DNA的生物合成7課件

第12章DNA的生物合成DNABiosynthesis*1第12章DNA的生物合成DNABiosynthesis*11865年，孟德爾提出遺傳因子的概念。1910年，摩爾根提出基因位于染色體。1909年，約翰遜據(jù)希臘文“給予生命”之義，用“基因(gene)”替代了“遺傳因子(geneticfactor)”。*21.基因概念的提出和發(fā)展中心法則的提出和發(fā)展1865年，孟德爾提出遺傳因子的概念。1910年，摩爾根提格里非斯和艾弗里的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)赫爾希和沙斯的T2噬菌體侵染細(xì)菌實(shí)驗(yàn)

*32.遺傳物質(zhì)化學(xué)本質(zhì)的探索遺傳物質(zhì)是DNA格里非斯和艾弗里的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)*32.遺傳物質(zhì)化學(xué)本質(zhì)FranklinDNAX射線衍射圖譜查戈夫等發(fā)現(xiàn)：①A=T，G=C

Watson和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型

*43.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型FranklinDNAX射線衍射圖譜查戈夫等發(fā)現(xiàn)：①A=DNARNAProtein中心法則TheCentralDogma1958F.Crick翻譯轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制中心法則的補(bǔ)充：①1965年發(fā)現(xiàn)RNA復(fù)制②1970年發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶*54.中心法則的提出和發(fā)展DNARNAProtein中心法則翻譯轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制中心復(fù)制的基本規(guī)律第一節(jié)*6復(fù)制的基本規(guī)律第一節(jié)*6DNA復(fù)制的概念:復(fù)制親代DNA子代DNA*7親代DNA為模板，按堿基配對(duì)的原則,合成兩個(gè)完全相同的子鏈DNA分子的過(guò)程。DNA復(fù)制的概念:復(fù)制親代DNA子代DNA*7親代DNA為模復(fù)制的基本規(guī)律半保留復(fù)制

(semi-conservativereplication)雙向復(fù)制

(bidirectionalreplication)半不連續(xù)復(fù)制

(semi-discontinuousreplication)*8復(fù)制的基本規(guī)律半保留復(fù)制雙向復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制*8一、半保留復(fù)制親代DNA子代DNA模板一、半保留復(fù)制親代DNA子代DNA模板圖12-1DNA復(fù)制理論上有三種可能形式*10圖12-1DNA復(fù)制理論上有三種可能形式*101958,M.Meselson

&F.W.Stahl設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)*11(1)N15培養(yǎng)基上培養(yǎng)(2)N14培養(yǎng)基上培養(yǎng)(3)培養(yǎng)不同時(shí)間后提取DNA(4)DNA于密度梯度介質(zhì)(5)離心N14對(duì)照組DNAN15親代DNAN14第1代DNAN14第2代DNA1958,M.Meselson&F.W.Sta子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。

半保留復(fù)制的意義*12子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，子代保留了親代的全部遺二、雙向復(fù)制DNA復(fù)制從固定的復(fù)制起始點(diǎn)(origin，Ori)開始，分別向兩個(gè)方向進(jìn)行解鏈、復(fù)制，稱為雙向復(fù)制。復(fù)制叉復(fù)制叉5’3’5’5’3’3’5’3’3’5’原核DNA復(fù)制：?jiǎn)吸c(diǎn)雙向復(fù)制*13二、雙向復(fù)制DNA復(fù)制從固定的復(fù)制起始點(diǎn)(oriOri是指DNA復(fù)制起始時(shí)必需的一段特殊DNA序列。這些短重復(fù)序列能被復(fù)制起始因子所識(shí)別并結(jié)合；一般富含AT堿基。①由多個(gè)獨(dú)特的短重復(fù)序列組成；*14共同特征：Ori是指DNA復(fù)制起始時(shí)必需的一段特殊DNA序列。這些短重A.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)B.復(fù)制中的兩個(gè)復(fù)制叉C.復(fù)制接近終止點(diǎn)(termination,ter)oriterABC原核DNA復(fù)制：?jiǎn)吸c(diǎn)雙向復(fù)制A.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)oriterA5’3’ARSARSARSARS5’3’5’5’3’3’真核DNA復(fù)制：多點(diǎn)雙向復(fù)制復(fù)制子長(zhǎng)度兩個(gè)相鄰復(fù)制起始點(diǎn)之間的距離定為一個(gè)復(fù)制子長(zhǎng)度。*16復(fù)制子(replicon)：獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。

復(fù)制子5’3’ARSARSARSARS5’3’5’5’3’3’真核三、復(fù)制的半不連續(xù)性35353′5′領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)3′5′3′5′*17三、復(fù)制的半不連續(xù)性35353′5′領(lǐng)頭鏈隨從鏈

半不連續(xù)性在DNA復(fù)制過(guò)程中，領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制，隨從鏈不連續(xù)復(fù)制的現(xiàn)象。

岡崎片段(okazakifragment)

指不連續(xù)復(fù)制的片段原核:1000~2000個(gè)核苷酸（nt）

(相當(dāng)于1個(gè)順?lè)醋樱椿虻拇笮?

真核:100~200個(gè)核苷酸（nt）(相當(dāng)于1個(gè)核小體DNA的大小)*18半不連續(xù)性*18DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化第二節(jié)*19DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化第二節(jié)*19底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP；(dNTP)聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶，簡(jiǎn)寫為DNA-pol；模板(template):

解開成單鏈的DNA母鏈；引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白質(zhì)因子。參與DNA復(fù)制的物質(zhì):*20底物(substrate):參與DNA復(fù)制的物質(zhì):*20一、復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)

(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPiDNApol沿5→3方向延長(zhǎng)；模板和引物；聚合反應(yīng)特點(diǎn)：消耗2個(gè)高能磷酸鍵一、復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)(dNMP)n+dNTP(dNM活性：1.53

聚合酶活性，需要引物；

2.35核酸外切酶活性。二、DNA聚合酶是指以DNA作為模板，催化底物dNTP合成DNA的一類酶。全稱：依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)簡(jiǎn)稱：DNA-pol*22活性：1.53聚合酶活性，需要引物；二、DNADNA-pol的5′3′聚合作用3′5

53′3′5DNA-pol5

3′OHP*23DNA-pol的5′3′聚合作用3′553′3′53′5′外切酶5′3′外切酶5′3′內(nèi)切酶3′5′外切酶5′3′外切酶外切酶與內(nèi)切酶作用圖解*245′3′3′5′外切酶5′3′外切酶5′3′內(nèi)切酶3′5′外（一）原核生物的DNA聚合酶共同點(diǎn)：1.53

的聚合活性，需要引物；

2.35外切酶活性。DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ不同點(diǎn)：DNA-polⅠ還有53外切酶活性。*25（一）原核生物的DNA聚合酶共同點(diǎn)：1.53的聚大腸桿菌三種DNA聚合酶性質(zhì)與功能*26大腸桿菌三種DNA聚合酶性質(zhì)與功能*26功能：對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制

和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。DNA-polⅠ(109kD)*271959年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主功能：對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制DNA-polⅠ(1沿5→3方向延長(zhǎng)；需模板和引物；消耗2個(gè)高能磷酸鍵。(1)53

的聚合活性的功能:沿5→3方向延長(zhǎng)；需模板和引物；消耗2個(gè)高能磷酸鍵。(1(2)DNA-pol

I

3′5′外切酶活性的功能校讀（proofread）功能5′3′GC將錯(cuò)配的核苷酸從引物鏈的3′端除去

*29(2)DNA-polI3′5′外切酶活性的功能校讀（(3)DNA-pol

I

5′3′外切酶活性的功能切除引物，切除突變片段5′3′*30(3)DNA-polI5′3′外切酶活性的功能切除引323個(gè)氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604個(gè)氨基酸

5核酸外切酶活性；DNA聚合酶活性N端C端枯草桿菌蛋白酶DNA-polⅠ酶切片段Klenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

*31323個(gè)氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/KlDNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因突變，細(xì)菌依然存活；對(duì)模板的特異性不高；它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。

*32DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因*由A.Kornberg的二兒子TomB.Kornberg發(fā)現(xiàn)的。

DNA-polⅢ(含10多個(gè)亞基的異二聚體)核心酶:由α、ε、θ構(gòu)成。*33功能:是原核生物復(fù)制延長(zhǎng)中真正起催化作用的酶。

*由A.Kornberg的二兒子TomB.KornbeDNA-polⅢ同時(shí)合成領(lǐng)頭鏈和隨從鏈*34DNA-polⅢ同時(shí)合成領(lǐng)頭鏈和隨從鏈*34

（二）真核生物的DNA聚合酶*35（二）真核生物的DNA聚合酶*35三、復(fù)制的保真性(fidelity)

（1）按照堿基配對(duì)規(guī)律進(jìn)行復(fù)制，突變率約為1/103；

（2）DNA聚合酶對(duì)模板的依賴性和對(duì)堿基的選擇，使子鏈與母鏈能準(zhǔn)確配對(duì),突變率降低到1/104~5；

（4）DNA修復(fù)系統(tǒng)和復(fù)制起始必須利用引物等機(jī)制，使突變率由1/106~8降低到1/109~10

。

（3）DNA聚合酶3′→5′外切酶功能和5′→3′聚合酶活性實(shí)現(xiàn)的即時(shí)校讀(proofread)，可使突變率由1/104~5降低到1/106~8；*36三、復(fù)制的保真性(fidelity)（1）按照堿基配對(duì)四、復(fù)制中的解鏈和DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化

DNA復(fù)制涉及DNA雙螺旋構(gòu)象變化*37解螺旋酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白引物酶DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶四、復(fù)制中的解鏈和DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化DNA復(fù)制涉及D

種類：解旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和rep蛋白

解旋酶Ⅱ、Ⅲ：沿著隨從鏈的模板，從5’→3’方向，促使復(fù)制叉向前延伸；

rep蛋白(六聚體)：沿著領(lǐng)頭鏈的模板，從3’→5’方向向前移動(dòng)，促使雙鏈不斷解開；（一）解螺旋酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白解螺旋酶(helicase)利用ATP供能，使DNA解旋和解鏈成單鏈。*38種類：解旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和rep蛋白解旋酶Ⅱ、Ⅲ：沿解螺旋酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白協(xié)同作用單鏈DNA結(jié)合蛋白

(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)功能：維持模板單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。*39解螺旋酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白協(xié)同作用單鏈DNA結(jié)合蛋（二）引物酶(primase)DNA復(fù)制時(shí)，利用DNA模板合成一段長(zhǎng)度從幾個(gè)到幾十個(gè)核苷酸的短鏈RNA序列，為DNA聚合酶提供游離3’-OH端延伸合成DNA鏈。原核細(xì)胞的引物酶是專用于合成引物的RNA聚合酶

真核細(xì)胞的引物酶是DNA聚合酶α的兩個(gè)小亞基。

*40

病毒的引物酶多樣化。

（二）引物酶(primase)DNA復(fù)制時(shí)，利用DNA模板合DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶：既能水解DNA分子中的磷酸二酯鍵，又能將其重新連接的核酸酶。功能：快速消除DNA解鏈過(guò)程中所產(chǎn)生的正超螺旋累積，使復(fù)制叉能夠順利前進(jìn)。

（三）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶

(DNAtopoisomerase)

*41DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶：既能水解DNA分子中的磷酸二酯鍵，又能將其

原核和真核生物都發(fā)現(xiàn)了三類拓?fù)洚悩?gòu)酶：TopoⅠ、TopoⅡ和TopoⅢ

原核生物：TopoⅡ?qū)⑶胺降恼菪D(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋；TopoⅠ使DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)，與轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

真核生物：TopoⅠ和TopoⅡ都能清除前方的正超螺旋。作用：通過(guò)切斷、旋轉(zhuǎn)和再連接，理順DNA鏈。

*42原核和真核生物都發(fā)現(xiàn)了三類拓?fù)洚悩?gòu)酶：TopoⅠ、DNA正超螺旋與負(fù)超螺旋負(fù)超螺旋DNA雙螺旋正超螺旋原核TopoⅡ原核TopoⅠ真核TopoⅠ、ⅡDNA聚合酶*43DNA正超螺旋與負(fù)超螺旋負(fù)超螺旋DNA雙螺旋正超螺旋原核To不需ATP切割DNA雙鏈；ATP供能將DNA分子轉(zhuǎn)變成負(fù)超螺旋再連接切口。不需ATP切割雙鏈DNA中的一條鏈，使DNA松弛后,連接切口。TopoⅠ:TopoⅡ：

臨床上使用的喜樹堿、鬼臼乙叉甙等抑制Topo酶活性。作用機(jī)制*44不需ATP切割DNA雙鏈；ATP供能將DNA分子轉(zhuǎn)變成負(fù)超螺五、DNA連接酶(DNAligase)除去RNA引物后，間隙由DNA-polⅠ填補(bǔ)成DNA，缺口由DNA連接酶催化相鄰岡崎片段間的3′-OH和5′-P形成磷酸二酯鍵。注意：不能連接DNA單鏈或RNA單鏈。AMP+PPi*45五、DNA連接酶(DNAligase)除去RNA引物后

在復(fù)制中起最后接合缺口(雙鏈中的單鏈

缺口)的作用；在DNA修復(fù)、重組及剪接過(guò)程中起縫合缺

口的作用；基因工程的重要工具酶之一。DNA連接酶功能*46在復(fù)制中起最后接合缺口(雙鏈中的單鏈DNA連接酶功能*4

參與DNA復(fù)制的主要因子和酶參與DNA復(fù)制的主要因子和酶DNA生物合成過(guò)程第三節(jié)TheProcessofDNAReplication*48DNA生物合成過(guò)程第三節(jié)TheProcessofDNA（一）復(fù)制的起始(initiation)一、原核生物的DNA生物合成

人為分成：起始、延長(zhǎng)和終止三個(gè)階段。引物合成DNA解鏈引發(fā)體生成1.DNA復(fù)制起始點(diǎn)的辨認(rèn)結(jié)合與解鏈原核生物DNA的復(fù)制有一個(gè)特定的復(fù)制起始點(diǎn)；E.coli的復(fù)制起始點(diǎn)稱為oriC，由245bp的保守序列和控制元件組成。*49（一）復(fù)制的起始(initiation)一、原核生物的上游有3組13bp串連重復(fù)序列，為DnaB(解螺旋酶)和DnaC識(shí)別結(jié)合的DNA解鏈元件。

下游有2對(duì)9bp反向重復(fù)序列,為DnaA蛋白(起始因子)識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)辨認(rèn)oriC并解鏈主要需要6種蛋白因子：DnaA(起始因子)、DnaB(解螺旋酶)、DnaC、HU(類組蛋白)、SSB、拓?fù)涿?50上游有3組13bp串連重復(fù)序列，為DnaB(解螺旋酶)和D引物3'HO5'3535引物酶HO3'5'引物酶SSB引物SSBHO3'(DnaG)(DnaG)引發(fā)體：含有解螺旋酶(DnaB)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG)和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)。引物：是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子,能提

供3′-OH。

2.引發(fā)體的形成和引物*51解螺旋酶(DnaB)DnaC引物3'HO5'3535引物酶HO3'5'引物酶（二）復(fù)制的延長(zhǎng)(elongation)在DNA-polⅢ催化下，按堿基互補(bǔ)原則，dNTP以磷酸二酯鍵相連接，逐個(gè)加入延長(zhǎng)中的子鏈上。

*52（二）復(fù)制的延長(zhǎng)(elongation)在DNA-polⅢ領(lǐng)頭鏈：以一段RNA引物開始合成后，通常一直繼續(xù)下去。*53領(lǐng)頭鏈：*53隨從鏈：分段進(jìn)行，需要不斷合成RNA引物和岡崎

片段。*54隨從鏈：分段進(jìn)行，需要不斷合成RNA引物和岡崎*54在營(yíng)養(yǎng)豐富培養(yǎng)基，E.Coli每20分鐘即可分裂一次；其基因組堿基數(shù)為4.6×106bp,

DNA為單點(diǎn)雙向復(fù)制，可推算出復(fù)制速度約115kb/min(1,900bp/s)；真核染色體DNA為多點(diǎn)雙向復(fù)制，復(fù)制叉移動(dòng)速度約1～3kb/min(16~50bp/s)；復(fù)制子長(zhǎng)度為100～200kb，約30～60分鐘內(nèi)完成復(fù)制(25~110bp/s)；完成染色體復(fù)制時(shí)間通常要用6～8小時(shí)。*55在營(yíng)養(yǎng)豐富培養(yǎng)基，E.Coli每20分鐘即可分裂1.原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的匯合點(diǎn)就是復(fù)制的終止點(diǎn)。（三）復(fù)制的終止oriter

E.coli8232SV40oriter500*561.原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的匯合（三）復(fù)制的終2.終止區(qū)含有多個(gè)約22bp的終止子(terminator)

Tus(terminusutilizationsubstance)蛋白識(shí)別結(jié)合終止子序列并具有反解旋酶活性，Tus-ter復(fù)合物可以抑制DnaB蛋白的解旋作用，阻止復(fù)制叉前進(jìn)。

Tus蛋白還可造成復(fù)制體解體；解體后大約仍有10～100bp未被復(fù)制，可通過(guò)修復(fù)方式填補(bǔ)這一空缺。*572.終止區(qū)含有多個(gè)約22bp的終止子(terminator3.隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接*583.隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接*58WhenDNAreplicated,itsstrandsareseparatedbytheenzymehelicase.SinglestrandDNAbindingproteinkeepsthestrandfromre-annealing.OneDNAstrandwecalledtheleadingstrand,whichformfrom5primeto3primeend,usingDNApolymeraseIII,noproblemhere.Butthelaggingstrandpresentsproblem.Ithasformedfrom5primeto3primetoo.ItformspiecescalledOkazakifragments.FirstaRNAprimaselaysdowntheRNAprimer,thenDNApolymeraseIIIlaysdownnewDNA.theprocessrepeatsagainandagain.DNApolymeraseIreplacestheRNAprimerintheDNA,finallyDNAligaselinkstheOkazakifragments.原核生物的DNA生物合成

*59WhenDNAreplicated,itsstran*60半保留復(fù)制

雙向復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制第2節(jié)DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化第1節(jié)DNA復(fù)制的基本規(guī)律第3節(jié)DNA復(fù)制的基本過(guò)程參與DNA復(fù)制的物質(zhì):一、復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)

二、DNA聚合酶三、復(fù)制的保真性(fidelity)四、復(fù)制中的解鏈和DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化

五、DNA連接酶一、原核生物的DNA生物合成:

起始、延長(zhǎng)和終止*60半保留復(fù)制雙向復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制第2節(jié)DNA復(fù)制的二、真核生物的DNA生物合成

復(fù)制起始點(diǎn)多、岡崎片段短、復(fù)制叉前進(jìn)速度慢、參與復(fù)制的酶種類和數(shù)量更多更復(fù)雜。細(xì)胞完成一輪分裂的過(guò)程稱為細(xì)胞周期(cellcycle)，分為4期；在良好營(yíng)養(yǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)胞，歷時(shí)約24小時(shí)。

復(fù)制僅發(fā)生在細(xì)胞分裂的合成期(S期)，而且只復(fù)制一次。*61二、真核生物的DNA生物合成復(fù)制起始點(diǎn)多、岡崎（一）復(fù)制的起始特點(diǎn)：起始點(diǎn)稱自主復(fù)制序列(autonomousreplicationsequence,ARS),

含有11bp富含AT的核心

序列的片段[A(T)TTTATA(G)TTTA(T)];可被起始識(shí)別復(fù)合體

(originrecognitioncomplex,ORC)識(shí)別結(jié)合（在Cdc6和MCM2~7的協(xié)助下）。多起點(diǎn)（染色體上有千個(gè)復(fù)制子）時(shí)序性（分組激活，非同步進(jìn)行）（一）復(fù)制的起始特點(diǎn)：3、酶和蛋白因子：

DNA-pol

/ε（引物酶活性/填補(bǔ)空缺）

DNA-pol（解螺旋酶及聚合酶活性）

增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)

拓?fù)洚悩?gòu)酶(TopoI,TopoII)

復(fù)制因子(RF，如：RFA、RFC)

4、通過(guò)細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA復(fù)制的調(diào)節(jié)：

S期周期蛋白cyclin依賴性激酶CDK磷酸化前復(fù)制復(fù)合物(pre-RC:MCM2~7-ORC/Cdc6-MCM2~7)激活，調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)入S期。

*633、酶和蛋白因子：4、通過(guò)細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA復(fù)制的調(diào)節(jié)：領(lǐng)頭鏈3535親代DNA5335隨從鏈（二）復(fù)制的延長(zhǎng)DNA-polδ：在PCNA和RF-C協(xié)同下，替代DNA-polα繼續(xù)催化領(lǐng)頭鏈和隨從鏈合成。DNA-polα：催化10個(gè)堿基引物和頭20~30個(gè)堿基組成的DNA合成；*64領(lǐng)頭鏈3535親代DNA5335隨從鏈（二）3`5`3`5`5`3`核小體引物注：當(dāng)隨從鏈延長(zhǎng)了大致相當(dāng)于一個(gè)或若干個(gè)核小

體的長(zhǎng)度(135bp，或135bp的若干倍)就要重

新合成引物長(zhǎng)度。*653`3`5`核小體引物注：當(dāng)隨從鏈延長(zhǎng)了大致相當(dāng)于一個(gè)或若干5’PHO3’P5’3’OHO5’PP5’HO3’3’OP5’5’P3’OH真核生物染色體DNA是線性結(jié)構(gòu)，新鏈兩端的引物被去除后，新鏈和母鏈分別留下一段空隙和一段單鏈DNA。

（三）復(fù)制終止和端粒酶引物水解（RNA酶）補(bǔ)缺（DNA-pol

）連接（連接酶）1、復(fù)制終止基本過(guò)程*665’PHO3’P5’3’OHO5’PP5’HO3’3’O

兩端單鏈DNA母鏈不填補(bǔ)成雙鏈，就會(huì)被DNase酶解，造成子代染色體末端縮短。*67兩端單鏈DNA母鏈不填補(bǔ)成雙鏈，就會(huì)被DNase酶解端粒染色體端粒(telomere)是指真核生物染色體末端DNA與它的結(jié)合蛋白緊密結(jié)合而形成的特殊結(jié)構(gòu)。端粒的功能：

☆穩(wěn)定染色體末端結(jié)構(gòu)；☆防止染色體間末端連接；☆補(bǔ)償DNA5’末端在清除RNA引物后造成的空缺。*68端粒染色體端粒(telomere)是指真核生物染色端粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)TTTTGGGGTTTTGGGG…共同結(jié)構(gòu)是富含(TmGn)x重復(fù)序列，重復(fù)的次數(shù)由幾十到數(shù)千不等，可反折成二級(jí)結(jié)構(gòu)。引物水解后染色體的3’端比5’端伸出約12～16個(gè)單核苷酸鏈，該特殊結(jié)構(gòu)可募集端粒酶(telomerase)。P5’HO3’3’OP5’5’P3’OH*69端粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)TTTTGGGGTTTTGGGG…共同結(jié)構(gòu)是

端粒酶(telomerase)人端粒酶組成(1997,成功克隆)功能特點(diǎn)RNA和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體，是特殊的反轉(zhuǎn)錄酶。①端粒酶RNA(hTR,能與染色體的3’ssDNA互補(bǔ))②端粒酶協(xié)同蛋白1(hTP1)③端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTRT)

☆以自己的RNA組分作為模板，以染色體3’端的ssDNA作引物,延伸其底物DNA的3’端。*70端粒酶(telomerase)人端粒酶組成功能特點(diǎn)RN

端粒酶催化作用的爬行模型*71-OH-OH-OH(TmGn)x重復(fù)序列端粒酶催化作用的爬行模型*71-OH-OH-OH(TmG

正常細(xì)胞：細(xì)胞分裂

衰老死亡

細(xì)胞年輕化細(xì)胞分裂

導(dǎo)入端粒酶抗衰老端粒、端粒酶與細(xì)胞衰老*72正常細(xì)胞：細(xì)胞分裂衰老死亡細(xì)胞端粒、端粒酶與腫瘤某些腫瘤形成時(shí)可產(chǎn)生端粒缺失、融合、或縮短等現(xiàn)象。☆癌細(xì)胞啟動(dòng)端粒酶基因的表達(dá)，使染色體端粒穩(wěn)定，癌細(xì)胞持續(xù)增殖、轉(zhuǎn)移，獲得永生。腫瘤細(xì)胞（約85%）端粒酶活性增高。☆端粒酶：組織良惡性鑒別指標(biāo)，抑癌靶點(diǎn)。*73端粒、端粒酶與腫瘤某些腫瘤形成時(shí)可產(chǎn)生端粒缺失、融合、或縮*74*74真核與原核生物復(fù)制的主要區(qū)別*75真核與原核生物復(fù)制的主要區(qū)別*75反轉(zhuǎn)錄和其他的復(fù)制方式第四節(jié)*76反轉(zhuǎn)錄和其他的復(fù)制方式第四節(jié)*76逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)現(xiàn)象RNADNA

逆轉(zhuǎn)錄酶為依賴RNA的DNA聚合酶(RNAdependentDNApolymerase,RDDP)。一、反轉(zhuǎn)錄酶和反轉(zhuǎn)錄

1.逆轉(zhuǎn)錄酶活性：以RNA為模板合成DNA2.RNaseH活性：水解RNA-DNA雜合分子中的RNA3.DNA-pol活性：以DNA為模板合成第二條DNA鏈逆轉(zhuǎn)錄酶沒(méi)有3′→5′外切酶活性,無(wú)校對(duì)功能。*77復(fù)制引物：病毒自身的tRNA的3′-OH。逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)圖12-18反轉(zhuǎn)錄酶催化RNA轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA的途徑AAnATTnT5′5′mRNA反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA3′TTnTAAnARnaseHTTnT3′DNApolyIcDNA核酸酶S1雙鏈cDNA3′5′3′5′5′B．試管內(nèi)合成cDNA圖12-18反轉(zhuǎn)錄酶催化RNA轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA的途徑A*79反轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程：受體:CD4輔受體：CCR5/RANTES

或CXCR4/SDF-1gp120*79反轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程：受體:CD4輔受體：CC二、逆轉(zhuǎn)錄研究的意義

（1）擴(kuò)展了中心法則；表明RNA可同時(shí)兼有遺傳信

息傳代與表達(dá)的功能。（2）對(duì)反轉(zhuǎn)錄病毒的研究，有助于腫瘤和艾滋等疾

病發(fā)病機(jī)制和診治的研究。（3）cDNA法、反轉(zhuǎn)錄病毒載體已成為基因工程和

基因治療的重要工具。

1964~1970,Baltimore、Temin和Dulbecco在RSV和MLV研究，發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶、腫瘤病毒和細(xì)胞遺傳物質(zhì)間的相互作用，獲1975諾貝爾生理/醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。*80二、逆轉(zhuǎn)錄研究的意義（1）擴(kuò)展了中心法則；表明RNA可AZT(3’疊氮-2’,3’雙脫氧胸腺核苷)是已用于艾滋病臨床治療的抑制反轉(zhuǎn)錄酶的藥物AZT經(jīng)T淋巴細(xì)胞吸收后轉(zhuǎn)變?yōu)锳ZT三磷酸酯。*81PPP-一方面AZT三磷酸酯與HIV反轉(zhuǎn)錄酶有高親和力，競(jìng)爭(zhēng)性抑制了酶對(duì)dNTP的結(jié)合；

另一方面AZT可被加接到合成中的DNA鏈3′端，但AZT沒(méi)有3′-OH，故病毒DNA合成被迅速終止。AZT(3’疊氮-2’,3’雙脫氧胸腺核苷)是已用于艾滋病三、滾動(dòng)復(fù)制和D環(huán)復(fù)制

某些低等生物中存在一種單向復(fù)制的特殊方式——滾環(huán)復(fù)制（rollingcirclereplication）。如ΦΧ174和M13噬菌體，爪蟾卵rDNA。*82三、滾動(dòng)復(fù)制和D環(huán)復(fù)制某些低等生物中存在一種單

線粒體DNA（mitochondrialDNA,mtDNA）采用另一種單向復(fù)制的特殊方式，稱為D-環(huán)或取代環(huán)式（displacementloop）復(fù)制。*83線粒體DNA（mitochondrialDNA,第五節(jié)DNA損傷(突變)與修復(fù)*84第五節(jié)DNA損傷(突變)與修復(fù)*84基因組DNA分子序列的異常變化，稱為DNA突變(mutation)，或DNA損傷(DNAdamage)。一、突變的意義（1）突變是進(jìn)化的分子基礎(chǔ)（2）突變導(dǎo)致基因多態(tài)性(表型無(wú)差異)產(chǎn)生（3）突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)（4）突變可導(dǎo)致死亡*85基因組DNA分子序列的異常變化，稱為DNA突變(mutati①物理因素:

紫外線(ultraviolet,UV)、各種輻射。②化學(xué)因素：

化學(xué)誘變劑，大多數(shù)是致癌物。③生物誘變劑：*如可移動(dòng)遺傳因子，即能在基因組中移

動(dòng)的DNA序列。

如：病毒(如逆轉(zhuǎn)錄病毒)二、引發(fā)突變的因素*86①物理因素:②化學(xué)因素：③生物誘變劑：二、引發(fā)突變DNA的堿基錯(cuò)配又稱點(diǎn)突變(pointmutation)發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。轉(zhuǎn)換發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。顛換1.錯(cuò)配(mismatch)三、突變的分子改變類型*87DNA的堿基錯(cuò)配又稱點(diǎn)突變(pointmutation鐮形紅細(xì)胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-Val

·

His

·

Leu

·

Thr

·

Pro·Val

·

Glu

·

·

·

·

C肽鏈CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亞基N-Val

·His

·

Leu

·Thr

·

Pro·Glu

·

Glu

·

·

·

·

·

C肽鏈CTCGAG基因*88鐮形紅細(xì)胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-Val·H2.缺失、插入和框移突變?nèi)笔В篋NA丟失一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈。插入：DNA內(nèi)插入一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈。缺失或插入都可導(dǎo)致框移(frameshift)突變或稱移碼突變：*892.缺失、插入和框移突變?nèi)笔В篋NA丟失一個(gè)堿基或一段核苷谷酪蛋絲5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙纈組纈正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引起框移突變*90谷酪蛋由基因重排引起兩種地中海貧血基因型3.重排(rearrangement)DNA分子內(nèi)較大片段的交換，又稱為重組或重排。*91由基因重排引起兩種地中海貧血基因型3.重排(rearrang四、DNA損傷的修復(fù)DNA修復(fù)(DNArepairing)直接修復(fù)(directrepairing)

切除修復(fù)(excisionrepairing)重組修復(fù)(recombinationrepairing)SOS修復(fù)(SOSrepairing)修復(fù)的主要類型對(duì)已改變的DNA分子進(jìn)行補(bǔ)救的措施，使其回復(fù)為原有的結(jié)構(gòu)。*92四、DNA損傷的修復(fù)DNA修復(fù)(DNArepairin1.光修復(fù)(lightrepairing)光修復(fù)酶

UV（一）直接修復(fù)2.斷裂處直接修復(fù)可見光(300~600nm)能激活細(xì)胞內(nèi)的光修復(fù)酶(photolyase)。由電離輻射等引起DNA損傷斷裂，斷裂處兩側(cè)的3′和5′端保持完整，可進(jìn)行直接修復(fù)。*931.光修復(fù)(lightrepairing)光修復(fù)酶UV（二）切除修復(fù)在一系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷部分切除，同時(shí)以另一條完整的鏈為模板，合成出被切除部分的空隙，使DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)的過(guò)程。①堿基切除修復(fù)(baseexcisionrepair,BER)：?jiǎn)蝹€(gè)堿基突變以BER方式進(jìn)行修復(fù)。②核苷酸切除修復(fù)(nucleotideexcisionrepair,NER):

4種蛋白質(zhì)：UvrA(損傷識(shí)別)、UvrB(DNA變性)、UvrC(內(nèi)切酶)和UvrD(解旋酶)*94（二）切除修復(fù)在一系列酶的作用下，將DNA分子圖12-23切除修復(fù)方式：堿基切除修復(fù)和核苷酸切除修復(fù)

*人類著色性干皮病(xerodermapigmentosis,XP;隱性遺傳病)，由相關(guān)基因(XPA、XPB、XPC、XPD、XPF、XPG)缺陷引起。圖12-23切除修復(fù)方式：堿基切除修復(fù)和核苷酸切除修復(fù)*

（三）重組修復(fù)（recombinationrepair）是先復(fù)制后修復(fù)。*96（三）重組修復(fù)（recombinationrep（四）SOS修復(fù)(SOSrepair)是指DNA損傷嚴(yán)重，細(xì)胞處在復(fù)制難以繼續(xù)進(jìn)行的危急狀態(tài)下，誘發(fā)產(chǎn)生的一種應(yīng)急修復(fù)方式。

能誘導(dǎo)切除修復(fù)和重組修復(fù)中某些關(guān)鍵酶和蛋白質(zhì)產(chǎn)生，如uvr，rec基因產(chǎn)物，調(diào)節(jié)蛋白LexA等，構(gòu)成一個(gè)網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控系統(tǒng)。

能誘導(dǎo)產(chǎn)生缺乏校對(duì)功能的DNA聚合酶，故在DNA損傷部位進(jìn)行復(fù)制而避免了死亡，可是卻帶來(lái)了高變異率。*97（四）SOS修復(fù)(SOSrepair)是指DNA原核生物和真核生物DNA復(fù)制的比較原核生物和真核生物DNA復(fù)制的比較第12章DNA的生物合成DNABiosynthesis*99第12章DNA的生物合成DNABiosynthesis*11865年，孟德爾提出遺傳因子的概念。1910年，摩爾根提出基因位于染色體。1909年，約翰遜據(jù)希臘文“給予生命”之義，用“基因(gene)”替代了“遺傳因子(geneticfactor)”。*1001.基因概念的提出和發(fā)展中心法則的提出和發(fā)展1865年，孟德爾提出遺傳因子的概念。1910年，摩爾根提格里非斯和艾弗里的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)赫爾希和沙斯的T2噬菌體侵染細(xì)菌實(shí)驗(yàn)

*1012.遺傳物質(zhì)化學(xué)本質(zhì)的探索遺傳物質(zhì)是DNA格里非斯和艾弗里的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)*32.遺傳物質(zhì)化學(xué)本質(zhì)FranklinDNAX射線衍射圖譜查戈夫等發(fā)現(xiàn)：①A=T，G=C

Watson和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型

*1023.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型FranklinDNAX射線衍射圖譜查戈夫等發(fā)現(xiàn)：①A=DNARNAProtein中心法則TheCentralDogma1958F.Crick翻譯轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制中心法則的補(bǔ)充：①1965年發(fā)現(xiàn)RNA復(fù)制②1970年發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶*1034.中心法則的提出和發(fā)展DNARNAProtein中心法則翻譯轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制中心復(fù)制的基本規(guī)律第一節(jié)*104復(fù)制的基本規(guī)律第一節(jié)*6DNA復(fù)制的概念:復(fù)制親代DNA子代DNA*105親代DNA為模板，按堿基配對(duì)的原則,合成兩個(gè)完全相同的子鏈DNA分子的過(guò)程。DNA復(fù)制的概念:復(fù)制親代DNA子代DNA*7親代DNA為模復(fù)制的基本規(guī)律半保留復(fù)制

(semi-conservativereplication)雙向復(fù)制

(bidirectionalreplication)半不連續(xù)復(fù)制

(semi-discontinuousreplication)*106復(fù)制的基本規(guī)律半保留復(fù)制雙向復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制*8一、半保留復(fù)制親代DNA子代DNA模板一、半保留復(fù)制親代DNA子代DNA模板圖12-1DNA復(fù)制理論上有三種可能形式*108圖12-1DNA復(fù)制理論上有三種可能形式*101958,M.Meselson

&F.W.Stahl設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)*109(1)N15培養(yǎng)基上培養(yǎng)(2)N14培養(yǎng)基上培養(yǎng)(3)培養(yǎng)不同時(shí)間后提取DNA(4)DNA于密度梯度介質(zhì)(5)離心N14對(duì)照組DNAN15親代DNAN14第1代DNAN14第2代DNA1958,M.Meselson&F.W.Sta子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。

半保留復(fù)制的意義*110子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，子代保留了親代的全部遺二、雙向復(fù)制DNA復(fù)制從固定的復(fù)制起始點(diǎn)(origin，Ori)開始，分別向兩個(gè)方向進(jìn)行解鏈、復(fù)制，稱為雙向復(fù)制。復(fù)制叉復(fù)制叉5’3’5’5’3’3’5’3’3’5’原核DNA復(fù)制：?jiǎn)吸c(diǎn)雙向復(fù)制*111二、雙向復(fù)制DNA復(fù)制從固定的復(fù)制起始點(diǎn)(oriOri是指DNA復(fù)制起始時(shí)必需的一段特殊DNA序列。這些短重復(fù)序列能被復(fù)制起始因子所識(shí)別并結(jié)合；一般富含AT堿基。①由多個(gè)獨(dú)特的短重復(fù)序列組成；*112共同特征：Ori是指DNA復(fù)制起始時(shí)必需的一段特殊DNA序列。這些短重A.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)B.復(fù)制中的兩個(gè)復(fù)制叉C.復(fù)制接近終止點(diǎn)(termination,ter)oriterABC原核DNA復(fù)制：?jiǎn)吸c(diǎn)雙向復(fù)制A.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)oriterA5’3’ARSARSARSARS5’3’5’5’3’3’真核DNA復(fù)制：多點(diǎn)雙向復(fù)制復(fù)制子長(zhǎng)度兩個(gè)相鄰復(fù)制起始點(diǎn)之間的距離定為一個(gè)復(fù)制子長(zhǎng)度。*114復(fù)制子(replicon)：獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。

復(fù)制子5’3’ARSARSARSARS5’3’5’5’3’3’真核三、復(fù)制的半不連續(xù)性35353′5′領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)3′5′3′5′*115三、復(fù)制的半不連續(xù)性35353′5′領(lǐng)頭鏈隨從鏈

半不連續(xù)性在DNA復(fù)制過(guò)程中，領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制，隨從鏈不連續(xù)復(fù)制的現(xiàn)象。

岡崎片段(okazakifragment)

指不連續(xù)復(fù)制的片段原核:1000~2000個(gè)核苷酸（nt）

(相當(dāng)于1個(gè)順?lè)醋樱椿虻拇笮?

真核:100~200個(gè)核苷酸（nt）(相當(dāng)于1個(gè)核小體DNA的大小)*116半不連續(xù)性*18DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化第二節(jié)*117DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化第二節(jié)*19底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP；(dNTP)聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶，簡(jiǎn)寫為DNA-pol；模板(template):

解開成單鏈的DNA母鏈；引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白質(zhì)因子。參與DNA復(fù)制的物質(zhì):*118底物(substrate):參與DNA復(fù)制的物質(zhì):*20一、復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)

(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPiDNApol沿5→3方向延長(zhǎng)；模板和引物；聚合反應(yīng)特點(diǎn)：消耗2個(gè)高能磷酸鍵一、復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)(dNMP)n+dNTP(dNM活性：1.53

聚合酶活性，需要引物；

2.35核酸外切酶活性。二、DNA聚合酶是指以DNA作為模板，催化底物dNTP合成DNA的一類酶。全稱：依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)簡(jiǎn)稱：DNA-pol*120活性：1.53聚合酶活性，需要引物；二、DNADNA-pol的5′3′聚合作用3′5

53′3′5DNA-pol5

3′OHP*121DNA-pol的5′3′聚合作用3′553′3′53′5′外切酶5′3′外切酶5′3′內(nèi)切酶3′5′外切酶5′3′外切酶外切酶與內(nèi)切酶作用圖解*1225′3′3′5′外切酶5′3′外切酶5′3′內(nèi)切酶3′5′外（一）原核生物的DNA聚合酶共同點(diǎn)：1.53

的聚合活性，需要引物；

2.35外切酶活性。DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ不同點(diǎn)：DNA-polⅠ還有53外切酶活性。*123（一）原核生物的DNA聚合酶共同點(diǎn)：1.53的聚大腸桿菌三種DNA聚合酶性質(zhì)與功能*124大腸桿菌三種DNA聚合酶性質(zhì)與功能*26功能：對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制

和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。DNA-polⅠ(109kD)*1251959年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主功能：對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制DNA-polⅠ(1沿5→3方向延長(zhǎng)；需模板和引物；消耗2個(gè)高能磷酸鍵。(1)53

的聚合活性的功能:沿5→3方向延長(zhǎng)；需模板和引物；消耗2個(gè)高能磷酸鍵。(1(2)DNA-pol

I

3′5′外切酶活性的功能校讀（proofread）功能5′3′GC將錯(cuò)配的核苷酸從引物鏈的3′端除去

*127(2)DNA-polI3′5′外切酶活性的功能校讀（(3)DNA-pol

I

5′3′外切酶活性的功能切除引物，切除突變片段5′3′*128(3)DNA-polI5′3′外切酶活性的功能切除引323個(gè)氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604個(gè)氨基酸

5核酸外切酶活性；DNA聚合酶活性N端C端枯草桿菌蛋白酶DNA-polⅠ酶切片段Klenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

*129323個(gè)氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/KlDNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因突變，細(xì)菌依然存活；對(duì)模板的特異性不高；它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。

*130DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因*由A.Kornberg的二兒子TomB.Kornberg發(fā)現(xiàn)的。

DNA-polⅢ(含10多個(gè)亞基的異二聚體)核心酶:由α、ε、θ構(gòu)成。*131功能:是原核生物復(fù)制延長(zhǎng)中真正起催化作用的酶。

*由A.Kornberg的二兒子TomB.KornbeDNA-polⅢ同時(shí)合成領(lǐng)頭鏈和隨從鏈*132DNA-polⅢ同時(shí)合成領(lǐng)頭鏈和隨從鏈*34

（二）真核生物的DNA聚合酶*133（二）真核生物的DNA聚合酶*35三、復(fù)制的保真性(fidelity)

（1）按照堿基配對(duì)規(guī)律進(jìn)行復(fù)制，突變率約為1/103；

（2）DNA聚合酶對(duì)模板的依賴性和對(duì)堿基的選擇，使子鏈與母鏈能準(zhǔn)確配對(duì),突變率降低到1/104~5；

（4）DNA修復(fù)系統(tǒng)和復(fù)制起始必須利用引物等機(jī)制，使突變率由1/106~8降低到1/109~10

。

（3）DNA聚合酶3′→5′外切酶功能和5′→3′聚合酶活性實(shí)現(xiàn)的即時(shí)校讀(proofread)，可使突變率由1/104~5降低到1/106~8；*134三、復(fù)制的保真性(fidelity)（1）按照堿基配對(duì)四、復(fù)制中的解鏈和DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化

DNA復(fù)制涉及DNA雙螺旋構(gòu)象變化*135解螺旋酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白引物酶DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶四、復(fù)制中的解鏈和DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化DNA復(fù)制涉及D

種類：解旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和rep蛋白

解旋酶Ⅱ、Ⅲ：沿著隨從鏈的模板，從5’→3’方向，促使復(fù)制叉向前延伸；

rep蛋白(六聚體)：沿著領(lǐng)頭鏈的模板，從3’→5’方向向前移動(dòng)，促使雙鏈不斷解開；（一）解螺旋酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白解螺旋酶(helicase)利用ATP供能，使DNA解旋和解鏈成單鏈。*136種類：解旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和rep蛋白解旋酶Ⅱ、Ⅲ：沿解螺旋酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白協(xié)同作用單鏈DNA結(jié)合蛋白

(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)功能：維持模板單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。*137解螺旋酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白協(xié)同作用單鏈DNA結(jié)合蛋（二）引物酶(primase)DNA復(fù)制時(shí)，利用DNA模板合成一段長(zhǎng)度從幾個(gè)到幾十個(gè)核苷酸的短鏈RNA序列，為DNA聚合酶提供游離3’-OH端延伸合成DNA鏈。原核細(xì)胞的引物酶是專用于合成引物的RNA聚合酶

真核細(xì)胞的引物酶是DNA聚合酶α的兩個(gè)小亞基。

*138

病毒的引物酶多樣化。

（二）引物酶(primase)DNA復(fù)制時(shí)，利用DNA模板合DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶：既能水解DNA分子中的磷酸二酯鍵，又能將其重新連接的核酸酶。功能：快速消除DNA解鏈過(guò)程中所產(chǎn)生的正超螺旋累積，使復(fù)制叉能夠順利前進(jìn)。

（三）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶

(DNAtopoisomerase)

*139DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶：既能水解DNA分子中的磷酸二酯鍵，又能將其

原核和真核生物都發(fā)現(xiàn)了三類拓?fù)洚悩?gòu)酶：TopoⅠ、TopoⅡ和TopoⅢ

原核生物：TopoⅡ?qū)⑶胺降恼菪D(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋；TopoⅠ使DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)，與轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

真核生物：TopoⅠ和TopoⅡ都能清除前方的正超螺旋。作用：通過(guò)切斷、旋轉(zhuǎn)和再連接，理順DNA鏈。

*140原核和真核生物都發(fā)現(xiàn)了三類拓?fù)洚悩?gòu)酶：TopoⅠ、DNA正超螺旋與負(fù)超螺旋負(fù)超螺旋DNA雙螺旋正超螺旋原核TopoⅡ原核TopoⅠ真核TopoⅠ、ⅡDNA聚合酶*141DNA正超螺旋與負(fù)超螺旋負(fù)超螺旋DNA雙螺旋正超螺旋原核To不需ATP切割DNA雙鏈；ATP供能將DNA分子轉(zhuǎn)變成負(fù)超螺旋再連接切口。不需ATP切割雙鏈DNA中的一條鏈，使DNA松弛后,連接切口。TopoⅠ:TopoⅡ：

臨床上使用的喜樹堿、鬼臼乙叉甙等抑制Topo酶活性。作用機(jī)制*142不需ATP切割DNA雙鏈；ATP供能將DNA分子轉(zhuǎn)變成負(fù)超螺五、DNA連接酶(DNAligase)除去RNA引物后，間隙由DNA-polⅠ填補(bǔ)成DNA，缺口由DNA連接酶催化相鄰岡崎片段間的3′-OH和5′-P形成磷酸二酯鍵。注意：不能連接DNA單鏈或RNA單鏈。AMP+PPi*143五、DNA連接酶(DNAligase)除去RNA引物后

在復(fù)制中起最后接合缺口(雙鏈中的單鏈

缺口)的作用；在DNA修復(fù)、重組及剪接過(guò)程中起縫合缺

口的作用；基因工程的重要工具酶之一。DNA連接酶功能*144在復(fù)制中起最后接合缺口(雙鏈中的單鏈DNA連接酶功能*4

參與DNA復(fù)制的主要因子和酶參與DNA復(fù)制的主要因子和酶DNA生物合成過(guò)程第三節(jié)TheProcessofDNAReplication*146DNA生物合成過(guò)程第三節(jié)TheProcessofDNA（一）復(fù)制的起始(initiation)一、原核生物的DNA生物合成

人為分成：起始、延長(zhǎng)和終止三個(gè)階段。引物合成DNA解鏈引發(fā)體生成1.DNA復(fù)制起始點(diǎn)的辨認(rèn)結(jié)合與解鏈原核生物DNA的復(fù)制有一個(gè)特定的復(fù)制起始點(diǎn)；E.coli的復(fù)制起始點(diǎn)稱為oriC，由245bp的保守序列和控制元件組成。*147（一）復(fù)制的起始(initiation)一、原核生物的上游有3組13bp串連重復(fù)序列，為DnaB(解螺旋酶)和DnaC識(shí)別結(jié)合的DNA解鏈元件。

下游有2對(duì)9bp反向重復(fù)序列,為DnaA蛋白(起始因子)識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)辨認(rèn)oriC并解鏈主要需要6種蛋白因子：DnaA(起始因子)、DnaB(解螺旋酶)、DnaC、HU(類組蛋白)、SSB、拓?fù)涿?148上游有3組13bp串連重復(fù)序列，為DnaB(解螺旋酶)和D引物3'HO5'3535引物酶HO3'5'引物酶SSB引物SSBHO3'(DnaG)(DnaG)引發(fā)體：含有解螺旋酶(DnaB)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG)和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)。引物：是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子,能提

供3′-OH。

2.引發(fā)體的形成和引物*149解螺旋酶(DnaB)DnaC引物3'HO5'3535引物酶HO3'5'引物酶（二）復(fù)制的延長(zhǎng)(elongation)在DNA-polⅢ催化下，按堿基互補(bǔ)原則，dNTP以磷酸二酯鍵相連接，逐個(gè)加入延長(zhǎng)中的子鏈上。

*150（二）復(fù)制的延長(zhǎng)(elongation)在DNA-polⅢ領(lǐng)頭鏈：以一段RNA引物開始合成后，通常一直繼續(xù)下去。*151領(lǐng)頭鏈：*53隨從鏈：分段進(jìn)行，需要不斷合成RNA引物和岡崎

片段。*152隨從鏈：分段進(jìn)行，需要不斷合成RNA引物和岡崎*54在營(yíng)養(yǎng)豐富培養(yǎng)基，E.Coli每20分鐘即可分裂一次；其基因組堿基數(shù)為4.6×106bp,

DNA為單點(diǎn)雙向復(fù)制，可推算出復(fù)制速度約115kb/min(1,900bp/s)；真核染色體DNA為多點(diǎn)雙向復(fù)制，復(fù)制叉移動(dòng)速度約1～3kb/min(16~50bp/s)；復(fù)制子長(zhǎng)度為100～200kb，約30～60分鐘內(nèi)完成復(fù)制(25~110bp/s)；完成染色體復(fù)制時(shí)間通常要用6～8小時(shí)。*153在營(yíng)養(yǎng)豐富培養(yǎng)基，E.Coli每20分鐘即可分裂1.原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的匯合點(diǎn)就是復(fù)制的終止點(diǎn)。（三）復(fù)制的終止oriter

E.coli8232SV40oriter500*1541.原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的匯合（三）復(fù)制的終2.終止區(qū)含有多個(gè)約22bp的終止子(terminator)

Tus(terminusutilizationsubstance)蛋白識(shí)別結(jié)合終止子序列并具有反解旋酶活性，Tus-ter復(fù)合物可以抑制DnaB蛋白的解旋作用，阻止復(fù)制叉前進(jìn)。

Tus蛋白還可造成復(fù)制體解體；解體后大約仍有10～100bp未被復(fù)制，可通過(guò)修復(fù)方式填補(bǔ)這一空缺。*1552.終止區(qū)含有多個(gè)約22bp的終止子(terminator3.隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接*1563.隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接*58WhenDNAreplicated,itsstrandsareseparatedbytheenzymehelicase.SinglestrandDNAbindingproteinkeepsthestrandfromre-annealing.OneDNAstrandwecalledtheleadingstrand,whichformfrom5primeto3primeend,usingDNApolymeraseIII,noproblemhere.Butthelaggingstrandpresentsproblem.Ithasformedfrom5primeto3primetoo.ItformspiecescalledOkazakifragments.FirstaRNAprimaselaysdowntheRNAprimer,thenDNApolymeraseIIIlaysdownnewDNA.theprocessrepeatsagainandagain.DNApolymeraseIreplacestheRNAprimerintheDNA,finallyDNAligaselinkstheOkazakifragments.原核生物的DNA生物合成

*157WhenDNAreplicated,itsstran*158半保留復(fù)制

雙向復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制第2節(jié)DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化第1節(jié)DNA復(fù)制的基本規(guī)律第3節(jié)DNA復(fù)制的基本過(guò)程參與DNA復(fù)制的物質(zhì):一、復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)

二、DNA聚合酶三、復(fù)制的保真性(fidelity)四、復(fù)制中的解鏈和DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化

五、DNA連接酶一、原核生物的DNA生物合成:

起始、延長(zhǎng)和終止*60半保留復(fù)制雙向復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制第2節(jié)DNA復(fù)制的二、真核生物的DNA生物合成

復(fù)制起始點(diǎn)多、岡崎片段短、復(fù)制叉前進(jìn)速度慢、參與復(fù)制的酶種類和數(shù)量更多更復(fù)雜。細(xì)胞完成一輪分裂的過(guò)程稱為細(xì)胞周期(cellcycle)，分為4期；在良好營(yíng)養(yǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)胞，歷時(shí)約24小時(shí)。

復(fù)制僅發(fā)生在細(xì)胞分裂的合成期(S期)，而且只復(fù)制一次。*159二、真核生物的DNA生物合成復(fù)制起始點(diǎn)多、岡崎（一）復(fù)制的起始特點(diǎn)：起始點(diǎn)稱自主復(fù)制序列(autonomousreplicationsequence,ARS),

含有11bp富含AT的核心

序列的片段[A(T)TTTATA(G)TTTA(T)];可被起始識(shí)別復(fù)合體

(originrecognitioncomplex,ORC)識(shí)別結(jié)合（在Cdc6和MCM2~7的協(xié)助下）。多起點(diǎn)（染色體上有千個(gè)復(fù)制子）時(shí)序性（分組激活，非同步進(jìn)行）（一）復(fù)制的起始特點(diǎn)：3、酶和蛋白因子：

DNA-pol

/ε（引物酶活性/填補(bǔ)空缺）

DNA-pol（解螺旋酶及聚合酶活性）

增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)

拓?fù)洚悩?gòu)酶(TopoI,TopoII)

復(fù)制因子(RF，如：RFA、RFC)

4、通過(guò)細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA復(fù)制的調(diào)節(jié)：

S期周期蛋白cyclin依賴性激酶CDK磷酸化前復(fù)制復(fù)合物(pre-RC:MCM2~7-ORC/Cdc6-MCM2~7)激活，調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)入S期。

*1613、酶和蛋白因子：4、通過(guò)細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA復(fù)制的調(diào)節(jié)：領(lǐng)頭鏈3535親代DNA5335隨從鏈（二）復(fù)制的延長(zhǎng)DNA-polδ：在PCNA和RF-C協(xié)同下，替代DNA-polα繼續(xù)催化領(lǐng)頭鏈和隨從鏈合成。DNA-polα：催化10個(gè)堿基引物和頭20~30個(gè)堿基組成的DNA合成；*162領(lǐng)頭鏈3535親代DNA5335隨從鏈（二）3`5`3`5`5`3`核小體引物注：當(dāng)隨從鏈延長(zhǎng)了大致相當(dāng)于一個(gè)或若干個(gè)核小

體的長(zhǎng)度(135bp，或135bp的若干倍)就要重

新合成引物長(zhǎng)度。*1633`3`5`核小體引物注：當(dāng)隨從鏈延長(zhǎng)了大致相當(dāng)于一個(gè)或若干5’PHO3’P5’3’OHO5’PP5’HO3’3’OP5’5’P3’OH真核生物染色體DNA是線性結(jié)構(gòu)，新鏈兩端的引物被去除后，新鏈和母鏈分別留下一段空隙和一段單鏈DNA。

（三）復(fù)制終止和端粒酶引物水解（RNA酶）補(bǔ)缺（DNA-pol

）連接（連接酶）1、復(fù)制終止基本過(guò)程*1645’PHO3’P5’3’OHO5’PP5’HO3’3’O

兩端單鏈DNA母鏈不填補(bǔ)成雙鏈，就會(huì)被DNase酶解，造成子代染色體末端縮短。*165兩端單鏈DNA