分子生物學緒論2

分子生物學

——生命科學領域的革命DNA的結構與功能RNA在蛋白質合成中的功能蛋白質的結構與功能、遺傳密碼的破譯基因表達調控的本質被闡明人類開始了從生物學的必然王國向自由王國的大進軍。分子水平的生物學研究，正越來越多地影響傳統(tǒng)生物科學的各個領域分子生物學的3條基本原理構成生物體各類有機大分子的單體在不同生物中都是相同的生物體內一切有機大分子的建成都遵循共同的規(guī)則某一特定生物體所擁有的核酸及蛋白質分子決定了它的屬性分子生物學簡史理論上的三大發(fā)現(xiàn)

生物的遺傳物質是DNADNA雙螺旋模型遺傳信息的傳遞方式技術上的三大發(fā)現(xiàn)

基因操作的工具酶的發(fā)現(xiàn)載體的應用逆轉錄酶的發(fā)現(xiàn)1.理論上的三大發(fā)現(xiàn)

1.1生物的遺傳物質是DNA

Griffith，1928：肺炎雙球菌轉化實驗Avery，1943：體外轉化實驗Hershey，1952：噬菌體轉導實驗英國科學家格里菲思1879—19411928年，細菌學家Griffith肺炎雙球菌轉化實驗無毒的R型菌與被殺死的有毒的S型菌混合后轉化為有毒的S型活菌.

說明S菌體內有一種"轉化因子"OswaldTheodoreAvery（1877～1955）加拿大生物化學家艾弗里細菌轉化實驗1944年，Avery死去的S型菌并未復活，而是S型菌的DNA進入了R型菌，使其轉化為新的S型致病肺炎雙球菌。肺炎雙球菌的轉化實驗

注射R型活菌小鼠不發(fā)?。ù婊睿?/p>

注射S型滅活菌小鼠不發(fā)病（存活）注射S型活菌小鼠發(fā)病死亡注射R型活菌+S型死菌

小鼠發(fā)病死亡心血分離到S型活菌

⑴

動物試驗熱致死S型菌

培養(yǎng)皿培養(yǎng)

無菌落生長

R型活菌

培養(yǎng)皿培養(yǎng)培養(yǎng)出R型菌落

熱致死S型菌+R型活菌

培養(yǎng)皿培養(yǎng)培養(yǎng)出大量R型和S型菌落R型活菌+S菌抽取提物

培養(yǎng)皿培養(yǎng)培養(yǎng)出大量R型和S型菌落⑵

細菌培養(yǎng)試驗

AlfredDayHershey（1908～1997）美國微微生物物學家家赫爾爾希噬菌體體轉染染實驗驗第一步步：把把宿主主細菌菌培養(yǎng)養(yǎng)在含含有35S（或32P）培養(yǎng)養(yǎng)基中中，然然后用用T2噬菌體體去感感染，，結果果獲得得的子子代噬噬菌體體被標標上35S或32P。第二步步：標標記了了的噬噬菌體體去感感染未未標記記的細細菌。。1952年年，美美國Hershey噬菌體體轉染染實驗驗第三步步：強強烈攪攪拌洗滌，以便便使吸吸附在在菌體體外表表的T2噬菌體體蛋白白質外外殼脫脫離細細胞并并均勻勻分布布，再再進行行離心心沉淀淀，分分別測測定沉沉淀物物和上上清液液中的的同位位素標標記。。結果：：幾乎全全部35S都在上上清液液中，，而幾幾乎全全部32P和細菌菌一起起出現(xiàn)現(xiàn)在沉沉淀物物中1952年年，美美國Hershey

1.2DNA雙螺螺旋模模型1953Watson/Crick提提出了了DNA雙雙螺旋旋結構構模型型；意義：對生生命科科學的的發(fā)展展作用用可與與達爾爾文學學說媲媲美，，與孟孟德爾爾定律律齊名名。從從而使使遺傳傳學的的研究究全面面進入入分子子遺傳傳學階階段．．DNA的模模型的的研究究鮑林研研究小小組威爾金金斯、、富蘭蘭克林林研究究小組組沃生、、克里里克研研究小小組鮑林(Pauling)研究小小組主要工工作：：鮑林等等1951年(提出出蛋白白質α-螺旋旋模型型后)開始始研究究DNA分分子結結構。。根據(jù)阿阿斯伯伯利Astbury等1938年年獲得得的DNA分子子晶體體X射射線衍衍射圖圖像(顯示示DNA分分子晶晶體呈呈螺旋旋結構構)進進行研研究。。提出DNA分子子三鏈鏈螺旋旋結構構模型型：引引入多鏈、、螺旋旋和氫氫鏈等概念念。評價：：雖然然他們們提出出的模模型并并不正正確，，但是是其研研究方方向和和所采采用的的方法法卻為為DNA分分子結結構模模型研研究確確立了了方向向。注：1954年年鮑林林因研研究物物質聚聚合力力而獲獲得諾諾貝爾爾化學學獎。。威爾金金斯、、富蘭蘭克林林研究究小組組主要工工作成成就：：Wilkins和Franklin改改進了了DNA分分子晶晶體X射線線衍射射圖譜譜技術術；于1951年獲獲得了了更為為清晰晰的圖圖像；；結果表表明：：堿基基位于于螺旋旋內側側而磷磷酸基基團在在外側側，同同時測測得了了DNA螺螺旋的的直徑徑和螺螺距。。富蘭克克林拍拍攝的的DNA晶晶體的的X射射線衍衍射照照片，，這張張照片片正是是發(fā)現(xiàn)現(xiàn)DNA結結構的的關鍵鍵沃生、、克里里克研研究小小組Waston、、Crick(1951-1953)：研研究手手段非非常簡簡單：：用紙紙板等等做磷磷酸、、核糖糖和堿堿基模模型，，拼湊湊DNA分分子的的三維維結構構。理論知知識深深厚、、富于于創(chuàng)造造性；；視野野廣闊闊、收收集信信息全全面并并善于于分析析利用用?；谝岩延械牡难芯烤砍晒?，Waston和和Crick于于1953年提提出了了他們們的第第三個個DNA雙雙螺旋旋結構構模型型。（（被公公認為為分子遺傳學學建立的標標志）隨后證明了了DNA半半保留復復制的機理理，解決了了基因的自自我復制和和傳遞的問問題Waston，Crick和和Wilkins于于1962年獲得了了諾貝爾生生理學及醫(yī)醫(yī)學獎。DNA雙螺螺旋結構模模型的意義義DNA雙螺螺旋模型結結構同時表表明了DNA復制的的明顯方式式——堿基基互補配對對原則上的的半保留復復制。提示了基因因和多肽成成線性對應應的一個可可能理由：：DNA核核苷酸順序序規(guī)定該基基因編碼蛋蛋白質的氨氨基酸順序序；DNA中的遺傳信息就就是堿基序序列；并存在某某種遺傳密密碼，將核核苷酸序列列譯成蛋白白質氨基酸酸順序。在其后的幾幾十年中，，科學家們們沿著這兩兩條途徑前前進，探明明了DNA復制、遺遺傳信息表表達與中心心法則等內內容。1.3確確定了遺傳傳信息的傳傳遞方式1961年年Monod和Jacob提出了了操縱子學學說；1964年年Nirenberg等等提出了了“三聯(lián)體體密碼說””；Crick提出了了遺傳信息息流向和表表達的中心法則這三大發(fā)現(xiàn)現(xiàn)大大促進進了生命科科學的迅速速發(fā)展，為為基因工程程的誕生奠奠定了重要要的理論基基礎．GeneExpression中心法則(centraldogma)闡述述了生物世世代、個體體以及從遺遺傳物質到到性狀的遺遺傳信息流流向，即遺遺傳信息在在遺傳物質質復制、性性狀表現(xiàn)過過程中的信息流向最初由Crick提提出，并經(jīng)經(jīng)過了多次次修正2.技術上的三三大發(fā)現(xiàn)2.1基基因操作的的工具酶的的發(fā)現(xiàn)限制性核酸酸內切酶的的發(fā)現(xiàn)與DNA的切切割DNA連接接酶的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)與DNA片段的連連接GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ限制性核酸酸內切酶限制性核酸酸內切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序序列,并并在識別位位點或其周周圍切割雙雙鏈DNA的一類內內切酶。分類Ⅰ、Ⅱ、ⅢⅢ（基因工程程技術中常常用Ⅱ型））作用與甲基化酶酶共同構成成細菌的限限制修飾系系統(tǒng)，限制制外源DNA，保保護自身DNA。第一個字母母取自產(chǎn)生生該酶的細細菌屬名，，用大寫；；第二、第三三個字母是是該細菌的的種名，用用小寫；第四個字母母代表株；；用羅馬數(shù)字字表示發(fā)現(xiàn)現(xiàn)的先后次次序。限制酶命名名HindⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿桿菌d株的第三種種酶Ⅱ類酶識別別序列特點點——回文結構(palindrome)切口：平端切口粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口當一個DNA分子含含有6個拷拷貝的GAATTC:它將被酶切切成7個片片段，可用用凝膠電泳泳方法將其其分離。(Thelargestfragment)(Thesmallestfragment)采用幾種限限制性內切切酶組合可可以使DNA分子產(chǎn)產(chǎn)生特定的的片段.e.g.EcoRI+HindIIIDNA連接接酶(DNAligase)1967年在三個實實驗室同時時發(fā)現(xiàn)的。?；钚裕悍忾]DNA鏈上缺口，，借助ATP或NAD水解提供的的能量催化化DNA鏈的5’-PO4與另一DNA鏈的3’-OH生成磷酸二二酯鍵。要求：這兩條鏈鏈必須是與與同一條互互補鏈配對對結合的(T4DNA連接酶除外外)，而且必須須是兩條緊緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化化成磷酸二二酯鍵。DNA連接接酶的作用用機制細菌的DNA連接酶酶以NAD為能源，，動物細胞胞和噬菌體體的連接酶酶以ATP為能源。。T4的DNA連接接酶可以連連接平末端端。重組DNA技術中常常用的工具具酶工具酶功能限制性核酸內切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶在3′羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基2.2基基因運載工工具—DNA載體的的使用染色體外的的遺傳因子子細菌的性因因子—F因子Lederberg1946抗藥性因子子（R））大腸桿桿菌素因子子（COE）質粒粒Cohen1973基因載體為攜帶目的的基因，實實現(xiàn)其無性性繁殖或表表達有意義義的蛋白質質所采用的的一些DNA分子。。常用載體質粒DNA噬菌體DNA病毒DNA克隆載體(cloningvector)為使插入的的外源DNA序列被被擴增而特特意設計的的載體稱為為克隆載體。表達載體(expressionvector)為使插入的的外源DNA序列可可轉錄翻譯譯成多肽鏈鏈而特意設設計的載體體稱為表達載體。6×Hisλ噬菌體DNA改造造系統(tǒng)λgt系列列（插入型型，適用cDNA克克?。〦MBL系系列（置換換型，適用用基因組克克?。┦删w(phage)M13噬菌菌體DNA改造系統(tǒng)統(tǒng)（含lacZ基因））M13mp系列pUC系列列粘性質粒(cosmid)酵母人工染染色體(yeastartificialchromosome,YAC)細菌人工染染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造造的載體（如腺病毒毒，腺病毒毒相關病毒毒，逆轉錄錄病毒）其他載體2.3逆逆轉錄酶的的發(fā)現(xiàn)逆轉錄病毒毒最早于1911年年由Rous從雞肉肉瘤組織中中分離。1970年年Baltimore和Temin發(fā)發(fā)現(xiàn)逆轉錄錄病毒顆粒粒中帶有逆逆轉錄酶，，復制是通通過DNA中間階段段，病毒DNA可整整合于宿主主細胞。這這一發(fā)現(xiàn)改改變了傳統(tǒng)統(tǒng)的分子生生物學關于于DNARNA蛋白質的概概念,因而而獲得NobelPrize。分子生物學學的研究內內容DNA重組組技術基因表達調調控研究生物大分子子的結構功功能研究———結構分分子生物學學基因組、功功能基因組組與生物信信息學研究究DNA重組組技術（又又稱基因工工程）將不同的DNA片段段按照人們們的設計定定向連接起起來，在特特定細胞中中復制、表表達，產(chǎn)生生影響受體體細胞的新新的遺傳性性狀DNA重組組技術是核核酸化學、、蛋白質化化學、酶工工程及微生生物學、遺遺傳學、細細胞學長期期深入研究究的結晶，，限制性內內切酶、DNA連接接酶及其它它工具酶發(fā)發(fā)現(xiàn)與應用用則是這一一技術得以以建立的關關鍵。Cohen等首次進進行的DNA體外重重組PSC101R6-3：：質粒Ner：抗抗新霉霉素基因Sr：抗抗黃胺胺基因Tcr：抗抗四環(huán)環(huán)素基因SrSr

NerTcrPsc101R6-3ECORIECORI轉化E.coli連接酶細菌基因工工程重組DNA技術操作作的主要步步驟載體質粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉化體外包裝，轉染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交重組DNA技術操作作過程可形形象歸納為為分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉轉入受體菌篩篩選重組體基因工程是是創(chuàng)造奇跡跡的科學，，有著驚人人的發(fā)展?jié)摑摿蜆O其其廣闊的應應用前景“我們建議議像縫紉一一樣，把基基因連接到到工業(yè)微生生物中，促促使它們生生產(chǎn)大量的的生命所需需的蛋白質質……這是是生物和醫(yī)醫(yī)學的真正正大革命。。我們Cetus人人員預言，，到2000年，事事實上，所所有人類主主要疾病都都將由雜種種微生物生生產(chǎn)的對疾疾病特異的的人工蛋白白質處理而而得到治療療。”重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進凝血顆粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子剌激白細胞生成促紅細胞生成素剌激白細胞生成生長因子(bFGF,EGF)刺激細胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些腫瘤白細胞介素激活、剌激各類白細胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結合特異性進行診斷試驗、腫瘤導向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預防霍亂DNA重組組技術有著著廣闊的應應用前景可被用于大大量生產(chǎn)某某些在正常常細胞代謝謝中產(chǎn)量很很低的多肽肽，如激素素、抗生素素、酶類及及抗體等，，提高產(chǎn)量量、降低成成本，使許許多有價值值的多肽類類物質得到到廣泛應用用?？捎糜诙ㄏ蛳蚋脑炷承┬┥锏幕蚪M結構構，使它們們所具備的的特殊經(jīng)濟濟價值或功功能得以成成百上千地地提高。如如分解石油油的工程菌菌，產(chǎn)生蜘蜘蛛絲的細細菌等。還可用于基基礎研究。。無論是對對啟動子的的研究，還還是對轉錄錄因子的克克隆與分析析，都離不不開重組DNA技術術。基因表達調調控研究基因表達實實質上就是是遺傳信息息的轉錄和和翻譯。在在個體生長長發(fā)育過程程中生物遺遺傳信息的的表達按一一定的時序序發(fā)生變化化，并隨著著內外環(huán)境境的變化而而不斷加以以修正?；虮磉_的的調控主要要發(fā)生在轉轉錄水平或或翻譯水平平上。主要研究方方向信號轉導研研究轉錄因子研研究RNA剪接接研究等。。生物大分子子的結構功功能研究————結構分子子生物學一個生物大大分子在發(fā)發(fā)揮生物學學功能時，，必須具備備兩個前提提，即一是是具有特定定的空間結結構，二是是在發(fā)揮生生物學功能能的過程中中必定存在在著結構和和構象的變變化。結構分子生生物學：研研究生物大大分子特定定的空間結結構及結構構的運動變變化與其生生物學功能能關系的科科學。主要研究方方向：結構的測定定結構運動變變化規(guī)律的的探索結構與功能能相互關系系的建立。?；蚪M、功功能基因組組與生物信信息學研究究測定基因組組序列只是是了解基因因的第一步步，基因組組計劃并不不能直接闡闡明基因的的功能，更