RT-PCR的實(shí)驗(yàn)原理與操作步驟

提取組織或細(xì)胞中的總RNA以其中的mRN作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。RT-PCF使測的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA羊品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。（一）反轉(zhuǎn)錄酶的選擇Moloney鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性，RNA酶H活性相對(duì)較弱。最適作用溫度為37C。禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42C。3.Thermusthermophilus 、Thermusflavus 等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：在Mn2存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄 RNA，以消除RNA模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)。4.MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH-突變體：商品名為 SuperScript 和SuperScript U。此種酶較其它酶能多將更大部分的 RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，這一特性允許從含二級(jí)結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的 m模板合成較長cDNA。（二）合成cDNA引物的選擇隨機(jī)六聚體引物：當(dāng)特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時(shí)，可采用隨機(jī)六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長 mRNA。用此種方法時(shí)，體系中所有 RNA分子全部充當(dāng)了 cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴(kuò)增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的 cDNA中96%來源于rRNA。2.Oligo(dT) ：是一種對(duì)mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞 mRNA具有3'端Poly(A) 尾，此引物與其配對(duì)，僅 mRNA被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A)RNA 僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的 cDNA比隨機(jī)六聚體作為引物和得到的 cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。3.特異性引物：最特異的引發(fā)方法是用含目標(biāo) RNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為 引物，若PCR反應(yīng)用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與靠近的配對(duì)引物起始。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的 cDNA增。生物科研

mRNA3'端最，導(dǎo)致更為特異的 PCR擴(kuò)二、實(shí)驗(yàn)耗材與試劑1．RNA提取"target="_blank">RNA

取試劑2．第一鏈

cDNA

合成試劑盒3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM4．TaqDNA聚合酶三、實(shí)驗(yàn)步驟(一) 總RNA的提取見相關(guān)內(nèi)容。(二) cDNA第一鏈的合成目前試劑公司有多種一?，F(xiàn)以GIBICOL

cDNA第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟公司提供的SuperScriptTMPreamplificationSystemfor

不FirstStrandcDNASynthesis 試劑盒為例。在0.5ml微量離心管中，加入總RNA1-5卩g,補(bǔ)充適量的DEPCH2O使總體積達(dá)11卩l(xiāng)。在管中加0卩MOligo(dT)12-181 卩l(xiāng)，輕輕混勻、離心。2.70C加熱0min,立即將微量離心管插入冰浴中至少 1min。然后加入下列試劑的混合物：10xPCRbuffer---------2卩125mMMgCl2--------2卩110mMdNTPmix------------1卩10.1MDTT---------- 2卩1輕輕混勻，離心。 42C孵5min。3.加入Superscript n1在l42 C水浴中孵育50min。于70°C加熱15min以終止反應(yīng)。將管插入冰中，加入RNaseH1卩,137C孵育20min，降解殘留的RNA-20C保存?zhèn)溆谩?三)PCR擴(kuò)增1.取0.5mlPCR 管，依次加入下列試劑：第一鏈cDNA---------2卩1上游引物（10pM）------2卩1下游引物（10pM）-------2卩1dNTP（2mM）-------4卩110xPCRbuffer-------------5卩1Taq酶（2u/卩I）-------- 1卩1加入適量的ddH2O,使總體積達(dá)50卩l(xiāng)。輕輕混勻，離心。3.設(shè)定PCR程序。在適當(dāng)?shù)臏囟葏?shù)下擴(kuò)增 28-32 個(gè)循環(huán)。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 的可靠與準(zhǔn)確， 可在PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)， 加入一對(duì)內(nèi)參 （如G3PD）的特異性引物，同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)參 DNA，作為對(duì)照。電泳鑒定：進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。密度掃描、結(jié)果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對(duì)電泳條帶進(jìn)行密度掃描。四、注意事項(xiàng)在實(shí)驗(yàn)過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA斷裂為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對(duì)照內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、B-Actin（-觀動(dòng)蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。PCR不能進(jìn)入平臺(tái)期，出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長度、序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。 故對(duì)于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)的 循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來確定。5.防止DNA的污染：采用DNA酶處理RNA樣品，在可能的情況下，將 PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和 mRNA的共線性。所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180°C的高溫下干烤6hr或更長時(shí)間。7.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗 （注意： 有機(jī)玻璃器具因可被 氯仿腐蝕，故不能使用）。有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1%DEP