醫(yī)療機構醫(yī)院巴貝蟲檢測 血涂片鏡檢法

醫(yī)療機構醫(yī)院巴貝蟲檢測血涂片鏡檢法

1范圍

本標準規(guī)定了巴貝蟲血涂片的制作、固定、染色和顯微鏡檢測

本標準適用于各級疾病預防控制機構和醫(yī)療機構對巴貝蟲的顯微鏡檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法（eqvISO3696:1987）

WSXXX-2015巴貝蟲診斷

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件

3.1巴貝蟲Babeisiaspp

巴貝蟲是一類寄生在人和動物紅細胞內的原蟲，是巴貝蟲病（Babeisiosis）的病原體。感染人的巴貝蟲有田鼠巴貝蟲（Babesiamicroti）、分歧巴貝蟲（B.divergens）、鄧肯巴貝蟲（B.duncani）和獵戶巴貝蟲（B.venatorum）等。

3.2血涂片bloodfilms

將血液涂制于載玻片上制成的涂片。供顯微鏡檢查巴貝蟲的血涂片包括厚血膜涂片和薄血膜涂片兩種。

4儀器和器材

4.1光學顯微鏡（100×油浸物鏡、10×目鏡）

4.2載玻片（無劃痕無油污的潔凈載玻片）

4.3推片

4.4血涂片染色架

4.5血涂片干燥架

4.6玻片盒

4.7染色盤和染色缸

5試劑和材料

所有化學試劑均為分析純。實驗用水應符合GB/T6682中一級水的規(guī)格。

5.1吉氏染色原液（Giemsa）（參加附錄B）

5.2pH7.2-pH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）（參加附錄B）

5.3甲醇

5.4香柏油或專用浸油（折射率≥1.5）

5.5二甲苯

5.670%酒精

5.7一次性采血針

5.8一次性手套

5.9一次性吸管

6檢測步驟

6.1血液涂片的制作

6.1.1采血部位及取血方法

末梢（無名指指尖或耳垂）取血。用70%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指緊捏耳垂上方或無名指指尖，右手持一次性采血針迅速刺入皮膚，不宜過深或過淺。然后用右手中指輕輕擠壓出血。嬰兒可從拇趾或足跟扎刺取血。

6.1.2厚血膜制作

取1張載玻片，用1張已消毒推片的一角，取4μL-5μL血量，使血滴與平置的載玻片中央偏右的位置接觸，由里向外一個方向旋轉，轉2圈-4圈，涂成直徑0.8cm-1cm大小圓形厚血膜。厚度以1個油鏡視野內可見到5個-10個白細胞為宜。

6.1.3薄血膜制作

用干棉球抹凈推片左下角上的血漬，用推片同一端中部刮取1μL-2μL血量。將血置于第一張玻片離厚血膜約0.3cm遠的地方，將推片的邊緣緊貼載玻片，輕輕上下移動，使血液沿邊緣散開，當血液在載玻片與推片之間向兩側擴展至約2cm寬時，使2張玻片保持45°角，從右向左迅速推動推片向前推成舌狀薄血膜。每張載玻片上1個厚血膜和1個薄血膜（參見附錄D）。

6.1.4編號

血膜制好后水平放置，充分干燥后，用鉛筆在玻片一側毛玻璃上或在靠近薄血膜一端邊上編號。

6.2固定與溶血

6.2.1薄血膜固定

將薄血膜一端朝下呈45°角，用一次性吸管蘸取甲醇溶液，均勻輕抹于薄血膜表面，避免碰觸厚血膜。

6.2.2厚血膜溶血

在干燥的厚血膜上滴加蒸餾水數(shù)滴，完全覆蓋血膜，溶血數(shù)分鐘，待血膜呈淺灰色，傾去溶血液。厚血膜1天內染色無需溶血，超過1天或成批染色的應溶血。

6.3吉氏染色

6.3.1吉氏染液的配制（參見附錄B）

吉氏染液包括吉氏染液原液和吉氏染液工作液。吉氏染液原液由5g吉氏粉加250mL甘油充分研磨后加入250mL甲醇配制。吉氏染液原液在避光條件下可長期保存。常用的吉氏染液工作液包括2%和5%濃度兩種，分別由吉氏染液原液和pH7.2-pH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）按比例配制。吉氏染液工作液只能使用時新鮮配制。

6.3.2單張血涂片染色（參見附錄C）

單張血涂片吉氏染色常用于臨床巴貝蟲病患者的顯微鏡瘧原蟲檢測。采用2%吉氏染液的常規(guī)染色方法血涂片染色質量較好，可長期保存，但染色時間較長（≥30min）。采用10%吉氏染液的快速染色方法染色時間較短（約10min-15min），但血涂片不適合長期保存。

6.3.3成批血涂片染色（參見附錄C）

成批血涂片吉氏染色常用于人群流行病學調查中的顯微鏡巴貝蟲檢測，常采用2%吉氏染液進行批量血涂片染色。

6.4鏡檢

6.4.1顯微鏡檢查

在染色后的血膜上加1滴香柏油或專用浸油，用100×油浸物鏡、10×目鏡的光學顯微鏡檢查。染色質量較好的血膜，紅細胞呈淡紅色，嗜酸性粒細胞顆粒呈鮮紅色，嗜中性粒細胞核呈紫藍色，淋巴細胞胞漿呈藍色或淡藍色，巴貝蟲呈紅紫色，胞漿呈藍色或淡藍色。無瘧色素?？雌肪€順序為薄血膜從舌尖部分開始，厚血膜從上端或下端開始（參見附錄D）。

6.4.2結果判定

6.4.2.1巴貝蟲檢測陰性

檢查完整個厚血膜或最少檢查300個厚血膜油鏡視野未查見巴貝蟲判為陰性。

6.4.2.2巴貝蟲檢測陽性

血膜中查到巴貝蟲判定為陽性。感染人體的巴貝蟲滋養(yǎng)體在紅細胞中呈紅紫色、直徑約l-3nm的環(huán)狀體，并有藍色或淺藍色的細胞質。環(huán)狀體可為圓形、卵形、梨形或者變形蟲樣。有時還可見四聯(lián)體的裂殖子（又叫馬爾他十字）。巴貝蟲無瘧色素。詳見附錄A。

6.5瘧原蟲的計數(shù)

薄血膜的巴貝蟲染蟲率計數(shù)法：鏡檢薄血膜，計數(shù)每個視野中的染蟲紅細胞和紅細胞總數(shù)，計數(shù)1000個紅細胞以上。用下式算出巴貝蟲染蟲率。染蟲紅細胞÷紅細胞總數(shù)×100%＝巴貝蟲染蟲率。如果染蟲率很低時，紅細胞計數(shù)以男性按500萬個/μL血、女性按450萬個/μL血計算，用整張片子的染蟲紅細