàn)，個(gè)別雌果蠅雜合體身上出現(xiàn)了黃斑、焦剛毛斑，以及焦剛毛斑與黃斑相連的孿生斑。yy+++su果蠅有灰體(y+)對(duì)黃體(y)、直剛毛(su+)對(duì)焦剛毛(sn)兩對(duì)性狀，兩對(duì)基因都位于X染色體上。×↓y++suy+這兩對(duì)基因的雌果蠅雜合體應(yīng)該表現(xiàn)為灰體長(zhǎng)直剛毛。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這些斑塊是在個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程中體細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了非姊妹染色單體交換的結(jié)果。2008年8月四川師大生科院張光祥4、體細(xì)胞交換重組發(fā)生在有絲分裂過(guò)程中的非姊妹染色單體互換叫76果蠅體細(xì)胞交換×yy+++suy++suysusu++y++全部體細(xì)胞未交換野生型y++suysusu++y++++ysu+ysu+單個(gè)黃斑suy+++ysu+y++susu+y++ysu+孿生斑y++suysu++suy++su++y+ysu+單個(gè)焦剛毛斑→♂F1y+y++su♀F1黃體直剛毛野生型2008年8月四川師大生科院張光祥果蠅體細(xì)胞交換×yy+++suy++suysusu+77三、細(xì)菌的同源重組細(xì)菌的同源重組包括：部分合子中的重組過(guò)程結(jié)合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、性導(dǎo)等形成部分合子轉(zhuǎn)化等導(dǎo)入的外源DNA的重組過(guò)程F+→Hfr2008年8月四川師大生科院張光祥三、細(xì)菌的同源重組細(xì)菌的同源重組包括：2008年8月四川師大781、細(xì)菌部分合子中的重組過(guò)程⑶.Holliday結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化；⑴.

RecB、RecC、RecD和核酸酶構(gòu)成復(fù)合體RecBCD；RecBCD在聯(lián)會(huì)的兩DNA上識(shí)別chi位點(diǎn)(GCTGGTGG),然后各切斷一條單鏈。E.coli基因組內(nèi)約4kb有一chi位點(diǎn)⑵.RecA蛋白結(jié)合到單鏈DNA上，激活其重組活性；兩條斷開(kāi)的單鏈5`-端被RecA包裹成起來(lái)，交換位置后重新連接，形成“交叉”或四分枝樣的Holliday結(jié)構(gòu)。交叉點(diǎn)向前或向后滑動(dòng)動(dòng)相當(dāng)一段距離(即分枝遷移),形成局部異源雙鏈區(qū),同時(shí)產(chǎn)生一定的正超螺旋扭力;Holliday結(jié)構(gòu)能夠通過(guò)旋轉(zhuǎn)發(fā)生立體異構(gòu)，使“橋”鏈(即連接兩條螺旋的交叉部分)轉(zhuǎn)變?yōu)椤巴獠俊辨?。?將變構(gòu)后的“外部”鏈切開(kāi)兩條螺旋被拆分連接酶封連缺口。2008年8月四川師大生科院張光祥1、細(xì)菌部分合子中的重組過(guò)程⑶.Holliday結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)792、細(xì)菌部分合子同源重組示意圖chi位點(diǎn)：GCTGGTGG2、細(xì)菌部分合子同源重組示意圖chi位點(diǎn)：GCTGGTGG803、細(xì)菌外源轉(zhuǎn)化DNA的整合⑴.基本特點(diǎn)整合(重組)就是指單鏈的轉(zhuǎn)化DNA與受體DNA對(duì)應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行置換，穩(wěn)定地進(jìn)入到受體基因組DNA中。整合(重組)對(duì)同源DNA具有特異性。對(duì)于異源DNA，視親緣關(guān)系遠(yuǎn)近也可發(fā)生不同頻率整合。2008年8月四川師大生科院張光祥3、細(xì)菌外源轉(zhuǎn)化DNA的整合⑴.基本特點(diǎn)整合(重組)就是指81⑵、細(xì)菌遺傳轉(zhuǎn)化的可能方式2008年8月四川師大生科院張光祥⑵、細(xì)菌遺傳轉(zhuǎn)化的可能方式2008年8月四川師大生科院張光祥82第三節(jié)、位點(diǎn)特異性重組一、位點(diǎn)特異性重組的概念位點(diǎn)特異性重組依賴于不同DNA雙螺旋之間很短（幾個(gè)至十幾個(gè)bp）的特定同源序列的。這種特定的序列實(shí)質(zhì)就是能發(fā)動(dòng)位點(diǎn)特異性重組的酶進(jìn)行識(shí)別與結(jié)合的位點(diǎn)。位點(diǎn)特異性重組的結(jié)果是不同DNA分子間的合并（如一個(gè)序列插入另一序列中）或重排。位點(diǎn)特異性重組是一類(lèi)廣泛存在的DNA重組方式，如噬菌體的溶源性反應(yīng)、一些病毒在宿主基因組上的整合、一些基因在DNA水平上的表達(dá)調(diào)控、抗體多樣性的產(chǎn)生等。2008年8月四川師大生科院張光祥第三節(jié)、位點(diǎn)特異性重組一、位點(diǎn)特異性重組的概念位點(diǎn)特異性重組83二、l噬菌體的位點(diǎn)特異性重組1.噬菌體的位點(diǎn)特異性重組，是指噬菌體基因組整合到宿主菌基因組上成為原噬菌體的過(guò)程，也包括原噬菌體從宿主菌基因組上獨(dú)立出來(lái)的過(guò)程。l噬菌體的基因組通過(guò)att位點(diǎn)整合到細(xì)菌染色體，這是一種典型的位點(diǎn)特異性重組過(guò)程。2.噬菌體的位點(diǎn)特異性重組顯然并不包括兩個(gè)噬菌體DNA分子間的重組。red

crocIIOpOri噬菌體顆粒的形成

頭部尾部b2區(qū)與存活無(wú)關(guān)

免疫調(diào)控溶源/裂解復(fù)制晚期控制裂解AWBCDENu3F1F2ZUVGTHMLKIJ

intxisexo

CIIINcIQSR全長(zhǎng)48502

bp

整合.切除與重組Nulatt噬菌體的附著區(qū)二、l噬菌體的位點(diǎn)特異性重組1.噬菌體的位點(diǎn)特異性重組，是843、噬菌體att位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)⑴.l噬菌體的att位點(diǎn)叫attP。通過(guò)缺失實(shí)驗(yàn)證明，attP至少要約250bp長(zhǎng)，太短將使其功能喪失。attP可繞在整合酶分子的周?chē)?lèi)似核小體的結(jié)構(gòu)。⑵.

E.coli的att位點(diǎn)叫attB，約23bp長(zhǎng)即有功能。⑶.attB和attP有一個(gè)相同的15bp核心序列，用Ｏ表示。Ｏ在中間,兩側(cè)的序列稱為臂。(-GCTTTTTTATACTAA-)⑷.attB的兩個(gè)臂分別是B和B’，attB的結(jié)構(gòu)記為BOB`。attP的兩個(gè)臂分別是P和P’，attP的結(jié)構(gòu)記為POP`。體外實(shí)驗(yàn)使用四種成份的混合物：純的整合酶；IHF；鎂離子；噬菌體DNA（具有att和COS末端序列）。–160–140–120–100–80–60–40–20020406080PP’GTTCAGCTTTTTTATACTAAGTTGGCAAGTCGAAAAAATATGATTCAACC2008年8月四川師大生科院張光祥3、噬菌體att位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)⑴.l噬菌體的att位點(diǎn)叫a854、l噬菌體的整合噬菌體在宿主基因組上的整合過(guò)程通過(guò)專一性識(shí)別att位點(diǎn)核心序列的整合酶（Int）進(jìn)行。⑷.整合是非可逆反應(yīng)。⑴.對(duì)核心序列具有強(qiáng)烈親和力的Int識(shí)別attB和attP，并與核心序列結(jié)合；⑵.Int的拓?fù)洚悩?gòu)酶活性使兩條雙鏈都斷開(kāi)一條單鏈，瞬間旋轉(zhuǎn)后交換連接，形成Holliday中間體；⑶.在另兩條單鏈之間發(fā)生同樣的“切開(kāi)—連接”過(guò)程，從而完成雙鏈間的重組。–160–140–120–100–80–60–40–20020406080PP’GTTCAGCTTTTTTATACTAAGTTGGCAAGTCGAAAAAATATGATTCAACCInt識(shí)別序列4、l噬菌體的整合噬菌體在宿主基因組上的整合過(guò)程通過(guò)專一性865、l噬菌體的切離⑴.原病毒兩側(cè)各有一個(gè)雜種att位點(diǎn),左側(cè)由BOP’組成,叫attL；右側(cè)由POB’組成,叫attR。⑵.切離過(guò)程識(shí)別attL和attR，還需要整合酶(Int)、整合宿主因子(IHF)和切除酶(Xis)參與。⑶.切離也是非可逆反應(yīng)。⑸.整合過(guò)程需宿主輔助因子IHF的配合。每一次整合的重組過(guò)程需要20－40個(gè)整合酶分子和約70個(gè)IHF分子。說(shuō)明這兩種蛋白不僅僅是酶(起催化作用)，而且在形成某種復(fù)合物結(jié)構(gòu)中起著重要作用。2008年8月四川師大生科院張光祥5、l噬菌體的切離⑴.原病毒兩側(cè)各有一個(gè)雜種att位點(diǎn),左側(cè)87三、RNA病毒在宿主基因組上的整合反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制需要利用宿主細(xì)胞的很多資源，包括DNA復(fù)制系統(tǒng)的利用。所以病毒具有反轉(zhuǎn)錄酶基因，將自身RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。病毒基因組cDNA有兩個(gè)去向，一是不斷大量復(fù)制并表達(dá)外殼蛋白，然后包裝和釋放；二是整合到宿主基因組內(nèi)。病毒編碼的整合酶可特異地識(shí)別反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(longterminalrepeat,LTR)，然后完成整合。RNA病毒在宿主基因組上的整合過(guò)程也屬于位點(diǎn)特異性重組。2008年8月四川師大生科院張光祥三、RNA病毒在宿主基因組上的整合反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制需要利用宿88四、細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組舉例沙門(mén)氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變：H片斷hixrH1hinPPH2PH2hixH2鞭毛蛋白H片斷hixrH1hinPPH2PH2hixHinH2鞭毛蛋白阻遏蛋白hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特異位點(diǎn)重組（倒位）。H片段上有兩個(gè)啟動(dòng)子P,其一驅(qū)動(dòng)hin基因表達(dá)，另一正向時(shí)驅(qū)動(dòng)H2和rH1基因表達(dá)，倒位時(shí)H2和rH1不表達(dá)。rH1為H1的阻遏蛋白基因。2008年8月四川師大生科院張光祥四、細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組舉例沙門(mén)氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變：89五、免疫球蛋白基因的位點(diǎn)特異性重排重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點(diǎn)上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號(hào)序列(recombinationsignalsequence,RSS)。CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCAC(12/23)TGTTTTTGG重組信號(hào)序列RSS輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：LVJCLV

D

JC此重排的重組酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有兩個(gè)，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和RAG2。V片段J片段RSSRSS間隔DNA單鏈切開(kāi)RAG1RAG2OHOH分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)轉(zhuǎn)移核苷酸修復(fù)、連接V片段J片段2008年8月四川師大生科院張光祥五、免疫球蛋白基因的位點(diǎn)特異性重排重鏈(IgH)基因的V-D90第四節(jié)、轉(zhuǎn)座因子及其遺傳效應(yīng)基因組是相對(duì)穩(wěn)定的，各種序列通常處于相對(duì)恒定的位置。因此，可以通過(guò)遺傳圖標(biāo)示基因的基因座。一、轉(zhuǎn)座因子的概要1、概念：轉(zhuǎn)座因子(transposable

factor)是基因組內(nèi)有明確界限、不必借助噬菌體或質(zhì)粒就可從一個(gè)部位直接轉(zhuǎn)移到另一個(gè)部位的DNA序列,這個(gè)過(guò)程稱為轉(zhuǎn)座或轉(zhuǎn)座作用(transposition)。轉(zhuǎn)座因子又叫轉(zhuǎn)位元、可轉(zhuǎn)座元件(transposableelement)等。轉(zhuǎn)座因子的三種類(lèi)型：插入因子轉(zhuǎn)座子(transposon)即復(fù)合型可轉(zhuǎn)座因子病毒型轉(zhuǎn)座因子，包括可轉(zhuǎn)座噬菌體（transposablephage）。2008年8月四川師大生科院張光祥第四節(jié)、轉(zhuǎn)座因子及其遺傳效應(yīng)基因組是相對(duì)穩(wěn)定的，各種序列通常912、轉(zhuǎn)座因子的特點(diǎn)⑴.轉(zhuǎn)座子每次移動(dòng)都帶著轉(zhuǎn)座必需的基因一起躍遷,所以轉(zhuǎn)座子又稱跳躍基因(jumpinggene)。⑵.轉(zhuǎn)座的發(fā)生無(wú)需轉(zhuǎn)座子和靶位點(diǎn)之間的序列同源性。⑶.轉(zhuǎn)座發(fā)生頻率通常很低,而且轉(zhuǎn)座插入點(diǎn)是隨機(jī)的。⑷.各種轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座皆需轉(zhuǎn)座酶(transposase)。⑸.轉(zhuǎn)座子兩端都有重復(fù)序列，轉(zhuǎn)座需要識(shí)別靶序列。2008年8月四川師大生科院張光祥2、轉(zhuǎn)座因子的特點(diǎn)⑴.轉(zhuǎn)座子每次移動(dòng)都帶著轉(zhuǎn)座必需的基因一起923、轉(zhuǎn)座子的發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座元件首先由BarbaraMcClintock于40年代在玉米的遺傳研究中發(fā)現(xiàn)的，她稱之為控制元件（controllingelement），因?yàn)樗粌H能夠在基因組內(nèi)轉(zhuǎn)移，而且還能夠改變基因的活性并引起功能的改變?，F(xiàn)在認(rèn)為轉(zhuǎn)座子存在于地球上所有的生物。轉(zhuǎn)座子的擴(kuò)增可能通過(guò)產(chǎn)生有害的結(jié)果而得到平衡。2008年8月四川師大生科院張光祥3、轉(zhuǎn)座子的發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座元件首先由BarbaraMcClint93二、轉(zhuǎn)座因子的簡(jiǎn)介1、IS因子（insertionsequences）IS是最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座因子。IS元件是細(xì)菌染色體和質(zhì)粒的正常組成部分。最早被鑒定的轉(zhuǎn)座元件是細(xì)菌操縱子中的自主插入序列。166bp166bpAATCACCCTTCCACGCTTATTC……GAATAAGCGTGGAAGGCCAATCTTAGTGGGAAGGTGCGAATAAG……CTTATTCGCACCTTCCGGTTAG插入的IS因子IS5IS元件是獨(dú)立的結(jié)構(gòu)單位，每個(gè)元件只編