核醫(yī)學體外放射分析課件

體外放射分析

體外放射分析1分類：1、

競爭性：放射免疫分析RIA競爭性蛋白結合分析CPBA放射受體分析RRA放射酶分析放射微生物分析2、非競爭性：免疫放射分析IRMA分類：2一、放射免疫分析RIA原理：P62競爭機制：Ag(不定量)+Ab（有限量）固定量*Ag免疫結合反應形成免疫復合物一、放射免疫分析RIA3定量分析的數(shù)學基礎：免疫結合反應服從質量作用定律P+Q===PQ[PQ]K=---------[P][Q]K值大表示親和力大定量分析的數(shù)學基礎：4由質量作用定律推導的數(shù)學模型[Q0]1[Q0]B2—B（1+------+--------）+-------==0[P0]K[P0][P0]

[PQ]B==----------×100%P0=Ag+*AgPQ=*Ag—Ab[P0]Q0=Ab的初始含量當*Ag為固定量時，P0為自變量（實際為Ag）P0與復合物B呈一定的函數(shù)關系由質量作用定律推導的數(shù)學模型5放免反應的定量依據(jù)：

劑量反應曲線或叫標準曲線劑量反應曲線的含義以已知的標準品為橫坐標，以放射性復合物測定值的某種表達式做縱坐標，繪制劑量---反應曲線P64圖4—1P74圖4—13放免反應的定量依據(jù)：6曲線的斜率是關鍵因素，斜率不同精密度不同（P64圖4—1）

斜率=tgα（代表曲線或直線的傾斜度）

影響斜率的常見因素有以下幾點：1、Ab親和力：K大，斜率也大2、Ag用量：Ag少，斜率大3、Ag的免疫活性：活性強，斜率大4、*Ag的比活度和放化純度：↑→↑5、Ab用量：B=33—50%斜率最大。6、反應條件和溫度（見后）曲線的斜率是關鍵因素，斜率不同精密度不同（P64圖4—1）7免疫反應條件要求：1、PH：大多PH=7.52、離子強度：常用0.05—0.1M3、反應溫度：實驗確定免疫反應條件要求：8RIA方法學1、操作步驟：P1942、RIA的基本試劑標準抗原基本要求：①標準抗原與待測物免疫性必須一致②必須高純度：不純不能制備抗體，不純標記物放化純度達不到要求③標準抗原的量必須準確：（用于標準曲線）④具有良好的穩(wěn)定性（能保證較長時間不改變性能）標準抗原的用途：①制備抗體②制備*Ag③標準曲線RIA方法學9抗血清檢查抗血清的指標：1、親和常數(shù)KP1922、交叉反應率P1933、滴度

標記抗原Ag*基本要求：①免疫活性與待測物及標準品一致②適度的比活度：太高、化學量少、不具競爭性，太低統(tǒng)計誤差大。③足夠高的放化純度（>95%）抗血清10免疫活性檢驗：復合物放射性最大結合百分率（B%）=-----------------------------------×100%參與反應標記抗原放射性分離方法非特異分離法：吸附法（活性炭）層析電泳法過濾法磁性分離法沉淀法（聚乙二醇，硫酸胺等）免疫活性檢驗：11

特異分離法：

雙抗法固相分離法 葡萄球菌A蛋白（SPA）補充：對分離方法的基本要求

1、使結合部分與游離部分盡可能完全分開2、分離的成份便于放射性測量3、分離效果不受外界干擾因素的影響4、操作簡便、分離迅速、重復性好5、與游離標記物的非特異結合盡可能小6、試劑來源廣泛，經濟價廉

特異分離法：12RIA加樣方法1、平衡法：三種反應物同時加樣 優(yōu)：簡便易掌握重現(xiàn)性好 競爭反應較典型 缺：靈敏度不高2、順序加樣法：Ag+Ab溫育后再加*Ag優(yōu)：標準曲線起始段斜率高、靈敏度高缺：曲線工作波度范圍窄、重現(xiàn)性差3、一天法：（特殊情況下使用）RIA加樣方法13樣品采集與保存應注意的幾個問題

①

用原樣品、新鮮樣品、減少存放、最好不純化、濃縮萃取、減少變異②

盡快做實驗，避免反復凍融③

盡可能少用添加劑等，抗凝劑也少用。

RIA數(shù)據(jù)處理的數(shù)學模型（補充概念）后頁

樣品采集與保存應注意的幾個問題

RIA數(shù)據(jù)處理的14放射免疫法的數(shù)學模型及處理常用符號及英文縮寫的含意：NSB：非特異結合B0%：B0管的放射性測量值與加入總放之比。BQC：質控探樣品測量值CPMBN：NSB管的樣品測量值CPMF：游離物質樣品測量值CPMB：結合的沉淀物樣品測量值CPMED50：指B/B0為50%時對應劑量值。ED25、ED70指B/B0為25%、70%所對應的劑量。放射免疫法的數(shù)學模型及處理15

曲線模型分類1、針對劑量反應的實際曲線模型： 如多項式函數(shù)，光滑樣條函數(shù)，線性內插模型2、直線化模型：（logit—log模型）常用：將標準曲線橫坐標各點取對數(shù)lgX而縱坐標用logitBx/B0,logitBx/B0=lgBx/B0—Bx該直線法標準曲線的零點丟失（零無對數(shù)）造成靈敏度降低

曲線模型分類163、logistic模型：只能用于平衡反應兩點改進

a：橫坐標不取對數(shù)而用Db：不做NSB，靠計算機計算擬合扣除NSB。a—d模型：Y=------------------+dx1+(------)bc有四個參數(shù)：a=B0（也稱四參數(shù)logistic模型）c=ED50b=logit—log直線斜率d=NSB3、logistic模型：只能用于平衡反應174、五參logistic數(shù)模型：a—bY=---------------+dx[1+(----)b]Ec引入了一個不對稱因子E。E計算機能求出?？捎糜诜瞧胶夥磻到y(tǒng)4、五參logistic數(shù)模型：185、四參數(shù)單位點質量作用定律模式：按質量作用定律導出的模式優(yōu)點：①質量作用定律，穩(wěn)健回歸擬合；②適于平衡和非平衡系統(tǒng)；③個別壞點對曲線影響小。模型的選擇（擬合優(yōu)度法來選）問題：一組數(shù)據(jù)可用多種模型去處理，如何選用？①

線性擬合用最小二乘法，選殘差平方和最小的模型。②

非線性擬合用百分比偏差DEV%DEV%=（X’—X）/X100% DEV%<10%即可使用。5、四參數(shù)單位點質量作用定律模式：19放射免疫的質量控制RIA的誤差來源：試劑（變性，核素脫落、貯存不當免疫活性↙等）樣品（放置不當，存放條件不同，制備、采集的差異等）操作（加樣不準，反應條件改變、分離不統(tǒng)一等）儀器與設備（不統(tǒng)一，差異等）測量（統(tǒng)計漲落）數(shù)據(jù)處理：擬合不當、方法不一致等。放射免疫的質量控制20誤差分類系統(tǒng)誤差：原因是確定因素如試劑變性，稱量不準，批號不同。隨機誤差：原因屬偶然，難以確定，測量結果忽高忽低呈雙向圍某數(shù)值波動。過失誤差：過失造成的誤差，結果失真無規(guī)律性可查。質控目的：找出誤差原因、采取必要措施，保證實驗結果的可信性。質控分類實驗室內質控實驗室間質控誤差分類21常用的質控指標：靈敏度、特異性、精密度、偏差、準確度、穩(wěn)定性、臨床有效性。1、靈敏度：10個B0管均值減去2SD后在標準曲線上查得的劑量值。2、特異性：用交叉反應率來表示3、精密度：同一樣品多份測量結果變異的大小。SD可用SD或CV=-------×100%X4、偏差：偏離真值的程度測定值—真值 偏差b=--------------------×100%真值核醫(yī)學體外放射分析課件225、準確度：測量值與真值的符合程度，也叫回收率 回收管測量值—對照管測量值回收率=-----------------------------------------×100%回收管內加入的已知量反應準確度評價指標 在空白樣品中加入已知劑量的待測物得測定值—空白值樣品回收率=-----------------------×100%已知值

回收率應在90~110%之間

5、準確度：測量值與真值的符合程度，也叫回收率23測定值—真值偏差=-----------------------------×100%真值偏差允許在±10%之內。

注意：測定值應取高、中、低三個劑量區(qū)的樣品分別求出高、中低三個劑量的回收率和偏差。測定值—真值246、穩(wěn)定性：指批間重復性。對曲線穩(wěn)定性考核的常用指標有：ED25、ED50、ED75、B0%、NSB%等。 不同批實驗中這些值應大體接近。7、臨床有效性：陽性率與臨床診斷的符合率。與正常值的確定有關。上述幾種指標間的關系；靶圖。 若某點的CV%大于10%應做為壞點剔除。6、穩(wěn)定性：指批間重復性。對曲線穩(wěn)定性考核的常用指標有：ED25反應精密度的幾個指標（1、2、3）：1、平均批變異系數(shù)（ABCV）：指一批實驗數(shù)據(jù)的CV平均值：∑SDABCV%=------------------------------×100%∑X2、反應誤差關系（RER）：指一批實驗各復管的SD與其X之間的函數(shù)關系。SD為CPM的誤差。它是反應實驗復管平行性好壞的綜合指標，不是劑量的誤差。RER的計算公式見P85，4—23RER≤0.04優(yōu)秀0.12<RER>0.04<0良好RER>0.12差反應精密度的幾個指標（1、2、3）：263、精密度圖（P、P圖）：以劑量lgD為橫坐標，以各劑量復管的SD為縱坐標做的圖。P、P圖步驟：1）

建立劑量反應曲線2）

計算各樣品的放射性測量值X和誤差SDR3）

將放射性的X和SDR通過劑量反應曲線查得劑量D并計算D的SD即SD0，或換為SD0/D=CV%4）

以LgD為橫坐標：以CVD或SDD為縱坐標做圖。3、精密度圖（P、P圖）：以劑量lgD為橫坐標，以各劑量復管27P．P圖的用途1）

確定方法的靈敏度2）

確定劑量反應曲線的有效工作范圍3）

評價RIA的最佳工作條件4）

RIA的質控評價5）

判斷剔除壞點P．P圖的用途283、健全性試驗：指用標準品繪制的標準曲線與用不同釋稀度病人樣品繪制的曲線應平行。 影響健全性的因素：a.標準品與待測物性質不同b.反應系統(tǒng)有干擾反應c.待測物在標準品確定的環(huán)境中不適宜。3、健全性試驗：指用標準品繪制的標準曲線與用不同釋稀度病人樣294、youden圖：在多批實驗中每一實驗測量的首部和尾部放置二個相同濃度的質控樣品，將其測量值求X±SD。在直角坐標中，做圖如下： QC—H首 QC—MQC—L QC首 首樣品 2SDABD尾樣品QC尾 A區(qū)：準確區(qū) B區(qū)：正偏差區(qū) C區(qū)：負偏差區(qū) D區(qū)：不精密區(qū)意義：一種簡便，直觀、有效地評價精密度和偏倚的方法。4、youden圖：在多批實驗中每一實驗測量的首部和尾部放置305、Cusum圖：把每批實驗的QC測定值與靶值相減后做圖。評價：1）小斜線連續(xù)上升或下降提示有正、負偏差2）小斜線的斜率反映偏差的大小3）斜線兩端點落差的絕對值超出QC的3SD說明有偏差出現(xiàn)，超出5SD說明有明顯偏差，數(shù)據(jù)不可靠。5、Cusum圖：把每批實驗的QC測定值與靶值相減后做圖。31反映穩(wěn)定性的評價指標可有Cusum圖、質控圖等。 質控圖（Shewart作用法）或Levey—Jennings：可選多種參數(shù)如B0、NSB%、EOX、QC0假如選QC，求出它的SD（需多批可靠實驗求出平均SD值）。 然后作圖：以后的實驗中測得的QCSD可用該圖評價。 正常要求：大于±2SD不得超過5%大于±3SD不得超過1%反映穩(wěn)定性的評價指標可有Cusum圖、質控圖等。32如果有下列情況之一發(fā)生，說明實驗失敗、應舍棄該批數(shù)據(jù)：1）

三個QC樣品有一個SD大于3SD2）

三個QC樣品有二個SD大于2SD3）

三個QC樣品都同側超出1SD如果有下列情況之一發(fā)生，說明實驗失敗、應舍棄該批數(shù)據(jù)：33體外放射分析

體外放射分析34分類：1、

競爭性：放射免疫分析RIA競爭性蛋白結合分析CPBA放射受體分析RRA放射酶分析放射微生物分析2、非競爭性：免疫放射分析IRMA分類：35一、放射免疫分析RIA原理：P62競爭機制：Ag(不定量)+Ab（有限量）固定量*Ag免疫結合反應形成免疫復合物一、放射免疫分析RIA36定量分析的數(shù)學基礎：免疫結合反應服從質量作用定律P+Q===PQ[PQ]K=---------[P][Q]K值大表示親和力大定量分析的數(shù)學基礎：37由質量作用定律推導的數(shù)學模型[Q0]1[Q0]B2—B（1+------+--------）+-------==0[P0]K[P0][P0]

[PQ]B==----------×100%P0=Ag+*AgPQ=*Ag—Ab[P0]Q0=Ab的初始含量當*Ag為固定量時，P0為自變量（實際為Ag）P0與復合物B呈一定的函數(shù)關系由質量作用定律推導的數(shù)學模型38放免反應的定量依據(jù)：

劑量反應曲線或叫標準曲線劑量反應曲線的含義以已知的標準品為橫坐標，以放射性復合物測定值的某種表達式做縱坐標，繪制劑量---反應曲線P64圖4—1P74圖4—13放免反應的定量依據(jù)：39曲線的斜率是關鍵因素，斜率不同精密度不同（P64圖4—1）

斜率=tgα（代表曲線或直線的傾斜度）

影響斜率的常見因素有以下幾點：1、Ab親和力：K大，斜率也大2、Ag用量：Ag少，斜率大3、Ag的免疫活性：活性強，斜率大4、*Ag的比活度和放化純度：↑→↑5、Ab用量：B=33—50%斜率最大。6、反應條件和溫度（見后）曲線的斜率是關鍵因素，斜率不同精密度不同（P64圖4—1）40免疫反應條件要求：1、PH：大多PH=7.52、離子強度：常用0.05—0.1M3、反應溫度：實驗確定免疫反應條件要求：41RIA方法學1、操作步驟：P1942、RIA的基本試劑標準抗原基本要求：①標準抗原與待測物免疫性必須一致②必須高純度：不純不能制備抗體，不純標記物放化純度達不到要求③標準抗原的量必須準確：（用于標準曲線）④具有良好的穩(wěn)定性（能保證較長時間不改變性能）標準抗原的用途：①制備抗體②制備*Ag③標準曲線RIA方法學42抗血清檢查抗血清的指標：1、親和常數(shù)KP1922、交叉反應率P1933、滴度

標記抗原Ag*基本要求：①免疫活性與待測物及標準品一致②適度的比活度：太高、化學量少、不具競爭性，太低統(tǒng)計誤差大。③足夠高的放化純度（>95%）抗血清43免疫活性檢驗：復合物放射性最大結合百分率（B%）=-----------------------------------×100%參與反應標記抗原放射性分離方法非特異分離法：吸附法（活性炭）層析電泳法過濾法磁性分離法沉淀法（聚乙二醇，硫酸胺等）免疫活性檢驗：44

特異分離法：

雙抗法固相分離法 葡萄球菌A蛋白（SPA）補充：對分離方法的基本要求

1、使結合部分與游離部分盡可能完全分開2、分離的成份便于放射性測量3、分離效果不受外界干擾因素的影響4、操作簡便、分離迅速、重復性好5、與游離標記物的非特異結合盡可能小6、試劑來源廣泛，經濟價廉

特異分離法：45RIA加樣方法1、平衡法：三種反應物同時加樣 優(yōu)：簡便易掌握重現(xiàn)性好 競爭反應較典型 缺：靈敏度不高2、順序加樣法：Ag+Ab溫育后再加*Ag優(yōu)：標準曲線起始段斜率高、靈敏度高缺：曲線工作波度范圍窄、重現(xiàn)性差3、一天法：（特殊情況下使用）RIA加樣方法46樣品采集與保存應注意的幾個問題

①

用原樣品、新鮮樣品、減少存放、最好不純化、濃縮萃取、減少變異②

盡快做實驗，避免反復凍融③

盡可能少用添加劑等，抗凝劑也少用。

RIA數(shù)據(jù)處理的數(shù)學模型（補充概念）后頁

樣品采集與保存應注意的幾個問題

RIA數(shù)據(jù)處理的47放射免疫法的數(shù)學模型及處理常用符號及英文縮寫的含意：NSB：非特異結合B0%：B0管的放射性測量值與加入總放之比。BQC：質控探樣品測量值CPMBN：NSB管的樣品測量值CPMF：游離物質樣品測量值CPMB：結合的沉淀物樣品測量值CPMED50：指B/B0為50%時對應劑量值。ED25、ED70指B/B0為25%、70%所對應的劑量。放射免疫法的數(shù)學模型及處理48

曲線模型分類1、針對劑量反應的實際曲線模型： 如多項式函數(shù)，光滑樣條函數(shù)，線性內插模型2、直線化模型：（logit—log模型）常用：將標準曲線橫坐標各點取對數(shù)lgX而縱坐標用logitBx/B0,logitBx/B0=lgBx/B0—Bx該直線法標準曲線的零點丟失（零無對數(shù)）造成靈敏度降低

曲線模型分類493、logistic模型：只能用于平衡反應兩點改進

a：橫坐標不取對數(shù)而用Db：不做NSB，靠計算機計算擬合扣除NSB。a—d模型：Y=------------------+dx1+(------)bc有四個參數(shù)：a=B0（也稱四參數(shù)logistic模型）c=ED50b=logit—log直線斜率d=NSB3、logistic模型：只能用于平衡反應504、五參logistic數(shù)模型：a—bY=---------------+dx[1+(----)b]Ec引入了一個不對稱因子E。E計算機能求出。可用于非平衡反應系統(tǒng)4、五參logistic數(shù)模型：515、四參數(shù)單位點質量作用定律模式：按質量作用定律導出的模式優(yōu)點：①質量作用定律，穩(wěn)健回歸擬合；②適于平衡和非平衡系統(tǒng)；③個別壞點對曲線影響小。模型的選擇（擬合優(yōu)度法來選）問題：一組數(shù)據(jù)可用多種模型去處理，如何選用？①

線性擬合用最小二乘法，選殘差平方和最小的模型。②

非線性擬合用百分比偏差DEV%DEV%=（X’—X）/X100% DEV%<10%即可使用。5、四參數(shù)單位點質量作用定律模式：52放射免疫的質量控制RIA的誤差來源：試劑（變性，核素脫落、貯存不當免疫活性↙等）樣品（放置不當，存放條件不同，制備、采集的差異等）操作（加樣不準，反應條件改變、分離不統(tǒng)一等）儀器與設備（不統(tǒng)一，差異等）測量（統(tǒng)計漲落）數(shù)據(jù)處理：擬合不當、方法不一致等。放射免疫的質量控制53誤差分類系統(tǒng)誤差：原因是確定因素如試劑變性，稱量不準，批號不同。隨機誤差：原因屬偶然，難以確定，測量結果忽高忽低呈雙向圍某數(shù)值波動。過失誤差：過失造成的誤差，結果失真無規(guī)律性可查。質控目的：找出誤差原因、采取必要措施，保證實驗結果的可信性。質控分類實驗室內質控實驗室間質控誤差分類54常用的質控指標：靈敏度、特異性、精密度、偏差、準確度、穩(wěn)定性、臨床有效性。1、靈敏度：10個B0管均值減去2SD后在標準曲線上查得的劑量值。2、特異性：用交叉反應率來表示3、精密度：同一樣品多份測量結果變異的大小。SD可用SD或CV=-------×100%X4、偏差：偏離真值的程度測定值—真值 偏差b=--------------------×100%真值核醫(yī)學體外放射分析課件555、準確度：測量值與真值的符合程度，也叫回收率 回收管測量值—對照管測量值回收率=-----------------------------------------×100%回收管內加入的已知量反應準確度評價指標 在空白樣品中加入已知劑量的待測物得測定值—空白值樣品回收率=-----------------------×100%已知值

回收率應在90~110%之間

5、準確度：測量值與真值的符合程度，也叫回收率56測定值—真值偏差=-----------------------------×100%真值偏差允許在±10%之內。

注意：測定值應取高、中、低三個劑量區(qū)的樣品分別求出高、中低三個劑量的回收率和偏差。測定值—真值576、穩(wěn)定性：指批間重復性。對曲線穩(wěn)定性考核的常用指標有：ED25、ED50、ED75、B0%、NSB%等。 不同批實驗中這些值應大體接近。7、臨床有效性：陽性率與臨床診斷的符合率。與正常值的確定有關。上述幾種指標間的關系；靶圖。 若某點的CV%大于10%應做為壞點剔除。6、穩(wěn)定性：指批間重復性。對曲線穩(wěn)定性考核的常用指標有：ED58反應精密度的幾個指標（1、2、3）：1、平均批變異系數(shù)（ABCV）：指一批實驗數(shù)據(jù)的CV平均值：∑SDABCV%=------------------------------×100%∑X2、反應誤差關系（RER）：指一批實驗各復管