葡聚糖凝膠柱層析課件

實驗1-1核苷酸的醋酸纖維膜電泳分離鑒定

帶電荷物質(zhì)在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象稱為電泳。各種核苷酸在pH3.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中電離差異，帶有不同的凈電荷，在電場中的遷移率不一樣，從而達到分離的目的。一、原理：1、水平電泳儀、水平電泳槽、紫外檢測儀、電吹風(fēng)、

醋酸纖維膜。2、0.02mol/L檸檬酸緩沖液(pH3.5)：取檸檬酸(C6H807.H20)16.2g，檸檬酸三鈉(Na3C6H507.2H20)6.7g。用蒸溜水溶解，定容到2000ml。3、腺苷酸溶液：

AMP、ADP、ATP，用水配成50mg/ml。二、儀器與試劑：6、蓋上電泳槽的蓋子，平衡10分鐘.7、接上電極，點樣端在負(fù)極，接通電源，調(diào)整電壓在100V，室溫通電40分鐘。8、電泳完畢后，關(guān)閉電源，取出濾紙，電吹風(fēng)吹干。9、在紫外燈下觀察，可見核苷酸的深藍色斑點。畫出核苷酸在醋酸纖維膜上的位置，并分析其分離依據(jù)。四、結(jié)果與討論：實驗1-2

SephadexG-50分離生物大分子1、凝膠層析法的原理：

凝膠層析是一種液相層析，其原理是分子篩效應(yīng)。

根據(jù)不同分子的分配系數(shù)不同而分離。

當(dāng)洗脫開始以后，小分子可進入凝膠顆粒內(nèi)部，流程長，流動慢；大分子不能進入凝膠顆粒內(nèi)部，流程短，流動快。這樣，就可使大小不同的分子分開?？傮w積：Vt(totalvolume)，

外水體積：Vo(outervolume)內(nèi)水體積：Vi(innervolume)

洗脫體積：Ve(elutionvolume)干膠體積：Vg(gelvolume)

Vt（床體積）=Vo+Vi+Vg,Ve（洗脫體積=Vo+Kd×Vi。層析的幾個主要參數(shù)：2、影響凝膠層析分離的因素：

2.1、樣品的體積、粘度。2.2、層析柱：（高度，內(nèi)徑，材質(zhì)）。2.3、洗脫液的流速：過慢：擴散；過快：拖尾。2.4、洗脫液的離子強度、pH。2.2、層析柱：

①柱長：組別分離時，5－30厘米；

分級分離時，可長至100厘米；

②柱徑：分析分離時，由于樣品量少，常使用1厘米直徑的層析柱，若制備分離時樣品量大，最好使用直徑2－3厘米的層析柱。今天選用的是2cm×50cm的層析柱。2.3、洗脫液的離子強度和pH值：多糖類：水是最佳洗脫劑。蛋白類：離子強度＞0.02M的鹽溶液作洗脫劑，以消除凝膠的吸附作用。pH＞7時，酸性物質(zhì)易被洗脫。pH＜7時，堿性物質(zhì)易被洗脫。3、凝膠層析法的應(yīng)用：

1、分子量的測定:

利用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白洗脫，制備洗脫標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、多組分混合物的分離:

利用Kd的差異分離。3、脫鹽與分離純化:

用于脫鹽的凝膠多為顆粒大、交聯(lián)度高的凝膠。

此時，溶液中大分子（如蛋白質(zhì)）的kd=0，鹽類的kd=1，易于分離脫鹽。4、凝膠的特性、種類、使用與保存：凝膠是一種具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)（如葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等),吸收大量液體（水或洗脫液）溶脹而成。

4.1、凝膠的特性：1、惰性：保證其不與待分離物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。2、穩(wěn)定。3、低電荷：避免離子交換效應(yīng)的發(fā)生。4、足夠的機械強度：在一定的操作壓下不形變。葡聚糖凝膠的型號：

目前，凝膠層析法中使用最廣泛的一類層析凝膠，商品名稱：Sephadex。其基本骨架是葡聚糖，它是由右旋葡萄糖殘基通過α－1，6糖苷鍵連接而成，葡聚糖分子之間通過醚橋（甘油基）交聯(lián)形成三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

凝膠過濾介質(zhì)名稱分離范圍顆粒大小（μm）特性/應(yīng)用pH穩(wěn)定性工作干凝膠溶脹體積mL/g溶脹最少平衡時間h最快流速(cm/h)室溫沸水SephadexG-10SephadexG-15SephadexG-25CoarseSephadexG-25MediumSephadexG-25FineSephadexG-25SuperfineSephadexG-50CoarseSephadexG-50MediumSephadexG-50FineSephadexG-50

SuperfineSephadexG-75SephadexG-75SuperfineSephadexG-100SephadexG-100SuperfineSephadexG-150SephadexG-150SuperfineSephadexG-200SephadexG-200Superfine<700<15001000~50001000~50001000~50001000~50001500~300001500~300001500~300001500~300003000~800003000~700004000~1.5×1054000~1×1055000~3×1055000~1.5×1055000~6×1055000~2.5×105干粉40~120干粉40~120干粉100~300干粉50~150干粉20~80干粉10~40干粉100~300干粉50~150干粉20~80干粉10~40干粉40~120干粉10~40干粉40~120干粉10~40干粉40~120干粉10~40干粉40~120干粉10~40脫鹽及交換緩沖液用脫鹽及交換緩沖液用脫鹽及交換緩沖液用脫鹽及交換緩沖液用小分子蛋白質(zhì)分離小分子蛋白質(zhì)分離小分子蛋白質(zhì)分離小分子蛋白質(zhì)分離中等蛋白質(zhì)分離中等蛋白質(zhì)分離中等蛋白質(zhì)分離中等蛋白質(zhì)分離稍大蛋白質(zhì)分離稍大蛋白質(zhì)分離較大蛋白質(zhì)分離較大蛋白質(zhì)分離2~132~132~132~132~13

2~132~102~102~102~102~102~102~102~102~102~102~102~102~32.5~3.54~64~64~64~69~119~11

9~119~1112~1512~1515~2015~2020~3018~2230~4020~253366666666242448487272727211222222223355552~52~52~52~52~52~52~52~52~52~572164711215.6112.84.4、凝膠的防腐、保存：

Sephadex、Sepharose是多糖類物質(zhì)，易于長菌。因此，常在凝膠不用時，加入抑菌劑，使用時再除去。1.常用0.02％疊氮鈉作防腐劑。2.常用20％乙醇溶液保存各類凝膠。5儀器、材料：

1、儀器與材料：柱層析裝置、SephadexG-50。2、樣品混合物：藍色葡聚糖-200(MW=2000kDa,藍色)、細(xì)胞色素C(MW=12.4kDa，紅色)和重鉻酸鉀(K2Cr2O7,MW=294.18，黃色)的混合物。3、洗脫液：蒸餾水。6.1、凝膠用量的計算：根據(jù)層析柱的容積和所選凝膠溶脹后的柱床體積計算出所需凝膠干粉的重量。凝膠的克數(shù)＝Vbed÷

Vc。

凝膠過濾介質(zhì)名稱分離范圍顆粒大小（μm）特性/應(yīng)用pH穩(wěn)定性工作干凝膠溶脹體積mL/g溶脹最少平衡時間h最快流速(cm/h)室溫沸水SephadexG-10SephadexG-15SephadexG-25CoarseSephadexG-25MediumSephadexG-25FineSephadexG-25SuperfineSephadexG-50CoarseSephadexG-50MediumSephadexG-50FineSephadexG-50

SuperfineSephadexG-75SephadexG-75SuperfineSephadexG-100SephadexG-100SuperfineSephadexG-150SephadexG-150SuperfineSephadexG-200SephadexG-200Superfine<700<15001000~50001000~50001000~50001000~50001500~300001500~300001500~300001500~300003000~800003000~700004000~1.5×1054000~1×1055000~3×1055000~1.5×1055000~6×1055000~2.5×105干粉40~120干粉40~120干粉100~300干粉50~150干粉20~80干粉10~40干粉100~300干粉50~150干粉20~80干粉10~40干粉40~120干粉10~40干粉40~120干粉10~40干粉40~120干粉10~40干粉40~120干粉10~40脫鹽及交換緩沖液用脫鹽及交換緩沖液用脫鹽及交換緩沖液用脫鹽及交換緩沖液用小分子蛋白質(zhì)分離小分子蛋白質(zhì)分離小分子蛋白質(zhì)分離小分子蛋白質(zhì)分離中等蛋白質(zhì)分離中等蛋白質(zhì)分離中等蛋白質(zhì)分離中等蛋白質(zhì)分離稍大蛋白質(zhì)分離稍大蛋白質(zhì)分離較大蛋白質(zhì)分離較大蛋白質(zhì)分離2~132~132~132~132~13

2~132~102~102~102~102~102~102~102~102~102~102~102~102~32.5~3.54~64~64~64~69~119~11

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6.4、上樣：上樣前：1.

柱子要用洗脫液洗脫平衡。2.

除去膠面之上的液體：用吸管吸，或打開層析柱下的止水夾，使凝膠表面上的蒸餾水剛好流入膠面，迅速關(guān)閉止水夾，以防空氣進入凝膠。上樣：用自動進樣器吸取0.5ml混合樣品，小心地加到柱床表面（切勿沖動膠面），保持膠面平整.使樣品液成一薄層。2.隨即打開層析柱下面的出口，使樣品完全進入膠柱內(nèi)。3.用滴管小心地加少許蒸餾水到凝膠的上表面。使膠面上保持2-3cm厚的水層。4.同時，接通洗脫液，用刻度試管，分別收集洗脫液。6.5、洗脫和收集：調(diào)節(jié)洗脫液流速為0.5ml/min,仔細(xì)觀察柱內(nèi)樣品分離現(xiàn)蒙，用刻度試管收集并置取洗脫液的體積。等蘭色到柱的燒結(jié)板時再另換一個刻度試管收集，用刻度試管收集并量取洗脫液的體積。注意觀察樣品的分離現(xiàn)象。最后，根據(jù)記錄的實