酶工程電子教案酶分子修飾通過各種方法計劃使酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生

酶工程電子教學設(shè)計第四章酶分子修飾◆經(jīng)過各樣方法使酶分子的構(gòu)造發(fā)生某些改變，進而改變酶的某些特征和功能的技術(shù)過程稱為酶分子修飾?！艚?jīng)過酶分子修飾，能夠使酶分子構(gòu)造發(fā)生某些改變，就有可能提升酶的活力，加強酶的穩(wěn)固性，降低或除去酶的抗原性等?！艚?jīng)過酶分子修飾，研究和認識酶分子中主鏈、側(cè)鏈、構(gòu)成單位、金屬離子和各樣物理要素對酶分子空間構(gòu)象的影響，能夠進一步商討其構(gòu)造與功能之間的關(guān)系?！裘阜肿有揎椫饕饘匐x子置換修飾,大分子聯(lián)合修飾，側(cè)鏈基團修飾，肽鏈有限水解修飾，核苷酸鏈有限水解修飾，氨基酸置換修飾，核苷酸置換修飾和酶分子的物理修飾等。1.金屬離子置換修飾◆把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特征和功能發(fā)生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修飾?！粲行┟阜肿又泻薪饘匐x子，并且常常是酶活性中心的構(gòu)成部分，對酶催化功能的發(fā)揮有重要作用。α-淀粉酶中的鈣離子（Ca++）谷氨酸脫氫酶中的鋅離子(Zn++)過氧化氫酶分子中的鐵離子(Fe++)酰基氨基酸酶分子中的鋅離子（Zn++）超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離子(Cu++,Zn++)等。◆若從酶分子中除掉其所含的金屬離子，酶常常會喪失其催化活性。1◆若用另一種金屬離子進行置換，則可使酶體現(xiàn)出不一樣的特征。1.1金屬離子置換修飾的方法：◆金屬離子置換修飾只合用于那些在分子構(gòu)造中原來含有金屬離子的酶?！艚饘匐x子置換修飾的過程主要包含以下步驟：酶的分別純化：第一將欲進行修飾的酶經(jīng)過分別純化，除掉雜質(zhì)，獲取擁有必定純度的酶液。除掉原有的金屬離子：在經(jīng)過純化的酶液中加入必定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。加入置換離子：于去離子的酶液中加入必定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子聯(lián)合，除掉剩余的置換離子，就能夠獲取經(jīng)過金屬離子置換后的酶。用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價金屬離子。1.2金屬離子置換修飾的作用：◆經(jīng)過金屬離子置換修飾能夠達到以下目的：說明金屬離子對酶催化作用的影響：提升酶活力：加強酶的穩(wěn)固性：改變酶的動力學特征：2.大分子聯(lián)合修飾◆采納水溶性大分子與酶的側(cè)鏈基團共價聯(lián)合，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，進而改變酶的特征與功能的方法稱為大分子聯(lián)合修飾。2.1大分子聯(lián)合修飾的方法：◆其修飾的主要過程以下：2修飾劑的選擇：◆大分子聯(lián)合修飾采納的修飾劑是水溶性大分子。比如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等?！粼诒姸嗟拇蠓肿有揎梽┲?，相對分子質(zhì)量為1000～10000的PEG應(yīng)用最為寬泛。修飾劑的活化：作為修飾劑使用的水溶性大分子含有的基團常常不可以直接與酶分子的基團進行反響而聯(lián)合在一同。在使用以前一般需要經(jīng)過活化，活化基團才能在必定條件下能夠與酶分子的某側(cè)鏈基團進行反響。用于酶分子修飾的主要聚乙二醇衍生物有：①聚乙二醇均三嗪衍生物②聚乙二醇琥珀酰亞胺衍生物③聚乙二醇馬來酸酐衍生物④聚乙二醇胺類衍生物：修飾：將帶有活化基團的大分子修飾劑與經(jīng)過分別純化的酶液，以必定的比率混淆，在必定的溫度、pH值等條件下反響一段時間，使修飾劑的活化基團與酶分子的某側(cè)鏈基團以共價鍵聯(lián)合，對酶分子進行修飾。

比如，右旋糖酐先經(jīng)過高碘酸（HIO4）活化辦理，而后與酶分子的氨基共價聯(lián)合，如4-3所示。CH2CHCH2CHOOHIO4OOHOHOHOHOHOOHOOOHOOHOOCCOnHHn3(右旋糖酐)（活化右旋糖酐）E

NH2CH2CHOOOHHOHOOHHOOHOCCONnE（修飾酶）圖5-3右旋糖酐修飾酶分子的過程分別：酶經(jīng)過大分子聯(lián)合修飾后，不一樣酶分子的修飾成效常常有所差異,需要經(jīng)過凝膠層析等方法進行分別，將擁有不一樣修飾度的酶分子分開，從中獲取擁有較好修飾成效的修飾酶。2.2大分子聯(lián)合修飾的作用：經(jīng)過修飾提升酶活力:：經(jīng)過修飾能夠加強酶的穩(wěn)固性：經(jīng)過修飾降低或除去酶蛋白的抗原性：3.酶的側(cè)鏈基團修飾◆采納必定的方法（一般為化學法）使酶的側(cè)鏈基團發(fā)生改變，進而改變酶分子的特征和功能的修飾方法稱為側(cè)鏈基團修飾。◆酶有蛋白類酶和核酸類酶兩大類型。它們的側(cè)鏈基團不一樣，修飾方法也有所差異。1）蛋白類酶主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，酶蛋白的側(cè)鏈基團是指構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團。主要包含氨基、羧基、巰基、胍基、酚基、咪唑基、吲哚基等。這些基團能夠形成各樣副鍵，對酶蛋白空間構(gòu)造的形成和穩(wěn)固有重要作用。側(cè)鏈基團一旦改變將惹起酶蛋白4空間構(gòu)象的改變，進而改變酶的特征和功能。（2）核酸類酶主要由核糖核酸（RNA）構(gòu)成，酶RNA的側(cè)鏈基團是指構(gòu)成RNA的核苷酸殘基上的功能團。RNA分子上的側(cè)鏈基團主要包含磷酸基，核糖上的羥基，嘌呤、嘧啶堿基上的氨基和羥基（酮基）等?！裘傅膫?cè)鏈基團修飾方法主要有：氨基修飾，羧基修飾，巰基修飾，胍基修飾，酚基修飾，咪唑基修飾，吲哚基修飾，分子內(nèi)交聯(lián)修飾等。3.1氨基修飾◆采納某些化合物使酶分子側(cè)鏈上的氨基發(fā)生改變，進而改變酶蛋白的空間構(gòu)象的方法稱為氨基修飾?！舴材軌蚴姑阜肿觽?cè)鏈上的氨基發(fā)生改變的化合物，稱為氨基修飾劑。主要有：亞硝酸、2,4-二硝基氟苯(DNFB)、丹磺酰氯(DNS)、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、乙亞胺甲酯、O－甲基異脲、順丁烯二酸酐等。3.2羧基修飾◆采納各樣羧基修飾劑與酶蛋白側(cè)鏈的羧基進行酯化、酰基化等反響，使蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象發(fā)生改變的方法稱為羧基修飾。◆可與蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的羧基發(fā)生反響的化合物稱為羧基修飾劑。比如，碳化二亞胺、重氮基乙酸鹽、乙醇－鹽酸試劑、異惡唑鹽等。碳二亞胺能夠在比較平和的條件下與酶分子的羧基發(fā)生酯化反響：E-C-OH+R-N=C=N-R’＝E-C-O-C=N-R‖‖|OONH-R’(酶)（碳二亞胺）(酶-碳二亞胺衍生物)◆碳二亞胺是酶分子羧基修飾最廣泛采納的修飾劑。用此修飾法能夠定量測定酶分子中5羧基的數(shù)量。3.3巰基修飾◆采納巰基修飾劑與酶蛋白側(cè)鏈上的巰基聯(lián)合，使巰基發(fā)生改變，進而改變酶的空間構(gòu)象、特征和功能的修飾方法稱為巰基修飾?！舫Ｓ玫膸€基修飾劑有：?；瘎?、烷基化劑、馬來酰亞胺、二硫蘇糖醇、巰基乙醇、硫代硫酸鹽、硼氫化鈉。3.4胍基修飾◆采納二羰基化合物與胍基反響生成穩(wěn)固的雜環(huán)，進而改變酶分子的空間構(gòu)象的方法稱為胍基修飾?！粲米麟一揎梽┑亩驶衔镏饕卸《?、1,2-環(huán)己二酮、丙二醛、苯乙二醛等。它們能夠在中性或許弱堿性的條件下，與精氨酸殘基上的胍基反響，生成穩(wěn)固的雜環(huán)類化合物。3.5酚基修飾◆蛋白質(zhì)分子的酪氨酸殘基上含有酚基。經(jīng)過修飾劑的作用使酶分子上的酚基發(fā)生改變，進而改變酶蛋白的空間構(gòu)象和特征的修飾方法稱為酚基修飾。酚基的修飾包含酚羥基的修飾和苯環(huán)上的代替修飾?！舴踊揎椀姆椒ㄖ饕械饣?、硝化法、琥珀酰化法等。此中四硝基甲烷（TNM）可以高度專一地對酚羥基進行修飾。3.6咪唑基修飾◆經(jīng)過修飾劑與咪唑基反響，使酶分子中的組氨酸殘基發(fā)生改變，進而改變酶分子的構(gòu)象和特征的修飾方法成為咪唑基修飾?！舫Ｓ玫倪溥蚧揎梽┯校旱庖宜?，焦碳酸二乙酯等。63.7吲哚基修飾◆蛋白質(zhì)分子中的色氨酸含有吲哚基。經(jīng)過改變酶分子上的吲哚基而使酶分子的構(gòu)象和特征發(fā)生改變的修飾方法稱為吲哚基修飾。◆兩種修飾劑對吲哚基進行修飾:N-溴代琥珀酰亞胺（NBS）、2-羥基-5-硝基芐溴（HNBB）和4-硝基苯硫氯。3.8分子內(nèi)交聯(lián)修飾◆含有雙功能基團的化合物（又稱為雙功能試劑），如戊二醛、己二胺、葡聚糖二乙醛等，能夠在酶蛋白分子中相距較近的兩個側(cè)鏈基團之間形成共價交聯(lián)，進而提升酶的穩(wěn)固性的修飾方法稱為分子內(nèi)交聯(lián)修飾。◆雙功能基團化合物依據(jù)其功能基團的特色能夠分為同型雙功能基團化合物和異型雙功能基團化合物兩大類?！敉碗p功能基團化合物的兩頭擁有同樣的功能基團，比如，己二胺[H2N-(CH2)6－NH2]的兩頭都含有氨基，能夠與酶分子中的羧基反響形成酰胺鍵,；戊二醛[OHC-(CH2)3-CHO]的兩頭都含有醛基等，能夠與酶分子中的氨基反響形成酰胺鍵或許與羥基反響形成酯鍵?！舢愋碗p功能基團化合物的兩頭所含的功能基團不同樣。能夠與酶分子上不一樣的側(cè)鏈基團反響。如，一端與酶分子的氨基作用，另一端與酶分子的巰基或羧基作用等。4.肽鏈有限水解修飾◆在肽鏈的限制位點進行水解，使酶的空間構(gòu)造發(fā)生某些精美的改變，進而改變酶的特征和功能的方法，稱為肽鏈有限水修飾?！粲行┥矬w能夠經(jīng)過生物合成獲取不顯示酶催化活性的酶原,利用擁有高度專一性的蛋白酶對其進行肽鏈有限水解修飾,顯示出酶的催化活性或提升酶活力。7比如，胰蛋白酶原的活化,如圖5-2所示。圖5-2胰蛋白酶原的活化5.核苷酸鏈剪切修飾◆在核苷酸鏈的限制位點進行剪切，使酶的構(gòu)造發(fā)生改變，進而改變酶的特征和功能的方法，稱為核苷酸鏈剪切修飾。比如，四膜蟲rRNA前體經(jīng)過自我剪接作用形成成熟的rRNA。參看圖5-3。5’GAG3’G-IVS(414nt)(15nt)GA+（399nt）G(4nt)+(395nt)L-19IVS(395nt)圖5-3L-19IVS的形成6.氨基酸置換修飾◆將酶分子肽鏈上的某一個氨基酸換成另一個氨基酸的修飾方法，稱為氨基酸置換修8飾。6.1氨基酸置換修飾的作用：◆蛋白類酶酶分子經(jīng)過氨基酸置換修飾后，能夠提升酶活力、增添酶的穩(wěn)固性或改變酶的催化專一性。6.2氨基酸置換修飾的方法：化學修飾法：定點突變技術(shù)：◆定位突變技術(shù)用于酶分子修飾的主要過程以下：①新的酶分子構(gòu)造的設(shè)計②突變基因堿基序列確實定③突變基因的獲取④新酶的獲取7.核苷酸置換修飾◆將酶分子核苷酸鏈上的某一個核苷酸換成另一個核苷酸的修飾方法，稱為核苷酸置換修飾?！艉塑账嶂脫Q修飾往常采納定位突變技術(shù)進行。只需將核苷酸鏈中的一個幾個核苷酸置換，就能夠使核酸類酶的特征和功能發(fā)生改變?！鬖-19IVS活性中心由第22～27位的六個核苷酸殘基構(gòu)成，只需將此中的堿基置換一個，就能夠使其底物專一性發(fā)生改變（參看表5-2）。表5-2L-19IVS活性中心上堿基的改變?nèi)瞧鹌涞孜飳Ｒ恍缘淖兓疞-19IVS底物催化產(chǎn)物22～27位的核苷酸序列IⅡ95’-GGAGGG-3’GGCCUCUAAAAA(1)GGGCCUCU+GGCCUGUAAAAA(2)GGAAAAAGGCCGCUAAAAA(3)G無反響無反響(1)G無反響5’-GCAGGG-3’(2)GGGCCUGU+(3)GGAAAAA無反響(1)G無反響5’-GGCGGG-3’(2)G無反響(3)GGGCCGCU+GAAAAA8.酶分子的物理修飾◆經(jīng)過各樣物理方法使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些改變，進而改變酶的某些特征和功能的方法稱為酶分子的物理修飾?！裘阜肿游锢硇揎椀奶厣谟诓桓淖兠傅臉?gòu)成單位及其基團，酶分子中的共價鍵不發(fā)生改變。不過在物理要素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些改變?！裘阜肿拥目臻g構(gòu)象的改變還能夠在某些變性劑的作用