二維核磁共振譜課件

二維核磁共振波譜法二維核磁共振(2DNMR)方法是Jeener于1971年首先提出的,是一維譜衍生出來的新實驗方法。引入二維后,

不僅可將化學(xué)位移、偶合常數(shù)等參數(shù)展開在二維平面上，減少了譜線的擁擠和重疊,

而且通過提供的HH、CH、CC之間的偶合作用以及空間的相互作用，確定它們之間的連接關(guān)系和空間構(gòu)型，有利于復(fù)雜化合物的譜圖解析，特別是應(yīng)用于復(fù)雜的天然產(chǎn)物和生物大分子的結(jié)構(gòu)鑒定。2DNMR也是目前適用于研究溶液中生物大分子構(gòu)象的唯一技術(shù)。1第一節(jié)基本原理

NMR一維譜的信號是一個頻率的函數(shù)，共振峰分布在一個頻率軸（或磁場）上，可記為S(ω)。二維譜信號是二個獨立頻率（或磁場）變量的函數(shù)，記為S(ω1,ω2),共振信號分布在兩個頻率軸組成的平面上。也就是說2DNMR將化學(xué)位移、偶合常數(shù)等NMR參數(shù)在二維平面上展開，于是在一般一維譜中重迭在一個坐標軸上的信號，被分散到由二個獨立的頻率軸構(gòu)成的平面上，使得圖譜解析和尋找核之間的相互作用更為容易。不同的二維NMR方法得到的圖譜不同，二個坐標軸所代表的參數(shù)也不同。2一、1D-NMR到2D-NMR的技術(shù)變化（一）一維核磁共振譜及脈沖序列基本脈沖序列:33、混合期：由一組固定長度的脈沖和延遲組成。在此期間通過相干或極化的傳遞，建立檢測條件?；旌掀谟锌赡懿淮嬖?，它不是必不可少的（視二維譜的種類而定）4、檢測期：在此期間檢測作為t2函數(shù)的各種橫向矢量的FID的變化，它的初始相及幅度受到t1函數(shù)的調(diào)制。

與t2軸對應(yīng)的ω2（F2軸），通常是化學(xué)位移，與t1軸對應(yīng)的ω1（F1軸）是什么，取決于二維譜的類型。2、演化期：在t1開始時由一個脈沖或幾個脈沖使體系激發(fā)，使之處于非平衡狀態(tài)。t1=t+nΔt，逐步延長，其對應(yīng)的核磁信號的相位和幅值也就不相同。5t1=t+nΔt實驗過程：二維核磁共振譜數(shù)據(jù)矩陣數(shù)據(jù)矩陣對t2FT數(shù)據(jù)矩陣對t1FTF2F16

用固定時間增量⊿t1依次遞增t1進行系列實驗，反復(fù)疊加，因t2時間檢測的信號S(t2)的振幅或相位受到s(t1)的調(diào)制，則接收的信號不僅與t2有關(guān)，還與t1有關(guān)。每改變一個t1，記錄S(t2),

因此得到分別以時間變量t1,

t2為行列排列數(shù)據(jù)矩陣，即在檢測期獲得一組FID信號，組成二維時間信號S(t1,t2)。因t1,t2是兩個獨立時間變量，可以分別對它們進行傅立葉變換，一次對t2,一次對t1,兩次傅立葉變換的結(jié)果，可以得到兩個頻率變量函數(shù)S(ω1,ω2)的二維譜。7二、常用2D-NMR圖譜的表現(xiàn)形式1.堆積圖堆積圖的優(yōu)點是直觀,具有立體感.缺點是難以確定吸收峰的頻率。大峰后面可能隱藏小峰，而且耗時較長。8β-紫羅蘭酮102.交叉峰交叉峰也稱為相關(guān)峰，它們不在對角線上，即坐標F1≠F2。交叉峰顯示了具有相同偶合常數(shù)的不同核之間的偶合（交叉）。交叉峰有兩組，分別出現(xiàn)在對角線兩側(cè)，并以對角線對稱。這兩組對角峰和交叉峰可以組成一個正方形，并且由此來推測這兩組核A和X有偶合關(guān)系。21534F2F15432112第二節(jié)二維J分解譜二維J分解譜是將不同的NMR信號分解在兩個不同的軸上，使重疊在一起的一維譜的化學(xué)位移δ和偶合常數(shù)J分解在平面兩個坐標上，提供了精確的偶合裂分關(guān)系，便于解析。二維J分解譜分為同核和異核J分解譜。一、氫、氫同核二維J分解譜同核二維J分解譜將1HNMR中重迭密集的譜線多重峰結(jié)構(gòu)展開在一個二維平面上，可將偶合常數(shù)3JHH（或2JHH)與化學(xué)位移分別在F1、F2二個軸上給出。14在同核1H,1H－2DJ分解譜中，被測定的核為1H核。15反式丙烯酸乙酯的1H－1H同核二維J分解譜161/2JHH1718二、碳、氫異核二維J分解譜在異核13C,1H－2DJ分解譜中，被測定的核為13C核，分解譜的F2軸為13C化學(xué)位移δC，F(xiàn)1軸為1H與13C的偶合(1JCH)多重峰，為1/2JCH。出峰情況是CH為二重峰，CH2為三重峰，CH3為四重峰，季碳單峰或不出峰。20反式丙烯酸酯的13C,1HJ分解2D譜。

F2軸為13C的化學(xué)位移。F1軸為1JCH偶合的多重峰。21第三節(jié)同核化學(xué)位移相關(guān)譜一、氫、氫化學(xué)位移相關(guān)譜

1H-1H-COSY是1H核和1H核之間的化學(xué)位移相關(guān)譜。在通常的橫軸和縱軸上均設(shè)定為1H的化學(xué)位移值，兩個坐標軸上則顯示通常的一維1H譜。（1H-1HCorrelationspectroscopy，1H-1HCOSY）在該譜圖中出現(xiàn)了兩種峰，分別為對角峰及相關(guān)峰。同一氫核信號將在對角線上相交，相互偶合的兩個/組氫核信號將在相關(guān)峰上相交，一般反映的是3J偶合。231H-1HCOSY-900基本脈沖序列： 一般說來，在解析1H-1HCOSY譜時，應(yīng)首先選擇一個容易識別，有確切歸屬的質(zhì)子，以該質(zhì)子為起點，通過確定各個質(zhì)子間的偶合關(guān)系，指定分子中全部或大部分質(zhì)子的歸屬，這就是我們通常所說的“從頭開始”法。24162627ArH-CH3-CH-CH2-CH2-CH2285H5/H2J偶合30二、碳、碳化學(xué)位移相關(guān)譜這是二維碳骨架直接測定法，是確定碳原子連接順序的實驗，采用一種天然豐度雙量子相干（INADEQUATE）技術(shù)進行測定。碳是組成分子骨架，它更能直接反映化學(xué)鍵的特征與取代情況。但是由于13C天然豐度僅僅為1.1%，出現(xiàn)相連13C-13C偶合的幾率為0.01％，使1JC-C測試非常困難,信號累加時間達兩天，只在迫不得以才做。兩個偶合的13C核能產(chǎn)生雙量子躍遷，躍遷頻率相等，孤立的碳則不能。31

2DINADEQUATE譜圖有兩種形式，第一種形式，F(xiàn)2軸是13C的化學(xué)位移，F(xiàn)1為雙量子躍遷頻率，水平連線表明一對偶合碳具有相同的雙量子躍遷頻率，可以判斷它們是直接相連的碳。另一種形式，F(xiàn)2軸F1軸都是13C的化學(xué)位移，相互偶合的碳核作為一對雙峰出現(xiàn)在對角線兩側(cè)對稱的位置上。依此類推可以找出化合物中所有13C原子連接順序。32332143567OHHO6-75-64-51-22-33-41423567F2F1346,75,127,118,108,95,1010,116,123513C-13C2DINADEQUATEspectrumofmenthol

F1(δ13C)F2(δ13C)103426185793,43,2422,181516,15,6 76 1,78,9 8,10910

4,8 4,5F2(δ13C)F1(δ13C)36一、13C檢測的異核化學(xué)位移相關(guān)譜所謂異核化學(xué)位移相關(guān)譜是兩個不同核的頻率通過標量偶合建立起來的相關(guān)譜.應(yīng)用最廣泛的是1H-13CCOSY。第三節(jié)異核化學(xué)位移相關(guān)譜

13C-1HCOSY譜圖中F2為13C化學(xué)位移，F(xiàn)1為1H化學(xué)位移，沒有對角峰，其交叉峰表明C-H相連偶合的信息，季碳不出交叉峰。解析時，可以從一已知的氫核信號，根據(jù)相關(guān)關(guān)系，即可找到與之相連的13C信號，反之亦然?？梢詮淖V圖中得到1JC-H的結(jié)構(gòu)信息。37385’32D13C-1HCOSYspectrum(1JCHcorrelations)2a2e1’2166’5C1,H1aC1,H1eC2,H2aC2,H2eC1’,H1’C4,H4C2’,H2’ C4’,H4’ C3,H34’2’41’3’

1a 1eδ1Ηδ13CF1F2C5,H5 C6’,H6’ C6,H63940 常規(guī)的13C檢測的異核直接相關(guān)譜，靈敏度低，樣品的用量較大，測定時間較長。HMQC（異核多量子相關(guān)譜）技術(shù)很好地克服了上述缺點，HMQC實驗是通過多量子相干，檢測1H信號而達到間接檢測13C的一種方法二、1H檢測的異核多量子相關(guān)譜（HMQC）HMQC(異核多量子相干譜)的優(yōu)點脈沖序列較簡單，參數(shù)設(shè)置容易。反式檢測氫維(f2)分辨率較高，靈敏度較高。缺點碳維(f1)分辨率低.—C1

—C2—C3—C4—H1H2H3H441HMQC是將1H信號的振幅及相位分別依13C化學(xué)位移及1H間的同核化學(xué)偶合信息調(diào)制，并通過直接檢測調(diào)制后的1H信號，獲得13C-1H化學(xué)位移相關(guān)數(shù)據(jù)。它所提供的信息及譜圖與1H-13CCOSY完全相同。圖上F2坐標是1H的化學(xué)位移,F1是13C化學(xué)位移，直接相連的13C與1H將在對應(yīng)的13C化學(xué)位移與1H化學(xué)位移的交點處給出相關(guān)信號。不能得到季碳的結(jié)構(gòu)信息。42HMQC譜434423678945三、1H檢測的異核單量子相關(guān)譜（HSQC）HSQC(HeteronuclearSingleQuantumCorrelation)與HMQC相似，也是通過1JCH偶合常數(shù)實現(xiàn)碳氫相關(guān)。相干傳遞是通過單量子相干機理。下面是基本的HSQC脈沖序列：1Ht1/2d1t1/213CDec.d2d2d2d2d2=1/41JCHHSQC譜的靈敏度比HMQC高，但HSQC包含較多射頻脈沖，要求實驗參數(shù)精確設(shè)置，否則誤差偏大。圖譜形式和解譜方法與HMQC相同。46

HMBC是heteronuclear

multipule

bond

correlation

的縮寫，表示異核遠程（多鍵）相關(guān)譜。與HMQC一樣，HMBC的譜圖也是是一種間接檢測實驗，是通過檢測H間接檢測C信號。橫坐標F2代表采樣的H

NMR的化學(xué)位移，縱坐標F1代表的是間接檢測的C

NMR的化學(xué)位移。相隔2-4個化學(xué)鍵相連的C、H原子就會在譜圖上出現(xiàn)交叉峰，即只要有交叉峰的出現(xiàn)，那么交叉峰所對應(yīng)的H、C原子是通過2-4個化學(xué)鍵相連的（4J相連的交叉峰不一定出現(xiàn)）。

四、1H檢測的異核多量子遠程相關(guān)譜HMBC47根據(jù)HMBC譜所給出的H、C之間的關(guān)系，結(jié)合HMQC的譜圖，我們就能夠解決C原子的連接順序問題，這樣我們就能基本上確定有機化合物的骨架結(jié)構(gòu)，基本上一個有機化合物的結(jié)構(gòu)就能夠確定了。HMBC的主要問題在于并不能夠確定相關(guān)峰是二鍵、三鍵還是四鍵的耦合(四鍵偶合較少出現(xiàn))。HMBC可高靈敏度地檢測13C-1H遠程偶合，因此可得到有關(guān)季碳的結(jié)構(gòu)信息及其被雜原子或季碳切斷的偶合系統(tǒng)之間的結(jié)構(gòu)信息。48C2,C3andC4:QuaternaryorprotonatedcarbonsX:O,NHMQC是通過異核多量子相干把1H核和與其直接相連的13C核關(guān)聯(lián)起來，HMBC則是通過異核多量子相干把1H核和遠程偶合的13C核關(guān)聯(lián)了起來。HMBC是突出表現(xiàn)相隔2個至4個鍵的碳氫之間的偶合，交叉峰為單峰。但由于技術(shù)上的原因，有時不能完全去掉直接相連的碳氫之間的偶合1JCH,交叉峰表現(xiàn)為雙峰或三峰，中心對應(yīng)δH，解析圖譜時要特別注意。49789654312987623確定H2確定C2-C=OH3與C5五交叉峰503鍵偶合3鍵偶合51HMQC52HMBC53第五節(jié)二維NOE譜一、二維NOESY二維NOE譜簡稱為NOESY，它反映了有機化合物結(jié)構(gòu)中H核與H核之間空間距離的關(guān)系，而與二者間相距多少根化學(xué)鍵無關(guān)。因此對確定有機化合物結(jié)構(gòu)、構(gòu)型和構(gòu)象以及生物大分子（如蛋白質(zhì)分子在溶液中的二級結(jié)構(gòu)等）有著重要意義。909090t1tm54NOESY的譜圖與1H-1HCOSY非常相似，它的F2維和F1維上的投影均是氫譜，也有對角峰和交叉峰，圖譜解析的方法也和COSY相同，唯一不同的是圖中的交叉峰并非表示兩個氫核之間有耦合關(guān)系，而是表示兩個氫核之間的空間位置接近。由于NOESY實驗是由COSY實驗發(fā)展而來為的，因此在圖譜中往往出現(xiàn)COSY峰，即J偶合交叉峰，故在解析時需對照它的1H-1HCOSY譜將J偶合交叉峰扣除。55NOESY(H-3,H-2)交叉峰為J偶合峰5615867CH2NOESY-CH35758

2DNOESYspectrumofailanthoneacbda,cb,d

NOEc bdaNOE59二、二維ROESYNOESY譜是確定化合物立體結(jié)構(gòu)時普遍應(yīng)用的一種二維技術(shù)，但對于中等大小的分子（分子量約為1000-3000），有時NOE的增益為零，從NOESY譜上得不到相關(guān)的信息。而旋轉(zhuǎn)坐標系中的NOESY，我們稱之為ROESY譜則有效地克服了上述NOESY譜的不足，是一種解決中等大小化合物立體結(jié)構(gòu)的理想技術(shù)，ROESY譜的解析方法和說明的問題與NOESY譜一致。60第六節(jié)一維、二維譜綜合解析一維譜的初步解析：分析一維1H譜，根據(jù)譜圖中化學(xué)位移值、耦合常數(shù)值、峰形和峰面積找出一些特征峰，并確定各譜線的大致歸屬和氫分布，確定O,N等雜原子的可能的連接。分析一維C譜，對照13C質(zhì)子噪聲去偶譜以及各個DEPT碳譜，確定各碳原子的級數(shù)和各譜線的大致歸屬，確定O,N等雜原子的可能的連接。一、解析步驟61解析H-HCOSY譜，從一維譜中已經(jīng)確定的氫譜線出發(fā)找到與之相關(guān)的其它譜線。解析13C-1HCOSY（HMQC、HSQC）譜，同樣從已知的氫譜線出發(fā)找到各相關(guān)的碳譜線，以此推斷出這些碳譜線的歸屬。解析13C-1H遠程相關(guān)譜（HMBC），從已確定的碳譜線出發(fā)，找到與之相關(guān)的各氫譜線或從已知的氫譜線出發(fā)找到各相關(guān)的碳譜線，由此完成對一些未知譜線的指認。借助二維核磁共振譜對圖譜作進一步的指認：注意排除一維譜與二維譜中的溶劑峰與雜質(zhì)峰62某化合物的分子式為C6H10O，請根據(jù)下列各譜推斷結(jié)構(gòu)1H2H1H1H1H2H2HU=2二、解析實例63=CH2=CH-CH-CH2-CH2-CH22156436412211234C2-H25435543666/C1-H1H2-H3-H4-H5-H6,H6/H3-C3H4-C4H5-C5C6-H6,H6/或H6,H6/-C6HMQC1H-1H-COSY65

123413244231The1HNMRspectrumof2,3-dihydrofuran(F)showsresonancesat2.6(2H),4.2(2H),4.9(1H),6.2(1H)PPM.The13Cspectrumof(F)containsresonancesat28.5,68.6,98.4and145.0PPM.C4H6OU=2H,HCOSYHMQC661HNMR面積積分1