無菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(培養(yǎng)法)

無菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(培養(yǎng)法)無菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(培養(yǎng)法)無菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(培養(yǎng)法)資料僅供參考文件編號(hào)：2022年4月無菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(培養(yǎng)法)版本號(hào)：A修改號(hào)：1頁(yè)次：1.0審核：批準(zhǔn):發(fā)布日期：無菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程StandardOperatingProcedureofSterileExamination編號(hào)/NO：版本號(hào)/Version：頁(yè)碼/Page起草人：起草日期：審核人：審核日期：批準(zhǔn)人：批準(zhǔn)日期：頒發(fā)部門Issuedby執(zhí)行日期EffectedDate替換文件Replacedfor復(fù)審日期ReviewDate分發(fā)部門Distributedto武漢仝干生物科技有限公司W(wǎng)uhanTogoBiotechnologyCo.,Ltd無菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程StandardOperatingProcedureofSterileExamination編號(hào)/NO：版本號(hào)/Version：頁(yè)碼/Page：1、目的建立無菌檢測(cè)的基本操作，為無菌檢測(cè)人員提供正確的操作規(guī)程。通過無菌檢驗(yàn)后，確保產(chǎn)品能夠達(dá)到無菌的要求。2、適用范圍適用于我公司進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)量檢驗(yàn)的技術(shù)人員。3、內(nèi)容簡(jiǎn)述：無菌檢測(cè)系用于檢查細(xì)胞是否無菌的一種方法。檢查項(xiàng)目包括需氧菌、厭氧菌及真菌檢查。若供試品符合該項(xiàng)檢查方法的有關(guān)規(guī)定，僅表明在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。環(huán)境要求：該項(xiàng)檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度萬級(jí)背景下的局部百級(jí)的單向流區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行。其過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，日常檢驗(yàn)需對(duì)試驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控。人員要求：無菌檢測(cè)人員應(yīng)具備微生物及檢驗(yàn)專業(yè)知識(shí)，并經(jīng)過無菌檢驗(yàn)培訓(xùn)。4、無菌檢驗(yàn)前的準(zhǔn)備器具滅菌、消毒試驗(yàn)過程中與供試品接觸的所有器具必須采用可靠方法滅菌，可置高壓滅菌鍋內(nèi)121℃蒸汽滅菌30分鐘后使用（根據(jù)滅菌效果驗(yàn)證決定滅菌參數(shù)）。所有的滅菌物品不應(yīng)超過2周即用畢，否則應(yīng)重新滅菌。凡檢驗(yàn)中使用的器材無法滅菌處理的，使用前必須經(jīng)消毒處理，如無菌檢驗(yàn)室的電子天平，工作臺(tái)面等，可采用消毒劑浸泡或擦拭。器具的滅菌、消毒后必須做好標(biāo)識(shí)，標(biāo)明滅菌、消毒時(shí)間和使用有效期。人員、物料進(jìn)入無菌檢驗(yàn)室開啟紫外燈或臭氧發(fā)生器進(jìn)行空間滅菌處理，消毒時(shí)間不得少于30分鐘。人員進(jìn)入無菌檢驗(yàn)室需在一更區(qū)脫去一般區(qū)工作鞋，換無菌檢驗(yàn)室工作鞋，并在二更區(qū)穿戴無菌服、口罩和手套，口罩掩住口鼻，帽子包裹所有頭發(fā)。進(jìn)入無菌檢驗(yàn)室的所有培養(yǎng)基、供試品等需將外包裝在傳遞窗拆除后，查看所有進(jìn)入無菌檢驗(yàn)室的器具上的滅菌、消毒標(biāo)識(shí)，是否在有效期內(nèi)，符合要求的于傳遞窗進(jìn)行表面紫外消毒，傳入無菌檢驗(yàn)室。5、無菌檢驗(yàn)室操作要求1）人員進(jìn)入后，首先進(jìn)一步消毒擦拭工作臺(tái)面。2）全過程必須嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，防止微生物污染。3）使用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放，避免破損，以防培養(yǎng)物擴(kuò)散。4）所有操作均應(yīng)在近火焰區(qū)進(jìn)行，且不得有大幅度或快速動(dòng)作，以免攪動(dòng)空氣中的塵埃微粒。5）使用金屬接種器具時(shí)，用前、用后均需灼燒滅菌。6）在接種培養(yǎng)物時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕、準(zhǔn)，防止培養(yǎng)物濺出，產(chǎn)生汽溶膠，造成污染。7）時(shí)放入消毒液缸內(nèi)浸泡或消毒桶內(nèi)，或在檢驗(yàn)完成后經(jīng)傳遞窗傳至一般區(qū)，立即用壓力蒸汽滅菌鍋121℃滅菌30分鐘。

6、培養(yǎng)基制備需氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基（硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基）的制備所用試劑：

酪胨（胰酶水解）

葡萄糖

L-胱氨酸

硫乙醇酸鈉

（或硫乙醇酸）（）酵母浸出粉

氯化鈉

新配制的%刃天青溶液

瓊脂

水1000ml

制備：除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調(diào)節(jié)pH為±。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基氧化層的顏色要求：在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否剛需經(jīng)100℃水浴加熱到粉紅色消失（不超過20分鐘）迅速冷卻，只限加熱一次，并應(yīng)防止被污染。

霉菌培養(yǎng)基（改良馬丁培養(yǎng)基）的制備所用試劑：胨

酵母浸出粉

葡萄糖

磷酸二氫鉀

硫酸鎂

水1000

ml

制備：除葡萄糖外，取上述成分混和，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值約為，煮沸，加葡萄糖溶解后，搖勻，濾清，調(diào)節(jié)pH為±。還可使用按處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基，按照使用說明書配制。培養(yǎng)基配制后應(yīng)盡快滅菌，避免微生物繁殖。一般采用高壓蒸汽121℃滅菌30分鐘。制備好的培養(yǎng)基應(yīng)在2～25℃保存，在3周內(nèi)使用。

培養(yǎng)基的無菌性檢查每批配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行無菌性檢查（可與產(chǎn)品無菌檢驗(yàn)同步進(jìn)行）。檢查時(shí)，每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支（瓶）培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長(zhǎng)。7、稀釋液、沖洗液的制備%蛋白胨水溶液：取蛋白胨，加水1000ml121℃滅菌30分鐘后，于4℃保存?zhèn)溆?。氯化鈉-蛋白胨緩沖液：

取磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉、蛋白胨，加水1000ml。微溫溶解，濾清，分裝后置入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，121℃滅菌30分鐘后，于4℃保存?zhèn)溆?。浸提介質(zhì)：9g/L無菌氯化鈉溶液。

8、對(duì)照菌液制備無菌檢驗(yàn)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代。取金黃色葡萄球菌的普通瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，在30～35℃培養(yǎng)18～24h后備用，同時(shí)制備%氯化鈉溶液加入6支小試管內(nèi)，每支試管內(nèi)加的%氯化鈉溶液，在高壓滅菌鍋內(nèi)經(jīng)121℃滅菌30分鐘備用。將已配好的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)菌液取加入第一支小試管內(nèi)，稀釋成濃度1:10的菌液；取第一支試管內(nèi)菌液加入第二支小試管內(nèi)，稀釋成濃度1:100的菌液，同法稀釋成濃度1:106（每ml含菌量≤100CFU）即可。采用平皿計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)。9、無菌檢驗(yàn)培養(yǎng)溫度

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，置30～35℃培養(yǎng)。改良馬丁培養(yǎng)基，置23～28℃培養(yǎng)。

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、無菌檢驗(yàn)

滅菌前、后菌片應(yīng)按菌片說明書規(guī)定條件保存。接種開啟單向?qū)恿?，分別將滅菌后的菌片成對(duì)放入已滅菌的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，同時(shí)以金黃色葡萄球菌作陽(yáng)性對(duì)照，以未接種的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和未接種的改良馬丁培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。培養(yǎng)陽(yáng)性對(duì)照管于30~35℃細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)48~72小時(shí)，其余硫乙醇酸