獸醫(yī)現(xiàn)代監(jiān)測(cè)診斷技術(shù)培訓(xùn)課件

獸醫(yī)現(xiàn)代監(jiān)測(cè)診斷技術(shù)

張東

四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心研究員獸醫(yī)監(jiān)測(cè)診斷技術(shù)在動(dòng)物疫病防控和獸醫(yī)公共衛(wèi)生工作中具有重要作用，是預(yù)防、控制和撲滅重大動(dòng)物疫病中的重要一環(huán)，為養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展和公共衛(wèi)生安全提供保障。前言提綱面臨的復(fù)雜形勢(shì)

動(dòng)物疫病診斷技術(shù)現(xiàn)狀

檢測(cè)技術(shù)發(fā)展方向與未來(lái)展望

1面臨的復(fù)雜形勢(shì)

動(dòng)物疫病種類多

農(nóng)業(yè)部《一、二、三類動(dòng)物疫病病種名錄》中列入157種；其中一類17種；二類77種；三類63種。OIE《陸生動(dòng)物衛(wèi)生法典》2010版中列入94種；包括多種動(dòng)物共患病26種；牛病14種；綿羊和山羊病11種；馬病11種；豬病8種；禽病14種；兔病2種；蜂病6種；其他疫病2種。新發(fā)動(dòng)物疫病威脅國(guó)外威脅：非洲豬瘟（俄羅斯）等；周邊省威脅：小反芻獸疫（西藏）、

口蹄疫A型（2008年湖北）等；新發(fā)亞型：口蹄疫亞洲I型（2005年出現(xiàn)）等。動(dòng)物疫病病原型別多、變異快口蹄疫：7個(gè)型，多個(gè)亞型；我國(guó)O型、亞洲I型（2005年4月傳入中國(guó)）、A型流感：A、B、C3個(gè)型；A型：H1~H16亞型；H5亞型：變異株不斷出現(xiàn)……疫苗：-1、-4、-5株……PRRS：1996年美洲型；2006年變異株；2009年歐洲型1株。另外，還有小反芻獸疫（西藏）、瘋牛病、非洲豬瘟、尼帕病……等外來(lái)重大疫病的威脅2010年列入國(guó)家監(jiān)測(cè)計(jì)劃的動(dòng)物疫?。?6種）高致病性禽流感、口蹄疫、高致病性藍(lán)耳病、豬瘟雞新城疫、布魯菌病、牛結(jié)核病、血吸蟲(chóng)病、狂犬病牛海綿狀腦病、癢病、牛傳染性胸膜肺炎、牛瘟、小反芻獸疫、非洲豬瘟、藍(lán)舌病國(guó)家強(qiáng)制免疫動(dòng)物疫病外來(lái)動(dòng)物疫病主要疫病的國(guó)家指定監(jiān)測(cè)方法病名指定診斷方法口蹄疫正向間接血凝試驗(yàn)、液相阻斷ELISAVP1-ELISA高致病性禽流感血凝抑制試驗(yàn)（HI）豬瘟正向間接血凝試驗(yàn)、阻斷ELISA高致病性豬藍(lán)耳病ELISA、雞新城疫血凝抑制試驗(yàn)（HI）布魯菌病虎紅平板試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)血吸蟲(chóng)病斑點(diǎn)ELISA、免疫金標(biāo)快速試紙條牛結(jié)核病結(jié)核菌素變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)地市級(jí)、縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室的適用試驗(yàn)技術(shù)縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室地市級(jí)實(shí)驗(yàn)室凝集試驗(yàn)（高致病性禽流感、口蹄疫、豬瘟、新城疫等病）；ELISA（豬瘟、口蹄疫、高致病性藍(lán)耳病等?。┛h級(jí)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展的試驗(yàn)技術(shù)RT-PCR技術(shù)（豬瘟，PRRS等病）省內(nèi)診斷試劑劑使用的現(xiàn)狀狀主要診斷試劑劑提供單位有：：蘭州獸醫(yī)研究究所哈爾濱獸醫(yī)研研究所豬瘟和口蹄疫疫O型正向間接血血凝；口蹄疫Ａ型、、Asia—I和O型液相阻斷ELISA；3ABC-ELISA，VP1-ELISA；豬圓環(huán)病毒ELISA；禽流感H5血凝抑制抗原；；雞新城疫血凝凝抑制抗原；；其他：豬藍(lán)耳病ELISA——法國(guó)進(jìn)口；豬偽狂犬、豬豬細(xì)小病毒ELISA——荷蘭賽迪診斷斷公司；豬藍(lán)耳病RT-PCR，豬乙型腦炎炎R(shí)T-PCR，豬細(xì)小病毒PCR等——北京愛(ài)德士元元亨生物技術(shù)術(shù)有限公司。。疫苗種類各異異、診斷試劑劑和方法多樣樣以口蹄疫為例例抗體檢測(cè)試劑劑品種病原檢測(cè)試劑劑品種正向間接血凝凝瓊脂凝膠免疫疫擴(kuò)散試劑液相阻斷ELISA試劑盒非結(jié)構(gòu)蛋白ELISA試劑盒(3ABC)結(jié)構(gòu)蛋白ELISA試劑盒（VP1）免疫膠體金試試劑盒（測(cè)抗抗體）RT-PCR試劑盒熒光RT-PCR試劑盒ELISA試劑盒免疫膠體金試試劑盒（測(cè)抗抗原）反向間接血凝凝試劑國(guó)內(nèi)動(dòng)物疫病病診斷試劑存存在的主要問(wèn)問(wèn)題技術(shù)方法：標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)?各企業(yè)生產(chǎn)診診斷試劑的的的標(biāo)準(zhǔn)不一。。診斷試劑：文文號(hào)？302個(gè)產(chǎn)品中，有有新獸藥證書(shū)書(shū)產(chǎn)品7.6%，有生產(chǎn)批準(zhǔn)準(zhǔn)文號(hào)產(chǎn)品4.3%，列入標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)產(chǎn)品7%。法規(guī)管理：完完善？市場(chǎng)秩序混亂亂：國(guó)內(nèi)生產(chǎn)產(chǎn)企業(yè)不具有有資質(zhì)、產(chǎn)品品無(wú)新獸藥證證書(shū)或批準(zhǔn)文文號(hào)、國(guó)外生產(chǎn)企業(yè)業(yè)注冊(cè)生產(chǎn)的的產(chǎn)品進(jìn)入國(guó)國(guó)內(nèi)未經(jīng)注冊(cè)冊(cè)、非法生產(chǎn)產(chǎn)產(chǎn)品產(chǎn)品質(zhì)質(zhì)量：：不齊齊？1.質(zhì)量水水平低低，試試驗(yàn)特特異性性不高高，產(chǎn)產(chǎn)品保保質(zhì)期期短；；2.適用范范圍窄窄，操操作復(fù)復(fù)雜；；3.生產(chǎn)能能力小小，購(gòu)購(gòu)買(mǎi)難難；4.檢測(cè)目目的不不明確確（型型/亞型、、感染染/免疫抗抗體等等）。。國(guó)外動(dòng)動(dòng)物疫疫病診診斷試試劑進(jìn)口獸獸用診診斷試試劑質(zhì)質(zhì)量好好，但但是成成本高高、購(gòu)購(gòu)買(mǎi)周周期長(zhǎng)長(zhǎng)，有有的不不適合合中國(guó)國(guó)的實(shí)實(shí)際情情況。。國(guó)內(nèi)獸獸用診診斷試試劑問(wèn)問(wèn)題之之根源源行業(yè)特特點(diǎn)產(chǎn)品種種類多多，成成分復(fù)復(fù)雜，，生命命周期期長(zhǎng)，，技術(shù)術(shù)含量量高，，質(zhì)量量要求求嚴(yán)格格，單單位用用量小小投入資資金巨巨大，，產(chǎn)品品開(kāi)發(fā)發(fā)周期期長(zhǎng)監(jiān)管措措施不不完善善研發(fā)：：基礎(chǔ)礎(chǔ)研究究、高高科技技研究究投入入力度度小，，科研研與生生產(chǎn)脫脫節(jié)。。生產(chǎn)、、經(jīng)營(yíng)營(yíng)：企企業(yè)規(guī)規(guī)模小小、效效率低低、利利潤(rùn)低低，發(fā)發(fā)展不不均衡衡，且且部分分沒(méi)有有生產(chǎn)產(chǎn)資質(zhì)質(zhì)；診診斷試試劑注注冊(cè)審審批程程序繁繁瑣，，進(jìn)入入市場(chǎng)場(chǎng)門(mén)檻檻高。。使用：：盲目目選擇擇診斷斷試劑劑，采采購(gòu)、、驗(yàn)收收、保保藏制制度不不健全全。產(chǎn)業(yè)化化和商商品化化發(fā)展展滯后后，非非法診診斷試試劑產(chǎn)產(chǎn)品市市場(chǎng)占占有比比例大大。動(dòng)物疫疫病診診斷試試劑行行業(yè)發(fā)發(fā)展建建議先進(jìn)的的產(chǎn)學(xué)學(xué)研模模式，，提高高自主主創(chuàng)新新能力力，建建設(shè)科科研院院所和和企業(yè)業(yè)的產(chǎn)產(chǎn)業(yè)鏈鏈嚴(yán)格市市場(chǎng)準(zhǔn)準(zhǔn)入完善的的質(zhì)量量監(jiān)控控體系系，進(jìn)進(jìn)行規(guī)規(guī)范化化、標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化化管理理達(dá)到擴(kuò)擴(kuò)充獸獸用診診斷試試劑種種類，，提高高產(chǎn)品品質(zhì)量量，滿滿足動(dòng)動(dòng)物疫疫病監(jiān)監(jiān)測(cè)、、診斷斷工作作需要要2動(dòng)物疫疫病診診斷技技術(shù)現(xiàn)現(xiàn)狀常用實(shí)實(shí)驗(yàn)室室檢測(cè)測(cè)技術(shù)術(shù)組織病病理學(xué)學(xué)檢測(cè)測(cè)技術(shù)術(shù)血清學(xué)學(xué)檢測(cè)測(cè)技術(shù)術(shù)分子生生物學(xué)學(xué)檢測(cè)測(cè)技術(shù)術(shù)病原學(xué)學(xué)檢測(cè)測(cè)技術(shù)術(shù)組織病病理學(xué)學(xué)檢測(cè)測(cè)技術(shù)術(shù)1.病理學(xué)學(xué)檢測(cè)測(cè)技術(shù)術(shù)是利用用疫病病引起起的動(dòng)動(dòng)物組組織發(fā)發(fā)生特特征性性的病病變和和病理理變化化對(duì)動(dòng)動(dòng)物疫疫病進(jìn)進(jìn)行診診斷。。2.免疫病病理學(xué)學(xué)檢測(cè)測(cè)技術(shù)術(shù)(免疫組組織化化學(xué)技技術(shù))免疫組組織化化學(xué)方方法不不僅可可在臟臟器組組織中中特異異地檢檢出病病原,又可發(fā)發(fā)揮病病理學(xué)學(xué)檢測(cè)測(cè)所具具有直直觀、、抗原原定位位準(zhǔn)確確的特特點(diǎn),還可在在臟器器組織織原位位檢測(cè)測(cè)出病病原（（原位位PCR）的同同時(shí)，，觀察察到組組織病病變與與該病病原的的關(guān)系系，從從而有有助于于了解解疫病病的發(fā)發(fā)病機(jī)機(jī)理和和病理理過(guò)程程。血清清學(xué)學(xué)檢檢測(cè)測(cè)技技術(shù)術(shù)按其其反反應(yīng)應(yīng)性性質(zhì)質(zhì)的的不不同同可可分分為為：：凝集集性性反反應(yīng)應(yīng)(如凝凝集集試試驗(yàn)驗(yàn)和和沉沉淀淀試試驗(yàn)驗(yàn))標(biāo)記記抗抗體體技技術(shù)術(shù)(包括括熒熒光光抗抗體體、、酶酶標(biāo)標(biāo)抗抗體體、、放放射射性性標(biāo)標(biāo)記記抗抗體體等等特點(diǎn)點(diǎn)：：敏感感、、快快速速（（ELISA只需需要要1~2小時(shí)時(shí)））。。補(bǔ)體體參參與與的的反反應(yīng)應(yīng)(補(bǔ)體體結(jié)結(jié)合合試試驗(yàn)驗(yàn)、、免免疫疫粘粘附附血血凝凝試試驗(yàn)驗(yàn)等等)。中和和試試驗(yàn)驗(yàn)(病毒毒中中和和試試驗(yàn)驗(yàn)和和毒毒素素中中和和試試驗(yàn)驗(yàn))特點(diǎn)點(diǎn)：：時(shí)間間長(zhǎng)長(zhǎng)，，約約需需要要18小時(shí)時(shí)才才能能獲獲得得結(jié)結(jié)果果。。免疫疫轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)印印技技術(shù)術(shù)。正向向間間接接血血凝凝診診斷斷技技術(shù)術(shù)特點(diǎn)點(diǎn)：：正向向間間接接血血凝凝為為一一種種微微量量的的定定量量反反應(yīng)應(yīng)試試驗(yàn)驗(yàn)，，其其應(yīng)應(yīng)用用廣廣泛泛，，其其無(wú)無(wú)需需昂昂貴貴的的設(shè)設(shè)備備，，操操作作簡(jiǎn)簡(jiǎn)單單，，并并且且有有快快速速、、敏敏感感、、特特異異性性。。操作作要要點(diǎn)點(diǎn)及及注注意意事事項(xiàng)項(xiàng)：：A.試驗(yàn)驗(yàn)準(zhǔn)準(zhǔn)備備：：采集集3只以以上上未未免免疫疫雞雞全全血血混混合合制制紅紅細(xì)細(xì)胞胞懸懸液液；；選用用孔孔底底應(yīng)應(yīng)光光潔潔透透明明無(wú)無(wú)可可見(jiàn)見(jiàn)沉沉淀淀附附著著物物的的反反應(yīng)應(yīng)板板(一次次性性的的最最好好)；待檢檢血血清清要要新新鮮鮮，，未未腐腐敗敗、、溶溶血血，，無(wú)無(wú)懸懸浮浮物物。。B.操作作過(guò)過(guò)程程：：盡可可能能的的保保證證樣樣品品被被全全部部加加入入反反應(yīng)應(yīng)孔孔；；每每次次滴滴加加抗抗原原前前應(yīng)應(yīng)充充分分搖搖勻勻，，從從稀稀釋釋度度高高的的孔孔開(kāi)開(kāi)始始加加起起，，并并避避免免滴滴頭頭和和孔孔內(nèi)內(nèi)的的液液體體直直接接接接觸觸；；避避免免稀稀釋釋時(shí)時(shí)孔孔內(nèi)內(nèi)產(chǎn)產(chǎn)生生氣氣泡泡，，直直接接影影響響結(jié)結(jié)果果判判定定。。C.結(jié)果果判判定定：：正確確識(shí)識(shí)別別“++”的凝凝集集現(xiàn)現(xiàn)象象。。待檢樣品2待檢樣品1陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照正向向間間接接血血凝凝反反應(yīng)應(yīng)原原理理圖圖間接接血血凝凝抑抑制制反反應(yīng)應(yīng)原原理理示示意意圖圖紅細(xì)胞間接血凝反應(yīng)原理示意圖抗體致敏紅細(xì)胞聯(lián)免免疫疫吸吸附附試試驗(yàn)驗(yàn)（（ELISA）具有有靈敏敏度度高高、、特特異異性性強(qiáng)強(qiáng)、、快快速速、、簡(jiǎn)簡(jiǎn)便便、、重重復(fù)復(fù)性性好好、、安安全全、、適適合合大大批批量量標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)化化檢檢測(cè)測(cè)的特特點(diǎn)點(diǎn)。。是當(dāng)當(dāng)前前應(yīng)應(yīng)用用最最廣廣、、發(fā)發(fā)展展最最快快的的一一項(xiàng)項(xiàng)新新技技術(shù)術(shù)，，目目前前該該方方法法已已被被廣廣泛泛用用于于多多種種細(xì)細(xì)菌菌和和病病毒毒等等疾疾病病的的診診斷斷。。其基本本過(guò)程程是將將抗原原(或抗體體)吸附于于固相相載體體，在在載體體上進(jìn)進(jìn)行免免疫酶酶反應(yīng)應(yīng)，底底物顯顯色后后用分分光光光度計(jì)計(jì)或酶酶標(biāo)儀儀判定定結(jié)果果。其可分分為以以下幾幾種方方法：：原理及及分類常用的的直接接法ELISA（測(cè)抗抗體））分子生生物學(xué)學(xué)檢測(cè)測(cè)技術(shù)術(shù)用于動(dòng)動(dòng)物疫疫病特特異性性快速速診斷斷和病病原基基因變變異與與進(jìn)化化分析析，及及時(shí)準(zhǔn)準(zhǔn)確掌掌握動(dòng)動(dòng)物疫疫病分分子流流行病病學(xué)動(dòng)動(dòng)態(tài)，，為疫疫病防防治提提供基基因理理論分分析依依據(jù)。。核酸探探針技技術(shù)、、基因因序列列分析析比如基基因芯芯片試試劑盒盒。聚合酶酶鏈反反應(yīng)（（PCR）（應(yīng)用最最廣））疫病的的早期期診斷斷和不不完整整病原原的檢檢測(cè)快速、、準(zhǔn)確確、安安全的的檢測(cè)測(cè)病原原體在病原原體分分類和和鑒別別中的的應(yīng)用用PCR儀基因芯片儀聚合酶酶鏈?zhǔn)绞椒磻?yīng)應(yīng)（PCR)是以DNA變性、、復(fù)制制的某某些特特性為為原理理設(shè)計(jì)計(jì)的。。通過(guò)過(guò)PCR技術(shù)獲獲取病病原微微生物物的特特異DNA片段，，從而而為疾疾病診診斷提提供重重要依依據(jù)。。特點(diǎn)：：快速速；敏感；；步驟較較多。。PCR反應(yīng)原理圖反轉(zhuǎn)錄錄PCR技術(shù)即RT-PCR技術(shù)。。用于于檢測(cè)測(cè)RNA病毒。。首先提提取總總RNA，然后后加入入引物物在反反轉(zhuǎn)錄錄酶的的作用用下合合成cDNA，加熱熱變性性成為為單鏈鏈cDNA后，加加入與與之互互補(bǔ)的的另一一引物物，進(jìn)進(jìn)行PCR反應(yīng)。。分為一一步法法和兩兩步法法兩種種RTRT-PCR反應(yīng)原理圖多重PCR技術(shù)(Multi-PCR）它是一一種特特殊的的PCR形形式，，其最最突出出的特特點(diǎn)是是一次次PCR反反應(yīng)．．在同同一反反應(yīng)體體系中中同時(shí)時(shí)加入入多對(duì)對(duì)不同同PCR引引物和和相應(yīng)應(yīng)的模模板，，可同同時(shí)檢檢測(cè)、、鑒別別出多多種病病原體體，在臨床床混合合感染染的鑒鑒別診診斷上上具有有其獨(dú)獨(dú)特優(yōu)優(yōu)勢(shì)和和很高高的實(shí)實(shí)用價(jià)價(jià)值。病原學(xué)學(xué)檢測(cè)測(cè)技術(shù)術(shù)1.細(xì)菌的的分離離與鑒鑒定2.病毒的的分離離與鑒鑒定是病毒毒性疫疫病檢檢測(cè)、、診斷斷、流流行病病學(xué)調(diào)調(diào)查和和未知知新病病毒進(jìn)進(jìn)行分分類鑒鑒定的的重要要方法法之一一。如如，此此法稱稱為檢檢測(cè)口口蹄疫疫的黃黃金標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)。。但是是對(duì)實(shí)實(shí)驗(yàn)室室能力力要求求較高高，且且耗時(shí)時(shí)長(zhǎng)。。3.寄生蟲(chóng)蟲(chóng)檢測(cè)測(cè)寄生蟲(chóng)蟲(chóng)病診診斷中中其定定性的的實(shí)質(zhì)質(zhì)性方方法有有以下下幾種種:蟲(chóng)卵檢檢查法法、蟲(chóng)蟲(chóng)體檢檢查法法、免免疫學(xué)學(xué)檢查查法和和分子子生物物學(xué)檢檢查法法。診斷新新技術(shù)術(shù)及應(yīng)應(yīng)用我國(guó)免免疫預(yù)預(yù)防為為主的的動(dòng)物物防疫疫政策策，決決定了了在現(xiàn)現(xiàn)實(shí)的的動(dòng)物物疫病病監(jiān)測(cè)測(cè)工作作中，，迫切切需要要實(shí)用用的對(duì)對(duì)動(dòng)物物疫病病病原原的快速診診斷技技術(shù)以及能能區(qū)分免疫動(dòng)動(dòng)物和自然然感染動(dòng)物物的鑒別診診斷技術(shù)。目前國(guó)內(nèi)符符合上述要要求的診斷斷新技術(shù)主主要有以下下3種:1.免疫膠體金金快速診斷斷試紙條2.熒光PCR3.鑒別診斷技技術(shù)4.原位PCR技術(shù)免疫膠體金金快速診斷斷試紙條特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)易，，速度快快快，10分鐘內(nèi)出結(jié)結(jié)果，方便便基層開(kāi)展展工作目前已經(jīng)有有了口蹄疫疫、豬瘟、、禽流感、、血吸蟲(chóng)等等病的膠體體金快速診診斷試紙條條。技術(shù)原理：：試紙條的正面和側(cè)面免疫層析快速檢測(cè)試紙結(jié)結(jié)構(gòu)及原理實(shí)時(shí)熒光定定量PCR與普通PCR相比：1.自動(dòng)化程度度高，極短短的檢測(cè)時(shí)時(shí)間（沒(méi)有了制制膠和PCR產(chǎn)物電泳步步驟，快速速熱循環(huán)儀儀也縮減了了運(yùn)行時(shí)間間，在30分鐘內(nèi)可以以得到完美美的實(shí)驗(yàn)結(jié)結(jié)果）；；2.敏感性為普普通PCR的100倍；3.直觀的軟件件分析；4.有效解決PCR污染問(wèn)題；；5.安全性更好好。6.不足：資金投入大大，檢測(cè)成本高高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)軟件分析截圖實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀鑒別診斷技技術(shù)鑒別診斷技技術(shù)的重要要性：A：區(qū)分自然然感染抗體體和疫苗免免疫抗體的的鑒別診斷斷技術(shù)；B：從普遍免免疫的動(dòng)物物群體中甄甄別出自然然感染和帶帶毒的動(dòng)物物。該項(xiàng)技術(shù)的的核心是基基因工程技技術(shù)、單克隆抗體體技術(shù)與診斷技術(shù)術(shù)的綜合運(yùn)運(yùn)用，其科科技水平高高，研究的的難度葉較較大。單克隆抗體體技術(shù)目前市場(chǎng)上上已有部分分利用單克克隆抗體制制備的金標(biāo)標(biāo)快速檢測(cè)測(cè)卡和ELISA試劑盒（（比如豬瘟瘟）。原位PCR——分子病理學(xué)學(xué)新技術(shù)是一種將PCR技術(shù)與原位位雜交技術(shù)術(shù)結(jié)合起來(lái)來(lái)的可以檢檢測(cè)組織細(xì)細(xì)胞中微量量DNA或RNA且可精確定定位的新技技術(shù)。特點(diǎn)：敏感度更高高，優(yōu)于免免疫組化技技術(shù)。目前應(yīng)用情情況：主要