基因工程菌種類、特征及其構(gòu)建方法

生物制藥工藝Biopharmaceutical駱健:生物制藥工藝學(xué)（教學(xué)安排 第五章多肽與蛋白質(zhì)藥物（2學(xué)時(shí)）第六章核酸藥物（2學(xué)時(shí)） 第八 糖類藥物（2學(xué)時(shí)主要參考（普通高等教育“十一五”國(guó)家級(jí)規(guī) 2007年7 吳梧桐主編.《生物制藥工藝學(xué)》（第二版），中國(guó)科技（高等院校藥學(xué)類規(guī)劃），2006年2月。 吳曉英主編.《生物制藥工藝學(xué)》，化學(xué)工業(yè)出 第四 工程制藥工前 工三個(gè)概念 工程 工程制上兩個(gè)階兩個(gè)特

下一般特自身特為什為什工程藥物成研究熱點(diǎn)天然藥通過(guò)化學(xué)方法合成的藥工程藥工程藥物的3個(gè)階細(xì) 工細(xì) 工程藥物 利用 動(dòng)物生產(chǎn)低成本、高活性的藥 工程gene體行切割、拼接和重新組合入生物體內(nèi)，產(chǎn)生出人們所期望的產(chǎn)物，或創(chuàng)造出具有新的遺傳特征的生物類型，并能使之穩(wěn)定地遺傳給后代。工程（重點(diǎn)geneticallyengineered微生物為操作對(duì)象，通工程技術(shù)獲得的時(shí)也叫重組菌 binantmicroorganism) 或過(guò)時(shí)也叫重組菌 binantmicroorganism)細(xì)細(xì)菌和酵母是重要的表達(dá)重組藥物的制工程制藥（重點(diǎn) 切、拼接、重新組合，與適宜的載體連接，構(gòu)成完整的表達(dá)系統(tǒng)，然后導(dǎo)入宿主生物細(xì)胞內(nèi)，與原有遺傳物質(zhì)整或以質(zhì)粒形式單獨(dú)在細(xì)胞中繁殖，并表達(dá)活性蛋白質(zhì)、多肽或核酸等藥物。19731973年重組DNA技術(shù)建19901990動(dòng)人組計(jì)劃1999國(guó)加入組計(jì)劃2003年多國(guó)科學(xué)家宣布完成所有1976年世界上第一 工程技術(shù)開發(fā)藥物的公- 技術(shù)公1982年世界上第一 工程藥物重組人胰島 禮來(lái)公工工程技術(shù)首先領(lǐng)域，主要領(lǐng)域?qū)?，現(xiàn)有60-工程藥物的研究和商品化已上市或研究熱點(diǎn) 工程藥物主要有（1）乙型肝 （2）人白細(xì)胞干擾 工程人胰島素（4）人白細(xì)胞介素人生長(zhǎng)激素人組織纖溶酶原激活劑人促紅細(xì)胞生成素細(xì)胞集落刺激因子世界生物技術(shù)藥物的銷售額將以年均世界生物技術(shù)藥物的銷售額將以年均0-5％速度增加， 工程藥物在藥物市場(chǎng)中將占5％。生物技術(shù)的發(fā)源地,工程藥物的國(guó)家,據(jù)統(tǒng)計(jì)約2000家(包括1300公司其中約300 歐洲共有約歐洲共有約1000家生物技術(shù)公司, 體和5 重。?實(shí)力及市場(chǎng)。 通產(chǎn)估計(jì)，2001年 總市場(chǎng)達(dá)到3兆日元。我 工程藥物研究開發(fā)現(xiàn) 工程一類新藥α1b干擾素,成為我國(guó)批準(zhǔn)生產(chǎn)的第一個(gè) 工程一類新藥，成為“863”計(jì) (重點(diǎn)(重點(diǎn)獲目將重組體入宿獲目將重組體入宿主細(xì)構(gòu)DNA重組除菌過(guò)分離純除菌過(guò)分離純表達(dá)產(chǎn)培工程半成品檢半成品檢制成品檢包工程藥物生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵問(wèn)目 的獲——首先必須獲得符合人們要求的 段，這種

適當(dāng)?shù)妮d體質(zhì)?；蚴删w中并轉(zhuǎn)——表達(dá)系統(tǒng)的要保證表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能，其次是表達(dá)量的多少和分離純化的難易。大腸桿菌和其他宿主菌（細(xì)胞），——表達(dá)系統(tǒng)的要保證表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能，其次是表達(dá)量的多少和分離純化的難易。。我我國(guó)術(shù)”與國(guó)際水平相比3－5年但“下游技術(shù)”卻少相差15 上 工工制藥技 下

獲得目獲得重組 工程菌的發(fā)制成品的檢定工程制藥工藝的特一般特點(diǎn)發(fā)酵在常溫常壓下進(jìn)行，反應(yīng)安全，對(duì)條件的要求比較簡(jiǎn)單；原料可使用農(nóng)副產(chǎn)品，來(lái)源廣泛，使用方便。自身特點(diǎn)（重點(diǎn)發(fā)酵產(chǎn)物比常規(guī)菌更加純粹和單一能大幅度提高產(chǎn)物的含量能合成外 編碼的產(chǎn)物工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵問(wèn) 第四 工程菌發(fā)酵制藥工工程菌的種類、特征及其構(gòu)建方法（2學(xué)時(shí)工程菌發(fā)酵的分子與細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)（2學(xué)時(shí)工程菌的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)特征（2學(xué)時(shí)工程菌發(fā)酵的工藝過(guò)程與操作技術(shù)（2學(xué)時(shí)工程菌發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程的檢測(cè)與控制（2學(xué)時(shí)本節(jié)主要教學(xué)要求掌握工程菌的概念，熟悉工程大腸桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)的生物學(xué)特性和表達(dá)特點(diǎn)，掌握工程工程制藥微生物表達(dá)系大腸桿菌表達(dá)系酵母表達(dá)系工程菌的構(gòu)工程大腸桿菌的構(gòu)工程制藥微生物表達(dá)系選擇依據(jù)：表達(dá)功能；表達(dá)量的多少；分離純化的難生物生物學(xué)系表達(dá)特優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)與不應(yīng)用情?。┘?xì)胞壁：較薄，約3nm。由肽聚糖和脂多糖構(gòu)成。細(xì)胞 性的內(nèi)毒素，具有抗原性，大腸菌產(chǎn)生熱ⅱⅱ）外膜：細(xì)胞壁外ⅵ）擬核：細(xì)胞核無(wú)核膜，一條環(huán)狀ⅵ）擬核：細(xì)胞核無(wú)核膜，一條環(huán)狀

常為細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)所占據(jù)。工）細(xì)胞質(zhì)：呈漿狀，含有各種生物大分子。如酶、mRNA、tRNA、核糖體，有機(jī)化合物及離子，代謝的主要場(chǎng)所。細(xì)胞質(zhì)含有細(xì)胞核外遺傳物質(zhì)，如質(zhì)粒為雙鏈環(huán)狀DNA，負(fù)責(zé)細(xì)菌的抗性，有編碼抗生素的等，是進(jìn) 工程的重要載體

和排出廢最簡(jiǎn)單原核細(xì)最簡(jiǎn)單原核細(xì)胞生物、桿狀，(2-4)μm×(0.4-單細(xì)胞微生物，裂殖37℃下，17分鐘繁組于1996年完成組大小為4600組于1996年完成組大小為4600閱讀開放開架4288個(gè)，編碼3000多種蛋白質(zhì)質(zhì)粒（plasmid）是一類存在于細(xì) 工程中發(fā)展最早、應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典的表達(dá)系統(tǒng)工程中發(fā)展最早、應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典的表達(dá)系統(tǒng)—大腸桿菌K-12株的衍生外源蛋白的表達(dá)形式：細(xì)胞內(nèi)的不溶性表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)。外源蛋白的表達(dá)形式：細(xì)胞內(nèi)的不溶性表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的主要位置是在細(xì)胞質(zhì)優(yōu)點(diǎn)：（1)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建簡(jiǎn)單；2）目標(biāo)蛋白的表達(dá)量高；缺點(diǎn)：容易形成包涵體，尤其真核 表達(dá)。不溶性表達(dá)：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成包涵優(yōu)點(diǎn)能夠表達(dá)對(duì)大腸桿菌宿 或者致死效應(yīng)的外源蛋白缺點(diǎn)：獲得活性產(chǎn)物必須經(jīng)過(guò)變性、純化、復(fù)性等過(guò)程，不僅增加了工藝的難度和成本，而且不是所有的產(chǎn)物都能完全恢復(fù)到一致的活性，產(chǎn)品質(zhì)量不易控制?？扇苄员磉_(dá)：存在于細(xì)胞質(zhì)?？山?jīng)過(guò)加工 分泌到周質(zhì)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)（1）細(xì)胞質(zhì)微環(huán)境的氧化還原態(tài)勢(shì)不利于二硫鍵形成，目的蛋白在細(xì)胞質(zhì)中不能正確折疊；（2）哪一種表達(dá)形式更有利優(yōu)點(diǎn)(1)外源蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)空間中信號(hào)肽被切除，有效避免N??發(fā)展??發(fā)展最早、應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典遺傳背景清楚、目表達(dá)水平高（達(dá)70％）養(yǎng)周期短，抗污染優(yōu)不 大腸桿菌中的表達(dá)不存在信號(hào)肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提；沒(méi)有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等蛋白翻譯后修飾加工的亞細(xì)胞器，糖基化、酰胺化等；細(xì)胞后，細(xì)胞壁脂多糖游離出來(lái)形成內(nèi)毒素，具有抗原產(chǎn)物蛋白質(zhì)的N 白喉毒素-IL2融合蛋白、OspA脂蛋白 ）等(3-6)μm×(5-10)μm。酵母菌無(wú)鞭毛，不能游動(dòng)酵母系生物學(xué)特酵母生長(zhǎng)迅速酵母生長(zhǎng)迅速，倍增期酵母細(xì)胞結(jié)甘露聚糖（外層酯類、蛋甘露聚糖（外層酯類、蛋白（中間層少葡聚幾丁因種厚度為0.2莢膜物質(zhì)莢膜物質(zhì)：有些酵母（例如：隱球酵細(xì)細(xì)胞核：酵母菌具有由多孔核起來(lái)的定形細(xì)胞核線線粒體：兩層單位膜包圍的一種細(xì)胞液泡液泡：?jiǎn)螌幽ぐ鼑囊环N細(xì)胞器內(nèi)質(zhì)網(wǎng)：由脂質(zhì)雙分子層圍成的細(xì)胞器成熟細(xì)胞長(zhǎng)出一個(gè)小芽，到一定程度后脫 繼續(xù)長(zhǎng)成 酵母兩 不同的單倍體細(xì)胞靠近，相互接觸接觸處細(xì)胞 ，質(zhì)核配 能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖等 釀酒酵母有17， 1996年完成其 ，遺傳背景已經(jīng)相當(dāng)清楚 組為12068kb，閱讀開放開架5887個(gè)，編碼約 。比單。比單細(xì)胞的原核生物和古細(xì)菌大一個(gè)數(shù)量級(jí)1974年Clarck-Walker和Miklos 酵母的表達(dá)載體是穿梭載體，能在大腸桿菌和酵母中復(fù)制?？寺≡诖祟愘|(zhì)粒上的外源可以不用更換載體直接從一種宿主菌轉(zhuǎn)入另一種宿主細(xì)胞中并且遺傳。優(yōu)點(diǎn)①遺傳背景清楚，是研 表達(dá)最有效的單細(xì)胞真核微生物②遺傳操作容易、安③繁殖迅速，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)成④亞細(xì)胞器分化，能進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯后的修飾和加工（產(chǎn)物可糖基化），缺點(diǎn)①修飾的蛋白質(zhì)糖基化側(cè)鏈過(guò)長(zhǎng)，過(guò)度糖基化會(huì)引起副②釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，制約了高密③畢赤酵母可克服釀酒酵母的這兩個(gè)缺陷，糖基化功能更接近高等真核生改造難度大。1981年Hitzman 激素類：6種人胰島素及1種突變體，尿酸水解酶和水蛭細(xì)胞因子：粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因（GM-CSF）（細(xì)胞集落刺激因子：刺多肽類 等，8種產(chǎn) 人粒細(xì)胞集落刺激因德國(guó)：Merck公

丹麥:諾和諾

：Immunex公第二：大腸桿菌質(zhì)粒又是最常用的質(zhì)粒，因?yàn)榇竽c桿菌質(zhì)粒上有諸如抗青霉素等易于檢測(cè)的標(biāo)記，并且容易使目的在宿主細(xì)胞中和表達(dá)。第三：大腸桿菌是一種典型兼性厭氧細(xì)菌，由于體積小，表面積與體積的比例很大，并且能利用氧氣進(jìn)行徹底生物氧化釋放大量能量，因而能夠與外界迅速進(jìn)行物質(zhì)和能量交換，并在體內(nèi)迅速轉(zhuǎn)化。這樣一來(lái)使大腸桿菌新陳代謝極其迅速，就如同一個(gè)效率極高的化工廠，而與真正化工廠相比所需反應(yīng)條件又很溫和，容易達(dá)到，其經(jīng)濟(jì)效益是顯而易見(jiàn)的。工程菌的構(gòu)— 工程大腸桿菌 工程菌的構(gòu)建是生物藥物生產(chǎn)的前提，菌株的優(yōu)劣直接關(guān)系到生產(chǎn)的成敗。工程菌具備的條件（重點(diǎn)容易培目表達(dá)目表達(dá)載體DNADNADNA分子體外重組過(guò)目 的獲 tinggene)：編 目標(biāo)的正確克隆在整個(gè)構(gòu)建中至關(guān)重要，因?yàn)橹灰幸粋€(gè)堿基發(fā)生變化就可能導(dǎo)致編碼氨基酸的變化，從而影響蛋白質(zhì)的功能和生物學(xué)活性。目目 克隆的方PCR擴(kuò)增：容易簡(jiǎn)文庫(kù)篩選：適合未知序列 克隆，過(guò)程繁瑣復(fù)雜，成本昂化學(xué)合成：完全已知的序列，適合較 （小于100bp）PCR擴(kuò)增目聚合酶鏈(polymerasechainreaction,PCR)由DNA聚合酶催化下，對(duì)特定的DNA序列進(jìn)行 反應(yīng)本質(zhì)：生物體的 發(fā)明者：1985年，Mullis，生物技 性象征ABI*2720/9700型PCRPCR是一個(gè)重復(fù)性的循環(huán)過(guò)程PCR是一個(gè)重復(fù)性的循環(huán)過(guò)程,每循環(huán)結(jié)束，目的片段的數(shù)量PCRPCR 模板DNA:待擴(kuò)增的目 序列,100－10000bp,引物:兩條寡核苷酸。引物設(shè)計(jì)對(duì)擴(kuò)增成功、特異性與效率至關(guān)重要。根據(jù)目標(biāo) 序列，設(shè)計(jì)上下游引物，長(zhǎng)度一般為21～27p。注意退火溫度，一般在50-65之間，溫度越高，特異性越強(qiáng)，防止二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，目前有很多計(jì)算機(jī)軟件輔助設(shè)計(jì)引物，可供使用。脫氧核苷酸：4dATP,dCTP,dGTP,Taq聚合酶，Vent酶和Tli酶比Taq酶更好，具有更高的保真性和熱穩(wěn)定性，可根據(jù)克隆的長(zhǎng)度和要求選擇。緩沖溶液：50mMKCl、10mMTris－HCl,1.5mM退火溫度：低；太低不能特異配對(duì)，引起非特異性擴(kuò)增。一般比理論計(jì)算溫度值低35℃。延伸溫度：聚合酶最適溫度，一般72-78℃PCR循環(huán)數(shù)：根據(jù)加入的模板DNA量、擴(kuò)增效率而定。一、無(wú)引物、無(wú)聚合酶等對(duì)照，以便檢PCR的進(jìn)行和結(jié)果設(shè)計(jì)PCR程序(溫度,時(shí)間,循環(huán)數(shù))，目標(biāo)優(yōu)化退火溫度和時(shí)間 符的擴(kuò)增產(chǎn)物及其特異性。表達(dá)表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程與目 克隆相似 表達(dá)載體：expression在質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，在多克隆位點(diǎn) 外 表達(dá)盒構(gòu)適位點(diǎn)上的任何外源均能在宿主細(xì)胞中高效表達(dá)。最常見(jiàn)的大腸桿菌來(lái)源的啟動(dòng)子是lac，tac等正調(diào)控和lacI的負(fù)調(diào)控。IPTG等乳糖類似物是其誘導(dǎo)物。Tac啟動(dòng)子（乳糖和色氨酸的雜合啟動(dòng)子)：僅受lacI調(diào)控，不 菌體啟動(dòng)子，受lacI阻遏，能被IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。（30℃）阻遏物有活性，抑制轉(zhuǎn)錄，而高溫（42℃）？？該實(shí)驗(yàn)流程中對(duì)是什么克隆非常重要的一目 的擴(kuò)酶切鑒定：是否有目 方向是否正 確證：目 的序列準(zhǔn)確無(wú)誤，閱讀框架通讀概念：在特異位點(diǎn)上催化雙鏈DNA分子的斷裂，產(chǎn)生相 反應(yīng)條件：適宜溫度(37℃)，1小時(shí)以上終止反應(yīng)：加熱；加入EDTA酶切完全性的電泳檢查：只有末端完全匹配的目標(biāo)片段與質(zhì)粒片段才能實(shí)現(xiàn)正確的，不完全酶切會(huì)大大降概念：在連接酶的催化下，將DNA雙鏈上相鄰的3′羥基和5′磷酸共價(jià)結(jié)合形成3′-5′磷酸二酯鍵，使原來(lái)斷開的DNA缺口連接體系：具有可連接末端的片段、載體片段、緩沖液、連接酶（大腸桿菌DNA連接酶、T4DNA連接）。連接反應(yīng)：16℃-26℃，0.5-8小時(shí),或過(guò)夜終止反應(yīng)：在70℃加熱10分鐘轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)化（transformation）:某 型細(xì)胞的DNA型細(xì)胞從周圍介質(zhì)中吸收型和表型發(fā)生相應(yīng)現(xiàn)象.或者也可以說(shuō)將重組DNA分子 binantmolecule）人工導(dǎo)入到宿主細(xì)胞的過(guò)程常用方法有物理、化學(xué)、生物學(xué)等多 。對(duì)于大腸桿菌最常用CaCl2 感受態(tài)，熱擊法實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞類型有轉(zhuǎn)化子（transformant）：含有載體或重組分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞;非轉(zhuǎn)化子（nat）：無(wú)載體或重組分子的宿主細(xì)胞;重組子（binant）有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化細(xì)； binant）：僅含有空載體分子的轉(zhuǎn)化期望重組子(目標(biāo)重組子)：只含有目 的重組子非期望重組子(非目標(biāo)重組子)：不含目 的重組；DNA體外重組實(shí)驗(yàn)中，外源N 段與載體DNA的連接反應(yīng)物一般不經(jīng)分離直接用于轉(zhuǎn)化，由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到，因此必須使用各種篩選與鑒定 區(qū)分。從大量被轉(zhuǎn)化的宿主菌中篩選出含有完整表達(dá)載體或外、遺傳性穩(wěn)定、能夠高效表達(dá)出目標(biāo)產(chǎn)物的重組菌胞克隆對(duì)構(gòu)建正確的表達(dá)載體，經(jīng)適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化單單菌落的抗生素篩選、藍(lán)白斑篩選、菌落雜交、PCR等胞克隆取單菌落劃線在另一固體平板培養(yǎng)基比較各克隆之間的單細(xì)胞所含的質(zhì)?？截悢?shù)。對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切和PCR擴(kuò)增鑒定，篩選鑒定質(zhì)粒的完整性和所含質(zhì)粒是否為表達(dá)載體。對(duì)酶切鑒定正確的克隆進(jìn)行質(zhì)粒，篩選外源編碼序列準(zhǔn)確無(wú)誤的克隆目標(biāo)

工程 內(nèi)容工程菌的遺傳穩(wěn)定性篩 DH5a菌轉(zhuǎn)化時(shí)，可與載體編碼的β－半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)αBL21(DE3)菌用于高效表達(dá)克隆于含有噬菌體T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體如T系列）的 。7噬菌體RNA聚合酶位于λ噬菌體區(qū)，該區(qū)整合于BL2的 上。該菌適合表達(dá)非毒性蛋白。BL21(DE3)pLysS菌 JM109菌活性，由此很容易鑒別重組體菌株。TOP10菌HB101菌菌株遺傳性能穩(wěn)定，使用方便，適用于各 重組實(shí)驗(yàn)RosettaTM菌 工程菌的表達(dá)篩 常常以表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的量及形式（DS－PAG電泳檢查）為主要 對(duì)象，結(jié)合表達(dá)載體的穩(wěn)定性，對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲得遺傳性穩(wěn)定、高效表達(dá)的工程菌。工程菌的表達(dá)產(chǎn)物根據(jù)質(zhì)粒的類型分為工程菌的表達(dá)產(chǎn)物根據(jù)質(zhì)粒的類型分為工工程菌表達(dá)時(shí)的影響參數(shù)：接種量、誘導(dǎo)條件（導(dǎo)物濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、發(fā)酵溫度）、誘導(dǎo)前細(xì)胞生長(zhǎng)間、誘導(dǎo)后細(xì)胞密度、培養(yǎng)基組成及其添加物等誘導(dǎo)物的濃度及其發(fā)酵溫度：影響產(chǎn)物的表達(dá)量，甚至是產(chǎn)物的存在形式.1)1)啟動(dòng)子：lac（乳糖啟動(dòng)子）、tac（乳糖和色氨酸的雜合啟動(dòng)子)、T7噬菌體啟動(dòng)子等2)2)啟動(dòng)子：PL、PR啟動(dòng) 達(dá)目 的細(xì)胞才能用于工業(yè)化生產(chǎn) 表達(dá)部位：胞外，周質(zhì)，胞內(nèi)；存在形式：包涵體，可形成包涵體的原 只靠只靠PAGE能否確定目標(biāo)蛋白的表達(dá)？如果不能，還有什么方法？ 表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定 外 大量表達(dá)產(chǎn)生特異蛋白時(shí)，代謝壓力相當(dāng)大質(zhì)粒不穩(wěn)定 不穩(wěn)定性： 質(zhì)粒分配不穩(wěn)定性：質(zhì)粒在子代細(xì)胞中分配不均一而導(dǎo)致部分 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性由于質(zhì)粒DNA中的缺失、 培養(yǎng)條件引起的質(zhì)粒不穩(wěn)定性：質(zhì)粒的穩(wěn)定性與生長(zhǎng)速率的變化相關(guān)。一般條件下，攜有質(zhì)粒細(xì)胞的生長(zhǎng)速率低于無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞。怎么通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析質(zhì)粒的不穩(wěn)定性主要是質(zhì)粒穩(wěn)定性試驗(yàn)。常用平板稀釋計(jì)數(shù)和平板點(diǎn)種法以菌種的選擇性是否存在來(lái)判斷質(zhì)粒的丟失情況即分配穩(wěn)定性平板點(diǎn)種法是將菌液涂布在非選擇性培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出 再接種到選擇性培養(yǎng)基上，驗(yàn)證質(zhì)粒的丟失此外，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的檢測(cè)需要從單菌落中提取質(zhì)粒，酶切凝膠電泳 分析其結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化。也可對(duì)單菌落進(jìn)行標(biāo)產(chǎn)物蛋白質(zhì)的表達(dá)分析，由此推斷目標(biāo)DNA的結(jié)構(gòu)是否發(fā)生化培養(yǎng)條件與質(zhì)粒穩(wěn)定性的關(guān)(1)(1)溫 如大腸桿菌最有利于質(zhì)粒穩(wěn)定的溫度是3