免 疫 組 織 化 學(xué)課件

免疫組織化學(xué)

Immunohistochemistry免疫組化是什么？和醫(yī)生有什么關(guān)系？？疑難病理診斷確定組織來源發(fā)現(xiàn)微小病灶免疫組化評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞增殖程度指導(dǎo)治療、評(píng)價(jià)預(yù)后病原體與腫瘤的關(guān)系常規(guī)切片病理診斷主要流程手術(shù)及活檢標(biāo)本常規(guī)切片閱片初步或最后診斷HE染色免疫組化染色最后診斷特殊染色HE染色病理診斷主要流程手術(shù)及活檢標(biāo)本常規(guī)切片閱片初步或最后診斷HE染色免疫組化染色最后診斷特殊染色HPV的診斷

步驟HEHPV疣？一把鑰匙開一把鎖一把鎖有一個(gè)鑰匙AbAbAgAg提取抗原。免疫動(dòng)物(免疫血清)。獲得相應(yīng)的特異性抗體。用顯示劑標(biāo)記此抗體。以此抗體來檢測抗原。通過化學(xué)顯色反應(yīng)，在顯微鏡下可見有顏色變化的部位即抗原的位置。

免疫組化技術(shù)的基本理論

免疫反應(yīng)中的一些基本名詞

抗原抗體(單克隆、多克隆)抗原-抗體復(fù)合物

為了使抗原抗體復(fù)合物在鏡下成為可見，需進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記抗體:熒光素抗體酶標(biāo)抗體

AgAgAbHRP+H2O2+DAB

免疫組化檢測步驟

特異性是指抗原只與相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞結(jié)合。

抗原的特異性是由抗原物質(zhì)表面的特殊化學(xué)基團(tuán)即抗原決定簇（antigenditerminant)的性質(zhì)、數(shù)量和空間構(gòu)型所決定。不同抗原的抗原決定簇?cái)?shù)目不等?？乖肿颖砻娉Ｓ性S多相同或不同的抗原決定簇。每一種抗原決定簇都可以刺激機(jī)體產(chǎn)生一種特異性抗體，因此某一抗原，可以產(chǎn)生一種或一種以上特異性抗體。不同的抗原，既可有各自獨(dú)有的抗原決定簇，即特異性抗原，又有相同或相似的抗原決定簇，即共同抗原，可以引起交叉反應(yīng)。t多克隆抗體天然抗原由多種抗原決定簇組成，每種決定簇均可激活有相應(yīng)抗原受體的B淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生針對(duì)抗原決定簇的抗體。因此用抗原免疫動(dòng)物所產(chǎn)生的免疫血清，是多個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物，稱為多克隆抗體。提取抗原免疫動(dòng)物

免疫血清多克隆抗體細(xì)胞抗原多克隆抗體單克隆抗體B淋巴細(xì)胞細(xì)胞克隆雜交瘤技術(shù)免疫動(dòng)物抗原決定簇多種B細(xì)胞多克隆B細(xì)胞多克隆抗體單克隆B細(xì)胞單克隆抗體漿細(xì)胞漿細(xì)胞抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)的概念:

抗原與抗體的反應(yīng)具有高度特異性。通常一種抗原只能與其相應(yīng)的抗體結(jié)合,同一抗原可具有多種不同的抗原決定簇,若兩種不同的抗原分子具有一個(gè)或多個(gè)相同的抗原決定簇,則與抗體反應(yīng)時(shí)可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。t免疫組織化學(xué)的基本技術(shù)1、石蠟切片脫蠟至水2、抗原修復(fù)3、3%H2O210min-PBS沖洗3min×3次4、加一抗60min-PBS沖洗3min×3次

5、加二抗15min--PBS沖洗3min×3次6、DAB顯色3-10min--自來水沖洗7、蘇木素復(fù)染、脫水、干燥、封片免疫組織化學(xué)的基本技術(shù)

免疫組織化學(xué)標(biāo)本的取材、固定、切片及注意事項(xiàng)一、取材：（一）組織標(biāo)本的取材

組織標(biāo)本包括活體組織檢查標(biāo)本、手術(shù)切除和尸體解剖標(biāo)本等。對(duì)于活體組織檢查標(biāo)本和手術(shù)切除標(biāo)本，取材應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。

1、活體組織標(biāo)本的取材：常見標(biāo)本為口腔、喉、鼻咽、皮膚、

宮腔和各種內(nèi)窺鏡鉗取的組織。2、手術(shù)切除標(biāo)本的取材

由于免疫組化技術(shù)的組織塊大小要適中，一般在1cm×1cm×0.2cm至2cm×1cm×0.2cm之間，這樣有利于固定劑能快速滲出到組織內(nèi)。為充分保存組織的抗原性，標(biāo)本離體后應(yīng)立即處理，可以速凍后制作冰凍切片，也可固定后制作石蠟切片。如不用迅速制片，可貯于液氮或-70℃低溫冰箱備用。

（二）細(xì)胞標(biāo)本的取材

1、印片法：常用于活檢和手術(shù)切除標(biāo)本。優(yōu)點(diǎn)：簡便省時(shí)，細(xì)胞抗原保存良好。缺點(diǎn)：細(xì)胞分布不均勻，細(xì)胞重疊

2、穿刺法：常用于實(shí)質(zhì)器官病變區(qū)的細(xì)胞采集，如肝、腎、肺、淋巴結(jié)、軟組織等。

3、沉淀法：

常用于胸水、腹水、尿液、腦脊液等體液多細(xì)胞少的標(biāo)本。

二、固定目的：是使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，以保持細(xì)胞和組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)，更重要的保存組織或細(xì)胞的抗原，防止抗原破壞和彌散。（一）常用的固定劑

1.醛類固定劑：特點(diǎn)：對(duì)組織的穿透性強(qiáng)，收縮性小。

（1）甲醛固定液：包括10%甲醛液、10%中性甲醛液和10%中性緩沖甲醛液等。固定時(shí)間不宜超過24小時(shí)（2）4%多聚甲醛磷酸緩沖液：適用于光學(xué)顯微鏡下免疫組化研究。（3）戊二醛-多聚甲醛緩沖液：適用于光鏡、電鏡免疫組化研究。

(4)Bouin液：比單獨(dú)醛類固定更適合免疫組化。

2、丙酮及醇類固定劑：（1）乙醚（或氯仿）與乙醇等量混合液：是理想的細(xì)胞固定劑。（2）Carnoy液：適用于癌基因、抗癌基因蛋白等抗原固定。（3）丙酮：適合于冰凍切片和細(xì)胞涂片的后固定，抗原保存較好，且時(shí)間短，切片在冷丙酮中的固定僅需要5~15分鐘。

3、其他固定劑（1）碳二亞酰胺-戊二醛液：適用于多肽類激素的固定。（2）Zenker液：對(duì)免疫球蛋白固定后染色效果好，固定時(shí)間2-4h.染色前應(yīng)用0.5%碘液脫汞。（二）常用的固定方法1、浸入法：將組織或切片浸泡在固定液內(nèi)2、注射、灌注固定法3、微波固定法（三）固定的注意事項(xiàng)1、固定劑的選擇：多按HE常規(guī)處理組織和細(xì)胞，固定劑一般都是

10%中性緩沖甲醛液、可用于大多數(shù)抗原的保護(hù)。2、固定劑的量：一般不少于組織體積

4--5倍。3、固定后處理：必須充分沖洗。

三、切片

要求切片薄而平整一般厚度在3~5微米之間石蠟切片。（一）石蠟切片：與常規(guī)切片制備基本相同。（二）冰凍切片：

優(yōu)點(diǎn)：能夠較完整地保存抗原，尤其是細(xì)胞膜抗原、受體抗原、酶及多肽類抗原等，并且快速、方便。缺點(diǎn)：冰凍時(shí)，組織中水分易形成冰晶，影響抗原定位。載玻片的防脫片的處理

一、載玻片和蓋玻片的處理新的載玻片先用流水沖洗，洗衣粉或肥皂水浸泡，再以流水充分沖洗。最后用蒸餾水清洗。再浸泡95%乙醇內(nèi)，干燥后備用。

蓋玻片可直接浸泡于無水乙醇中，干燥后備用。

二、玻片的防脫片處理（一）樹脂膠（二）明膠:甘油明膠甲醛明膠鉻礬明膠（三）多聚賴氨酸（PLL）多聚賴氨酸0.5g，加蒸餾水100ml，配成濃度0.5%的儲(chǔ)存液，-20℃環(huán)境下可長期保存.使用時(shí)按1：10稀釋配成工作液。將清潔載玻片在工作液中反復(fù)蘸幾下，分散晾干備用。

(四）APESAPES是一種新型粘片劑，是通過化學(xué)作用改變玻璃表面的分子結(jié)構(gòu)，使組織切片牢固的帖在載玻片上，不易脫落。使用時(shí)用丙酮按1：50稀釋

免疫組織化學(xué)常用液體及抗體的配制一、常用液體的配制（一）0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）pH7.2試劑：NaH2PO4·2H2O9.0gNa2HPO4·12H2O64.5g

NaCl160g

蒸餾水加水至2000ml

(二)0.5mol/LTris-HCI緩沖液pH7.6

試劑：Tris(三羥甲基氨基甲烷）60.57g

1mol/LHCl420ml

蒸餾水加至1000ml

配制：先將少量蒸餾水溶解Tris，加入HCl

后，將pH值調(diào)至7.6,然后加蒸餾水至1000ml,置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

(三)0.05mol/LTris-HCI緩沖液(TBS)pH7.6試劑：

0.05mol/LTris-HCI緩沖液100mlNaCl8.5～9.0g

蒸餾水加至1000ml配制：先用蒸餾水少許溶解NaCl,再加

Tris-HCI緩沖液(pH7.6),最后加蒸餾水至1000ml,充分搖勻使終濃度

0.05mol/L

（四）檸檬酸鹽緩沖液儲(chǔ)存液：A:0.01mol/L檸檬酸：稱取21.01g檸檬酸溶解于1000ml蒸餾水中。B:0.01mol/L檸檬酸鈉：稱取29.41g檸檬酸鈉溶解于1000ml蒸餾水中。工作液：取A液9ml和B液41ml分別加入450ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為6.0±0.1，濃度為0.01mol/L。

檸檬酸鹽緩沖液主要用于抗原修復(fù)。

（五）3%過氧化氫甲醇液試劑：30%過氧化氫H2O2

10ml

甲醇90ml

3%過氧化氫甲醇液處理標(biāo)本，可以封閉內(nèi)源性過氧化物酶的活性。

二、抗體的稀釋和保存

(分濃縮型與即用型)（一）抗體的稀釋1、影響抗體稀釋度的因素（1）抗體的濃度（滴度）：抗體的濃度越高，稀釋度就越高。（2）非特異性蛋白質(zhì)的含量：（3）孵育時(shí)間：（4）免疫組織化學(xué)染色方法：

2、抗體最佳稀釋度的測定方法：用已知陽性抗原切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，將其陽性強(qiáng)度與非特異性背景染色強(qiáng)度以“+”的多少表示。在某一稀釋度下特異性染色較強(qiáng)且無背景著色，是較理想的稀釋度。（1）直接測定法：在其他條件已知的情況下（如二抗或三抗的稀釋度），用于檢測第一抗體的最佳稀釋度。

表3-1直接測定法————————————————————一抗稀釋度特異性染色強(qiáng)度非特異性背景染色強(qiáng)度

1：50++++++1：100++++++1：200++++++1：400++++1：500++-

陰性對(duì)照--_____________________________________

（2）棋盤（方陣）測定法

表3-2棋盤稀釋法——————————————————二抗稀釋度一抗稀釋度

____________________________1:501:1001:2001:400_________________________________________1:100+++++(++)++++(+)+++(-)+(-)1:200++++(+)+++(-)++(-)++(-)1:400++++(-)+(-)(-)(-)———————————————————————————注：括號(hào)內(nèi)為背景著色強(qiáng)度

抗體稀釋液的配制：取0.05mol/LpH值為7.4的TBS100ml,加溫到60℃,再加入0.1g明膠，攪拌溶解后，冷卻到室溫，加入1.0g牛血清白蛋白、NaN30.2g溶解后，過濾分裝，4℃保存.(二）抗體的保存

對(duì)于新購進(jìn)的濃縮抗體，可按廠家提供的效價(jià)，按50μｌ或100μｌ為一單位分裝,并注明標(biāo)記（批號(hào)、名稱、效價(jià)、量），密封后放入-20℃～40℃冰箱中保存?zhèn)溆?一般可保存1-2年。

三、顯色劑的種類及配制

(一）3,3`-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)配制：取25mgDAB溶于50mlTBS(0.05mol/LpH7.6)中，完全溶解后，用濾紙過濾沉淀。顯色前再加入適量H2O2

陽性部位呈棕色，一般以蘇木精復(fù)染配制DAB時(shí)注意：（1）DAB有致癌性，可誘發(fā)皮膚癌和膀胱癌（2）DAB一定要新鮮配制（3）DAB的濃度不宜太高。

(二）3-氨基-9-乙基卡巴唑（AEC）取4mgAEC溶于1ml二甲基甲酰胺中，加入14ml濃度為0.1mol/LpH5.2的醋酸緩沖液，然后加入適量H2O2，過濾去掉沉淀物。陽性部位呈紅色，蘇木精或亮綠復(fù)染抗原的修復(fù)一、抗原修復(fù)的原因甲醛固定劑使組織蛋白內(nèi)或蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)，封閉了許多抗原決定簇，影響了抗原的定位，使染色結(jié)果不明顯或失敗?？乖迯?fù)或暴露是將固定時(shí)分子之間形成的交聯(lián)打開，恢復(fù)到原有空間。二、抗原修復(fù)的機(jī)制

1、化學(xué)反應(yīng)

2、熱反應(yīng)

3、微波的高速震蕩效應(yīng)

三、常用的抗原修復(fù)的方法

（一）酶消化方法

1、胰蛋白酶消化方法濃度一般是0.05%~0.1%。主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的修復(fù)。

2、胃蛋白酶消化方法濃度一般為0.04%

主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的修復(fù)。

3、尿素消化方法濃度為3mol/L,37℃消化5分鐘。

主要用于單克隆抗體所做的石蠟切片。t

（二）物理化學(xué)方法

1、單純加熱方法

2、高壓加熱方法：

3、微波加熱方法t抗原修復(fù)前抗原修復(fù)后抗原修復(fù)的注意事項(xiàng)任何修復(fù)方法都不能使組織片干燥；加熱必須達(dá)到規(guī)定的溫度；加熱后應(yīng)放置足夠的時(shí)間使之冷卻?？乖迯?fù)效果取決于緩沖液的組成成分及pH值。實(shí)踐中證明檸檬酸緩沖液效果較好，最常使用。

各種抗原修復(fù)方法的評(píng)價(jià)

（一）酶消化方法

（二）物理化學(xué)方法

各有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)注意各公司的抗體產(chǎn)品的說明書。免疫組織化學(xué)的染色

常規(guī)取材、固定、切片免疫組化的染色顯色劑的種類

(一）3,3`-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)

陽性部位呈棕色

(二）3-氨基-9-乙基卡巴唑（AEC）陽性部位呈紅色t顯色反應(yīng)

HRP+H2O2

H2O+O

DABAEC

HRP+H2O2

H2O+O

DABAEC

棕色

紅色

免疫組化染色后，必須對(duì)切片進(jìn)行復(fù)染，更能襯托出組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，便于對(duì)結(jié)果分析。石蠟切片常用蘇木精復(fù)染冰凍切片常用甲基綠免疫金銀法染色常用核固紅。E-cad（+）DAB顯色蘇木精復(fù)染P-185（+），AEC顯色角蛋白，DAB顯色，甲基綠襯染丙型肝炎病毒,AEC顯色蘇木精復(fù)染免疫組織化學(xué)的染色方法

免疫組織化學(xué)的染色方法有很多，根據(jù)標(biāo)記物的種類不同可分為三大類。即:免疫熒光法、免疫酶標(biāo)法、免疫膠體金銀法。每一類染色方法均可分為直接法、間接法。免疫熒光法在腎臟、皮膚的免疫性疾病的診斷上，具有重要價(jià)值。目前，逐漸被免疫酶標(biāo)法所代替。免疫酶標(biāo)法

常用的染色方法:

一步法--直接酶標(biāo)法二步法:間接酶標(biāo)法

EnvisionSystem法

SP二步法三步法:PAP法、ABC法四步法:酶橋法、ASPAPAP法五步法:雙PAP法

免疫酶標(biāo)染色方法及原理

(以辣根過氧化物酶(HRP)

和二氨基聯(lián)苯胺(DAB）顯示劑為例)

直接酶標(biāo)法（一步法）：

將酶標(biāo)記在特異性抗體上，然后與組織中的相應(yīng)抗原結(jié)合形成抗原---特異性抗體---酶復(fù)合物，再與顯色劑反應(yīng)，以顯示抗原所在部位t

免疫酶標(biāo)染色方法及原理

(以辣根過氧化物酶(HRP)

和二氨基聯(lián)苯胺(DAB）顯示劑為例)

間接酶標(biāo)法（二步法）：先用未標(biāo)記的特異性抗體（一抗）與組織中的相應(yīng)抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，再用酶標(biāo)記的抗特異性抗體的抗體（二抗）與特異性抗體結(jié)合，形成抗原--特異性抗體--酶標(biāo)抗體復(fù)合物，最后用顯色劑，顯示抗原所在部位。

EnvisionSystem法

多重免疫組織化學(xué)染色方法1、染色原理：是利用各種染色方法之間所利用的標(biāo)記物及顯色劑的不同而加以組合，在同一張切片上，進(jìn)行多種免疫組化染色的方法。2、染色方法：同前。3、應(yīng)用：最普遍的是雙重免疫組化染色，即用HRP-DAB與堿性磷酸酶AP-red顯色系統(tǒng)染色方法進(jìn)行組合。P504S胞漿呈棕色P63核呈黑色前列腺癌雙重染色，EMA胞膜呈紅色，Ki-67核呈藍(lán)黑色

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判斷原則1、首先應(yīng)觀察常規(guī)石蠟切片，形成初步診斷意見并選好靶細(xì)胞2、每一批染色都應(yīng)設(shè)置陽性和陰性，這是正確判斷染色結(jié)果的前提。3、抗原的表達(dá)必須在靶細(xì)胞或組織的特定部位上，才能視為陽性，不在抗原特定部位上的陽性顆粒不能視為陽性表達(dá)。t4、陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)。陰性的原因很多，從固定到制片以及細(xì)胞的分化程度均可影響著色。5、當(dāng)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果與HE診斷不相符或發(fā)生矛盾時(shí)，應(yīng)以HE診斷為標(biāo)準(zhǔn)，而不能用免疫組化染色結(jié)果代替HE診斷。

免疫組織化學(xué)染色過程中的注意事項(xiàng)（一）正確設(shè)置陽性、陰性對(duì)照

免疫組化染色常用的對(duì)照有陽性對(duì)照、陰性對(duì)照（空白對(duì)照、替代對(duì)照）吸收實(shí)驗(yàn)、抑制實(shí)驗(yàn)和自身對(duì)照等。1、陽性對(duì)照：是指用已經(jīng)被證實(shí)了含有靶抗原的組織切片與待檢組織切片一起做免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果為陽性，稱為陽性對(duì)照。每一次都應(yīng)設(shè)置陽性對(duì)照。

2、陰性對(duì)照：是指已知不含靶抗原的組織切片與待檢組織切片一起做免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果為陰性，稱為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照主要包括空白對(duì)照和替代對(duì)照兩種。每一次染色均應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照。設(shè)置陰性對(duì)照的方法有：

PBS液（空白對(duì)照）或用動(dòng)物非免疫血清（替代對(duì)照）代替一抗進(jìn)行染色，結(jié)果為陰性。

（二）時(shí)間

在免疫組化染色時(shí)，除嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行外，還應(yīng)嚴(yán)格控制各步的染色時(shí)間。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的特點(diǎn)，逐步摸索出適合自己實(shí)驗(yàn)室的每一步驟的染色時(shí)間。（三）顯色

應(yīng)在顯微鏡下控制顯色，當(dāng)陽性顆粒顯示較清楚，而背景清晰無著色時(shí)，即可終止顯色。

（四）溫度在免疫組化染色過程中，溫度也直接影響免疫組化的染色結(jié)果。（五）濕度

在免疫組化染色過程中，應(yīng)滴加足夠量的稀釋好的抗體或復(fù)合物，將組織塊完全覆蓋，并將切片放入濕盒內(nèi)，濕盒下面加入適量溫水，表面密封蓋好，在濕盒內(nèi)進(jìn)行孵育，確保組織切片表面濕潤，以免抗體蒸發(fā)。

常用免疫組織化學(xué)染色方法的評(píng)價(jià)

1、常用染色方法敏感性比較

各種免疫組化染色的方法和使用的標(biāo)記物的不同，敏感性也不相同。一般膠體金標(biāo)志的染色方法敏感性比酶標(biāo)記的染色方法敏感性高。

2、常用染色方法的優(yōu)缺點(diǎn)（1）直接法：

優(yōu)點(diǎn)：簡單、快速、特異性強(qiáng)，背景非特異性染色輕。缺點(diǎn)：敏感性低。（2）間接法：

優(yōu)點(diǎn)：敏感性比直接法高，且一種酶標(biāo)記抗體可與多種特異性一抗配合檢測多種抗原缺點(diǎn)：敏感性比酶橋法、PAP法低。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判斷原則1、首先應(yīng)觀察常規(guī)石蠟切片，形成初步診斷意見并選好靶細(xì)胞2、每一批染色都應(yīng)設(shè)置陽性和陰性，這是正確判斷染色結(jié)果的前提。3、抗原的表達(dá)必須在靶細(xì)胞或組織的特定部位上，才能視為陽性，不在抗原特定部位上的陽性顆粒不能視為陽性表達(dá)。4、陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)5、當(dāng)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果與HE診斷不相符或發(fā)生矛盾時(shí)，應(yīng)以HE診斷為標(biāo)準(zhǔn)，而不能用免疫組化染色結(jié)果代替HE診斷。

假陽性、假陰性及背景著色的原因1、出現(xiàn)假陽性染色的原因（1）抗體濃度過高（2）抗體特異性較差（3）內(nèi)源性過氧化物酶封閉不徹底。（4）由于抗原的彌散或被腫瘤細(xì)胞吞噬。

(5)抗原的例外表達(dá)等。

出現(xiàn)假陰性染色的原因（1）抗體稀釋不當(dāng)，濃度過低。（2）抗體失活或抗體效價(jià)過低，敏感性較差。（3）標(biāo)本處理不當(dāng)，致使抗原丟失或破壞過多。如切片長期保存抗原會(huì)丟失。（4）抗體孵育時(shí)間過程短，致使抗體與抗原不能充分結(jié)合，導(dǎo)致染色呈現(xiàn)假陰性。室溫保存半年切片染色新切片對(duì)照染色

（5）染色過程中，組織切片未放入濕盒內(nèi)，組織表面過分干燥。（6）染色操作步驟不正確，隨意省略步驟等。（7）沖洗步驟、PBS緩沖液的pH值對(duì)染色結(jié)果有影響。（8）抗體與檢測試劑盒不匹配。Ki-67:PBSpH6.0沖洗染色Ki-67:PBSpH7.6沖洗染色

3、引起背景染色的原因有很多，主要有以下幾方面：（1）組織標(biāo)本陳舊，固定不及時(shí)或固定時(shí)間過長。（2）組織切片太厚，脫蠟不徹底。（3）組織切片處理不當(dāng)，防脫片劑濃度過高。（4）內(nèi)源性過氧化物酶封閉不完全，導(dǎo)致內(nèi)源性酶顯色。

（5）所用的動(dòng)物非免疫血清與抗體不匹配。（6）抗體濃度過高。（7）抗體特異性較差，與組織內(nèi)某些抗原或其他成分發(fā)生交叉反應(yīng)或非特異性染色。（8）PBS液沖洗不徹底。（9）標(biāo)記物質(zhì)量較差，純度不夠，游離的標(biāo)記物過多等，均可導(dǎo)致背景著色。（10）底物染色時(shí)間過長。免疫組化應(yīng)用中的注意事項(xiàng)正確認(rèn)識(shí)設(shè)置對(duì)照的意義正確判斷免疫組化的染色結(jié)果正確分析假陽性、假陰性的原因正確認(rèn)識(shí)抗原的“例外”表達(dá)正確認(rèn)識(shí)抗原的聯(lián)合表達(dá)

正確應(yīng)用雙重互補(bǔ)及反正法t抗原的“例外”表達(dá)與聯(lián)合表達(dá)抗原的“例外”表達(dá)是指在正常情況下或從理論上講不應(yīng)該為陽性的抗原而出現(xiàn)了陽性表達(dá)的現(xiàn)象。如CK不僅可表達(dá)在上皮組織，而且還可表達(dá)在非上皮組織。聯(lián)合表達(dá)即一種細(xì)胞可表達(dá)多種抗原。如肺癌細(xì)胞可同時(shí)表達(dá)CK,VIMNF,DES。t雙重互補(bǔ)及反正法

惡性黑色素瘤陽性陰性

HMB45CKS-100EMAVIMLCA

惡性黑色素瘤HEVIMHMB45CK免疫組化檢查流程鏡檢HE染色切片確定待檢靶細(xì)胞（待檢抗原）選擇決定用哪幾種相應(yīng)抗體免疫組化染色鏡檢免疫組化染色結(jié)果中間絲的特異性組織表達(dá)

不同的中間絲有其特異的組織分布，這種特異分布是比較穩(wěn)定的，即正常組織及其相應(yīng)腫瘤組織都保持相同的中間絲?；谶@一理論，中間絲作為組織起源的標(biāo)記，可識(shí)別正常組織及其腫瘤。代表性的最有五種抗原

１、角蛋白（CytoKeratin,CK）

２、波紋蛋白（Vimentin,Vim）３、結(jié)蛋白（Desmin,Des）４、神經(jīng)絲（Neurofilament，NF）５、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）

(GlialFibrillaryAcidicProtein）

中間絲的特異性組織表達(dá)

CKVimDesGFAPNF

上皮組織＋

間葉組織＋

肌組織＋

神經(jīng)膠質(zhì)＋

神經(jīng)元

＋

常用抗體分類上皮細(xì)胞及其腫瘤標(biāo)記物(抗體)間葉組織及其腫瘤標(biāo)記物淋巴造血細(xì)胞標(biāo)記物神經(jīng)和內(nèi)分泌細(xì)胞標(biāo)記物癌基因蛋白標(biāo)記物其他標(biāo)記物:病原、激素、激素受體、細(xì)胞增殖活性等標(biāo)記物

常用的標(biāo)記物１、上皮細(xì)胞及其腫瘤標(biāo)記物:

（１）細(xì)胞角蛋白（CK）位于上皮細(xì)胞及其腫瘤細(xì)胞的胞漿內(nèi),可用于鑒別上皮性和非上皮性細(xì)胞及其腫瘤。如未分化癌與淋巴瘤、癌與惡性黑色素瘤、癌與肉瘤的鑒別。tHECK正常鱗狀上皮NPCNpc:CKHECK正常腺上皮CK正常腺上皮低分化癌CK低分化癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌CK淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌CK（２）甲胎蛋白(AFP）

（－fetoprotein）

是肝細(xì)胞癌的一種重要標(biāo)記物。在卵巢或睪丸的內(nèi)胚竇瘤、胚胎性癌的癌細(xì)胞中亦有表達(dá)。

t肝細(xì)胞肝癌HEAFPHEHE肝細(xì)胞肝癌AFPAFP肝細(xì)胞癌內(nèi)胚竇瘤CKAFPHE胚胎性癌AFP（３）EMA抗原

(EMA）

（epithelialmembraneantigen上皮膜抗原）

主要用于檢測內(nèi)臟上皮及其腺癌,優(yōu)于CK。

EMA正常腺上皮腸腺癌腸腺癌EMA（4）前列腺特異性抗原(PSA)(ProtateSpecificAntigen):

主要用于檢測前列腺增生和前列腺癌,對(duì)轉(zhuǎn)移性前列腺癌的確診特別有意義。

tHEPSA正常前列腺前列腺癌PSA前列腺癌HE２、間葉組織及其腫瘤標(biāo)記物：

（１）波紋蛋白（Vim）:

主要位于間葉細(xì)胞及其腫瘤細(xì)胞的胞漿內(nèi)，是間葉細(xì)胞及其腫瘤的特異性標(biāo)記物。常與細(xì)胞角蛋白配對(duì)使用，鑒別癌與肉瘤、惡性黑色素瘤與癌、未分化癌與淋巴瘤等腫瘤。

tVIM正常纖維組織纖維肉瘤VimHE（２）結(jié)蛋白（Des）:

結(jié)蛋白是平滑肌、骨骼肌及其腫瘤的特異性標(biāo)記物。主要用于標(biāo)記平滑肌、橫紋肌及其腫瘤；對(duì)一些未分化的腫瘤可與其他標(biāo)記物合用進(jìn)行鑒別診斷。

tDes正常腸壁平滑肌平滑肌肉瘤平滑肌肉瘤Des

（３）肌動(dòng)蛋白(Actin)

廣泛分布于各種類型的肌細(xì)胞中，對(duì)肌源性腫瘤特異性強(qiáng),敏感性更高。

平滑肌型的肌動(dòng)蛋白（SMA）：主要用于平滑肌源性腫瘤的診斷。對(duì)一些外分泌腺的肌上皮細(xì)胞和肌上皮瘤有較高特異性。

Act正常腸壁平滑肌平滑肌肉瘤HEVIMACT平滑肌肉瘤SMA3、淋巴造血細(xì)胞標(biāo)記物（１）

CD45（LCA）:

全白細(xì)胞共同抗體只存在于所有的造血細(xì)胞中，不存在于非造血組織中。是區(qū)別淋巴瘤（/白血?。┡c非造血組織腫瘤的一個(gè)良好標(biāo)記物。tLCA腸粘膜淋巴小結(jié)（２）

CD3CD45RO

T細(xì)胞標(biāo)記抗體（３）

CD20CD79a

B細(xì)胞標(biāo)記抗體

(4)CD15CD30Hodgkindisease標(biāo)記抗體t正常淋巴結(jié)HECD20CD3CD3HE

T細(xì)胞淋巴瘤B細(xì)胞淋巴瘤CKHECD20HodgkindiseaseCD154、神經(jīng)和內(nèi)分泌細(xì)胞標(biāo)記物

（１）S-100蛋白（S-100

）

廣泛分布于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)，還分布于軟骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，肌上皮細(xì)胞等，為神經(jīng)外胚葉腫瘤的一種有用的標(biāo)記物。在良性神經(jīng)鞘瘤、神經(jīng)纖維瘤以及幾乎所有的黑色素瘤都表達(dá)。

t神經(jīng)鞘HES-100神經(jīng)鞘瘤Benign

神經(jīng)鞘瘤

Malignant

s-100S-100惡性黑色素瘤（2）黑色素瘤(HMB45)

對(duì)黑色素瘤特異性更強(qiáng)。

H.E惡性黑色素瘤HMB45HMB45HE惡性黑色素瘤惡性黑色素瘤HES-100HMB45CK（３）膠質(zhì)纖維酸性蛋白

(GFAP):

存在于星形細(xì)胞,室管膜細(xì)胞,神經(jīng)鞘細(xì)胞,視網(wǎng)膜細(xì)胞。

膠質(zhì)細(xì)胞GFAP膠質(zhì)細(xì)胞瘤正常膠質(zhì)細(xì)胞（４）嗜鉻素A(CgA)

(chromograninA)(5)突觸素

(SY)

(synaptophysin)

主要檢測神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞及其腫瘤。

突觸素

(SY)嗜鉻素A(CgA)嗜鉻細(xì)胞瘤HECg-A胃類癌CKSYHE直腸類癌CKHESY

(6)

神經(jīng)元特異性烯醇化酶

(NSE)（NeuronSpecificEnolase)

只存在于神經(jīng)原細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，因此在髓母細(xì)胞瘤、嗅母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、節(jié)細(xì)胞神經(jīng)瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞瘤、類癌等有表達(dá)。神經(jīng)元特異性烯醇化酶NSEHE

5、癌基因蛋白標(biāo)記物

（１）C-erbB2（P185）:

是一種細(xì)胞來源癌基因，其蛋白產(chǎn)物是P185，它們?cè)诙喾N腺癌細(xì)胞中均有超量表達(dá)，可作為判斷乳腺癌預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。

C-erbB-2乳腺癌＋＋＋＋＋＋＋＋（２）抗癌基因

P53（突變）:

Ｐ５３蛋白為核蛋白，主要表達(dá)在惡性腫瘤細(xì)胞，Ｐ５３的表達(dá)與細(xì)胞分化有關(guān)，分化越差，Ｐ５３表達(dá)越高，惡性程度越高。

P53乳腺癌

６、其他標(biāo)記物

（１）病原標(biāo)記物:EB病毒(EBV)乳頭狀瘤病毒(HPV)乙型肝炎核心抗原(HBCAg)乙型肝炎表面抗原(HBSAg)等用于檢測相應(yīng)的病原HPVHPV尖銳濕疣H.EHBsAgHBsAgHBsAg乙型肝炎表面抗原乙型肝炎核心抗原腮腺巨細(xì)胞包涵體病毒鼻NK/T細(xì)胞淋巴瘤：EBV（２）激素標(biāo)記物胰島素胰高血糖素降鈣素甲狀腺素胃泌素血清素生長激素等

用于檢測相應(yīng)的激素。

tGlucagonInsulin胰島細(xì)胞HECalcitonin降鈣素Ccell髓樣癌甲狀腺髓樣癌HECKTHG甲狀腺癌顱內(nèi)轉(zhuǎn)移顱內(nèi)占位性病變HCG絨毛ACTH類癌（３）激素受體：

雌激素受體(ER)

孕激素受體(PR)

雄激素受體(AR)

預(yù)測腫瘤對(duì)激素治療的反應(yīng)及預(yù)后。

tH.EERPRBREAST乳腺癌（4）腫瘤細(xì)胞增殖活性的常用標(biāo)記物增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)單克隆抗體(Ki-67)表皮生長因子受體(EGFR)核仁區(qū)嗜銀蛋白(AgNOR)

檢測細(xì)胞增殖程度,對(duì)確定腫瘤的良、惡性和惡性程度有價(jià)值。t胃腺癌Ki-67淋巴瘤精原細(xì)胞瘤PCNA

常見腫瘤的常用的免疫組化鑒別要點(diǎn)

(１)未分化腫瘤免疫組化

淋巴瘤癌肉瘤惡黑

LCA+

－－－

CK－+

－－

S-100－－－+

Vim+

－+

+

NSE－－－+

HECKLCA非霍奇金淋巴瘤

癌肉瘤淋巴瘤神經(jīng)內(nèi)分泌瘤惡黑

CK

+++

++Vim

++++Des

++LCA

+++

S-100++

SY

+++

HMB45++(2)原發(fā)灶不明腫瘤的鑒別PSA:前列腺癌THG:甲狀腺濾泡癌HCG:絨癌，生殖細(xì)胞癌CEA:大腸/胃癌AFP:肝癌，生殖細(xì)胞癌CT

:甲狀腺髓樣癌(3)幾種特異性抗體t(4)淋巴瘤的免疫組化標(biāo)記

CD20CD3CD15CD68B淋巴瘤+

–+/–

–T淋巴瘤–+

+/–

–組織細(xì)胞瘤

–+/––+

何杰金氏病–/+–+

–常用免疫組化鑒別表CK+

Vim-CK+

滑膜腫瘤間皮腫瘤Vim+

上皮樣肉瘤

CK-

NSE+Vim-

NF+/-Des+───肌源性腫瘤

CD34+───血管源性腫瘤CK-

S-100+─黑色素瘤、脂肪腫瘤、神經(jīng)鞘瘤

Vim+LCA+──淋巴、造血系細(xì)胞腫瘤

GFAP+─膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤

CD68+──組織細(xì)胞腫瘤

上皮源性腫瘤節(jié)細(xì)胞神經(jīng)母細(xì)胞瘤CD3ActHET細(xì)胞淋巴瘤KrukenbergtumorCKHETHG肝內(nèi)腫瘤

滑膜肉瘤HECKVIM估計(jì)腫瘤病人的預(yù)后估計(jì)腫瘤病人的預(yù)后

結(jié)果預(yù)后ER/PR

陽性好AR

陽性好P185陽性

差PCNA

高指數(shù)差P53

高表達(dá)差估計(jì)乳腺癌預(yù)后

低危高危ER/PR

陽性陰性P185

低表達(dá)高表達(dá)P53

陰性低%陽性高%PCNA低%高%t對(duì)治療的指導(dǎo)ERPR

及其功能

雌、孕激素由卵巢和胎盤產(chǎn)生，通過血循環(huán)到靶器官（如子宮、乳腺）與靶器官中的細(xì)胞漿內(nèi)的特異蛋白結(jié)合，從而起調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，控制其生長發(fā)育的作用。這種能與雌、孕激素特異性結(jié)合的蛋白分別稱為雌激素受體（ＥＲ）和孕激素受體（ＰＲ）。乳腺癌與

雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)

檢測ER、PR的臨床意義1.估計(jì)乳腺癌的予后。

ER、PR陽性者予后較陰性者好。2.合理進(jìn)行內(nèi)分泌治療的依據(jù)。

ER、PR陽性者內(nèi)分泌治療有效率高:。Tamoxifen的治療機(jī)制

一般認(rèn)為

Tamoxifen是一種雌激素競爭性抑制劑，通過阻斷ER與雌激素結(jié)合達(dá)到治療目的。但它又是一種化療增敏劑，能增強(qiáng)某些癌細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性。C-erbB-2(P185、Her-2