微生物發(fā)酵實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

PAGEPAGE24微生物發(fā)酵實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)目錄第一部分生產(chǎn)菌種的選育及發(fā)酵條件優(yōu)實(shí)驗(yàn)一 發(fā)酵菌株的初篩實(shí)驗(yàn)二 發(fā)酵菌株的復(fù)篩實(shí)驗(yàn)三 淀粉酶活力的測(cè)實(shí)驗(yàn)四 生產(chǎn)菌株發(fā)酵條件的優(yōu)第二部分生物反應(yīng)器的使用實(shí)驗(yàn)五 發(fā)酵罐的構(gòu)造實(shí)驗(yàn)六 發(fā)酵罐參數(shù)的設(shè)置及控實(shí)驗(yàn)七 發(fā)酵罐的操作方法第三部分補(bǔ)料分批發(fā)實(shí)驗(yàn)八 種子的制備實(shí)驗(yàn)九 發(fā)酵罐培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)十 菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)的繪制實(shí)驗(yàn)十一 發(fā)酵過(guò)程中還原糖的測(cè)定實(shí)驗(yàn)十二 發(fā)酵過(guò)程中乙醇產(chǎn)量的測(cè)第四部分傳統(tǒng)產(chǎn)品的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)十三 酸乳的發(fā)酵微生物發(fā)酵實(shí)驗(yàn)37該實(shí)驗(yàn)屬開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)內(nèi)容必須由學(xué)生自己完成。在同一時(shí)間內(nèi)，每個(gè)大因此學(xué)生要對(duì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行預(yù)習(xí)。順利完成。每個(gè)大組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)共享，但數(shù)據(jù)處理過(guò)程不共享，否則將影響最后成績(jī)。實(shí)驗(yàn)需要使用儀器較多，共用小型儀器放于固定位置，不得隨意搬動(dòng)。實(shí)驗(yàn)中要隨時(shí)保持實(shí)驗(yàn)室及實(shí)驗(yàn)臺(tái)面的清潔，以免發(fā)酵過(guò)程中污染。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，蒸餾水用量較大，各組要輪流負(fù)責(zé)打水。使用儀器必須按照教師指導(dǎo)進(jìn)行，以免發(fā)生危險(xiǎn)。第一部分生產(chǎn)菌種的選育及發(fā)酵條件優(yōu)實(shí)驗(yàn)一 發(fā)酵菌株的初篩一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選方法。二、實(shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)用品樣品淀粉含量豐富的土樣。培養(yǎng)基肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏0.135g，蛋白胨0.225g，加水至12120min。初篩平板培養(yǎng)基：牛肉膏0.9g3g，NaCl1.5g，可溶性淀粉0.6g0.54g300ml，pH7.4。12120min。Lugol1g2g300ml再將碘溶解于碘化鉀溶液中，待碘全溶后，加足水即可。器材高壓蒸汽滅菌鍋，超凈工作臺(tái)，天平，電爐；燒杯，量筒，三角瓶，玻璃珠，培養(yǎng)皿，移液管，試管。四、實(shí)驗(yàn)方法培養(yǎng)基制備：配制肉湯培養(yǎng)基45ml，裝于250ml300ml500ml三角瓶中，封口膜封口，滅菌。倒平板：將融化的初篩平板培養(yǎng)基冷卻至50～6020ml。冷卻凝固待用。5g45ml肉湯培養(yǎng)基中，8015min。平板涂布分離：以無(wú)菌操作法吸取預(yù)處理土樣懸液適0.1ml24～48h。48～72h后，4℃保存。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果菌落數(shù)量菌落顏色菌落形態(tài)平板118淡黃色，乳白色大小不一，圓形或橢圓形，周邊鋸齒形，無(wú)規(guī)則分布。平板215淡黃色圓形居多，周邊部分光滑部分呈鋸齒形，分布不均。平板319淡黃色菌落分布在中央，個(gè)別菌落很大，其余的很小。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

實(shí)驗(yàn)二 發(fā)酵菌株的復(fù)篩學(xué)習(xí)發(fā)酵菌種的復(fù)篩方法。從已分離到的微生物中找出具有工業(yè)應(yīng)用前景的菌株。二、實(shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)用品菌株實(shí)驗(yàn)一初篩得到的性能優(yōu)良的淀粉酶生產(chǎn)菌。復(fù)篩培養(yǎng)基1g1g，Na2HPO40.4g(NH4)2SO40.4gNH4Cl0.15g，加自來(lái)水至100ml，pH12130min。器材高壓滅菌鍋，超凈工作臺(tái)，天平，電爐；燒杯，量筒，三角瓶，移液管。四、實(shí)驗(yàn)方法100ml，分裝于250ml30ml，共3瓶，6層紗布封口，滅菌。1環(huán)斜面菌苔（1個(gè)單菌落），轉(zhuǎn)接于復(fù)篩培養(yǎng)基中（每株菌接3瓶），37℃，150r/min搖床培養(yǎng)36h。三次。五、思考題菌株的選育為什么要分初篩與復(fù)篩？答： 初篩，以量為主，可在培養(yǎng)皿或搖瓶中進(jìn)行，優(yōu)點(diǎn)是快速、直觀(guān)、簡(jiǎn)便、工作量小但測(cè)試條件與工業(yè)發(fā)酵時(shí)有很大差別，因此結(jié)果不一定可靠；復(fù)篩培養(yǎng)基中應(yīng)加入一些生產(chǎn)性原料，通過(guò)搖瓶培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行精確的定量分析測(cè)定，所得的數(shù)據(jù)比較有說(shuō)服力，但工作量較大。實(shí)驗(yàn)三 淀粉酶活力的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆辗止夤舛确y(cè)定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法從初篩所獲得的菌株中篩選出淀粉酶活力高的菌株二、實(shí)驗(yàn)原理淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷鍵的一類(lèi)酶，包括麥芽糖苷酶淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶（糖化酶）和淀粉葡萄糖苷酶（異淀粉酶淀粉酶可以從淀粉分子內(nèi)部切斷淀粉的6個(gè)葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖，使淀粉的粘度下降，因此又稱(chēng)為液化型淀粉酶。660nm處有較大的吸收峰，可以用分光光度計(jì)失，因此可以根據(jù)一定時(shí)間內(nèi)藍(lán)色消失的程度為指標(biāo)來(lái)測(cè)定淀粉酶的活力。三、實(shí)驗(yàn)用品粗酶液實(shí)驗(yàn)二的搖瓶發(fā)酵液離心后可作為粗酶液。試劑4.4g2.2貯于棕色瓶中；2ml20g500ml棕色瓶中；2%可溶性淀粉：稱(chēng)取可溶性淀粉（干燥至恒重徐徐傾入煮沸的蒸餾水中，邊加邊攪拌，煮沸2min后冷卻，加水定容至100ml，需當(dāng)天配制；pH6.0的磷酸二氫鈉－檸檬酸緩沖液：稱(chēng)取磷酸二氫鈉·12HO）4 24.523g，檸檬酸0.807g，用水溶解并定容至100ml；標(biāo)準(zhǔn)糊精溶液：稱(chēng)取純糊精0.06g，懸浮于少量水中，調(diào)勻后傾入90ml100ml。滴加幾滴甲苯防腐，冰箱保存；28.75ml3．器材分光光度計(jì)，恒溫水浴鍋，試管架，秒表；試管，移液管，燒杯，離心管。四、實(shí)驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：（1）將可溶性淀粉稀釋成0.2%，0.5%，1%，1.5%，2%的稀釋液；2.0ml15min；1ml，4030min0.5mol/L10ml；1ml10ml660nmA；以淀粉濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。3－1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作1256淀粉稀釋液濃度/%01256淀粉稀釋液濃度/%00.20.51.01.52.0淀粉稀釋液/ml222222緩沖液/ml11111140℃水浴中保溫5min蒸餾水/ml1111114030min0.5mol/L10ml1ml稀碘液/mlA6601010101010103 4酶液的制備將實(shí)驗(yàn)二所得發(fā)酵液離心4000r/mi，30mi，取上清液作為粗酶液，以pH6.0液稀釋至適當(dāng)濃度，作為待測(cè)酶液。按下列程序操作：試管A（空白） 試管B（酶試樣，需作三個(gè)平行試樣）↓ ↓加淀粉稀釋液2.00ml 加淀粉稀釋液2.00ml↓ ↓加緩沖液1.00ml（搖勻） 加緩沖液1.00ml（搖勻）↓40±0.2℃，5min ↓40±0.2℃，5min加蒸餾水1.00ml（搖勻） 加粗酶液1.00ml（搖勻）↓40±0.2℃，30min ↓40±0.2℃，30min加乙酸10.0ml 加乙酸10.0ml↓混勻 ↓混勻取反應(yīng)液1.00ml 取反應(yīng)液1.00ml↓ ↓加稀碘液10.00ml 加稀碘液10.00ml↓混勻 ↓混勻測(cè)定A680 測(cè)定A680五、注意事項(xiàng)淀粉一定要用少量冷水調(diào)勻，再倒入熱水中溶解，若直接加到熱水中，會(huì)溶解不均酶液應(yīng)該進(jìn)行適當(dāng)稀釋。六、作業(yè)1．繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。2 ．記錄各樣品的2 660七、思考題測(cè)定酶活力時(shí)，在具體操作上應(yīng)注意哪些問(wèn)題？為什么測(cè)定酶活力的試劑要在40℃水浴鍋中預(yù)熱？附：酶活力單位的定義：1ml酶液在40℃、pH6.0的條件下，每小時(shí)分解的淀粉的毫克數(shù)。表示為u/ml。X=A×K×n式中：X— 樣品的酶活力，u/mlA— 樣品平行試驗(yàn)的平均吸光度K— 吸光常數(shù)n— 稀釋倍數(shù)實(shí)驗(yàn)四 生產(chǎn)菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私獍l(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)物形成的影響，用單因子試驗(yàn)找出篩選菌株的最佳發(fā)酵條件。掌握發(fā)酵培養(yǎng)基的配制原則，熟悉用正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)物的形成有著非常重要的影響，其中培養(yǎng)基pHpHpH過(guò)程中pH來(lái)衡量，封口紗布的厚度也會(huì)影響氧氣的傳遞，一般以6～8的生長(zhǎng)，可考慮以流加的方法逐步加入碳氮源。行培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)菌株的培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化。三、實(shí)驗(yàn)用品1．菌種2．器材搖床，高壓滅菌鍋；三角瓶，燒杯，移液管，試管。四、實(shí)驗(yàn)方法每一因素設(shè)定34-1W/V另加入NaHPO40.8(NH42SO40.44Cl250ml30ml，65ml試管中，滅菌。55ml0.5ml36h結(jié)果測(cè)定：參照實(shí)驗(yàn)三方法測(cè)定菌株在各培養(yǎng)基中培養(yǎng)的淀粉酶活力。表4-1發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)表組 因素A 因素B 因素C 因素D 酶活力別 黃豆粉 玉米粉 淀粉 酵母膏 /(U/ml)113%11%13%10.4%213%22%25%20.6%313%33%37%30.8%425%11%25%30.8%525%22%37%10.4%625%33%13%20.6%737%11%37%20.6%837%22%13%30.8%937%33%25%10.4%五、作業(yè)并確定最適培養(yǎng)基配方。六、思考題如果不用正交實(shí)驗(yàn)，四因素三水平的實(shí)驗(yàn)共需做幾組？攪拌電機(jī)攪拌電機(jī)進(jìn)氣進(jìn)蒸氣進(jìn)水排水排汽2一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鈾C(jī)械攪拌發(fā)酵罐的一般構(gòu)造。二、實(shí)驗(yàn)用品上海高機(jī)微生物發(fā)酵罐BIOF-2007。三、實(shí)驗(yàn)方法罐體系統(tǒng)組成本實(shí)驗(yàn)所使用發(fā)酵罐罐體結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖5-1，罐體見(jiàn)圖5-2、5-3，各部件名稱(chēng)見(jiàn)表5-1。圖5-17L發(fā)酵罐罐體結(jié)構(gòu)表5-1發(fā)酵罐各部件名稱(chēng)一覽表1電加熱器12測(cè)溫電極（2）23恒溫水槽2測(cè)溫電極（1）13泡沫電極24液位電極3水位電極14pH電極4補(bǔ)料瓶15快速接頭AQ安全閥5呼吸過(guò)濾器16排氣冷凝器W1溢水閥6補(bǔ)料蠕動(dòng)泵17測(cè)溫電極（3）W2排水排汽閥7冷凝器進(jìn)水閥18尾氣過(guò)濾器S進(jìn)蒸汽閥8進(jìn)氣流量計(jì)19尾氣濾水器EW冷卻水電磁閥9滅菌罩20取樣放料裝置G氣路調(diào)節(jié)閥10進(jìn)氣過(guò)濾器21罐蓋P1P2壓力表11DO電極22回水管控制面板LCD控制面板LCD顯示器電腦控制系統(tǒng)電源開(kāi)關(guān)執(zhí)行器動(dòng)作指示燈酸泵自動(dòng)方式指示燈堿泵消泡泵)，你位機(jī)補(bǔ)液泵電源總開(kāi)關(guān)蠕動(dòng)泵手動(dòng)開(kāi)關(guān)圖5-2發(fā)酵罐罐體 圖5-3加滅菌罩的發(fā)酵罐罐體控制機(jī)箱和控制面板本實(shí)驗(yàn)所使用發(fā)酵罐控制機(jī)箱及控制面板如圖5－4所示。圖5-4發(fā)酵罐控制機(jī)箱實(shí)驗(yàn)六發(fā)酵罐參數(shù)的設(shè)置及控制一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私獬Ｓ冒l(fā)酵參數(shù)的檢測(cè)方法。學(xué)會(huì)常用發(fā)酵參數(shù)的設(shè)置及控制。二、實(shí)驗(yàn)用品上海高機(jī)微生物發(fā)酵罐BIOF-2007。三、實(shí)驗(yàn)方法1．主菜單BIOF-2000RUN/EDIT/CALIB/STERIL打開(kāi)電腦控制系統(tǒng)電源開(kāi)關(guān)，LCDBIOF-2000RUN/EDIT/CALIB/STERIL用左右箭頭鍵移動(dòng)光標(biāo)選擇命令。按ENTER鍵確定命令并立即執(zhí)行。RUN(運(yùn)行)命令：根據(jù)所設(shè)置的參數(shù)進(jìn)行控制運(yùn)行，如果要求控制系統(tǒng)真正完成控制作用，必須于此前將電源總開(kāi)關(guān)打開(kāi)。EDIT(設(shè)置)命令：用于設(shè)置各控制對(duì)象參數(shù)，設(shè)置完畢用ESC鍵退出。CALIB(CALIBRATION校正)命令：用于校正電極及蠕動(dòng)泵。STERIL(STERILIZATION滅菌)命令：是為滅菌過(guò)程而設(shè)置的輔助程序。2．RUN命令選擇RUN命令將進(jìn)行發(fā)酵運(yùn)行控制，控制的參數(shù)可以在EDIT中設(shè)置，運(yùn)行時(shí)有二種顯示界面。第一種界面:

RUNSTIRR:TEMP:PH:*** rpmRUNSTIRR:TEMP:PH:*** rpm*******℃AUTO+/-+/-RUN DO2: *** rpmATFOAM PUMPSUB/HARV AUTO+/-+/-第二種界面:

根據(jù)EDIT中設(shè)定顯示（）用ALTER鍵可以實(shí)現(xiàn)兩種界面的切換。每一個(gè)控制參數(shù)有AUTO、HAND、OFF狀態(tài)可選。運(yùn)行狀態(tài)時(shí)可以由HALT鍵進(jìn)入命令選擇菜單，由此可以直接進(jìn)入EDIT或CALIB。EDIT命令EDITEDITPH/DO/TEMP/STIRR/PUMPS/ST-DOSETMODE編輯各參數(shù)時(shí)用箭頭鍵+數(shù)字鍵實(shí)現(xiàn)數(shù)字部分的設(shè)定。當(dāng)光標(biāo)移到方式設(shè)置位置時(shí)（如EDITPH:****PHUPLIMIT:****PHDWLIMIT:****方式位置AUTO+/-+/-圖中箭頭所指部分，按ENTERAUT（行控制HAND（ENTERTEMP行“+”號(hào)上，再按ENTER就可以啟動(dòng)加熱器進(jìn)行加熱OFF（關(guān)閉，只顯示各參數(shù)運(yùn)行值，但不能對(duì)其進(jìn)行控制。各參數(shù)可設(shè)置相應(yīng)上下限值，EDITPH:****PHUPLIMIT:****PHDWLIMIT:****方式位置AUTO+/-+/-在EDIT界面中，選擇MODE便進(jìn)入補(bǔ)料方式設(shè)置，根據(jù)情況有六種補(bǔ)料方式可以選擇：pHpHDO值時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料；DO值時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料；方式5．PH>XX.X+DO>XX→+SUB，即：酸堿度或溶解氧大于某數(shù)值時(shí)補(bǔ)料；方式6．LEVELLOWER→+SUB，即：發(fā)酵液液位低時(shí)補(bǔ)料。注意，補(bǔ)料速率可以通過(guò)設(shè)置補(bǔ)料泵的占空百分比（可在CALIB/PUMP44，6，8，100）來(lái)確定。在確定了補(bǔ)料方式后，只需用ESC鍵退出即可。設(shè)置時(shí)系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)儲(chǔ)存設(shè)定參數(shù)，即便掉電也不會(huì)丟失數(shù)據(jù)。設(shè)置完畢后，用ESCRUN狀態(tài)直接進(jìn)入EDIT，退出時(shí)回到RUNMAINEDIT，退出時(shí)回到MAIN狀態(tài)。CALIB命令pH電極的校正PH:**.**TEMP:***℃SLOPE:*.**ZERO: PH:**.**TEMP:***℃SLOPE:*.**ZERO: CALIBAUTO+/-+/-校正時(shí)溫度補(bǔ)償是自動(dòng)的校正溫度應(yīng)選擇于發(fā)酵液工作溫度附近操作人員須將隨機(jī)提供的溫度電極和pH電極一同插入中性標(biāo)準(zhǔn)溶液，如 pH=6.86，通過(guò)面板調(diào)整零位ZERO(用箭頭鍵移動(dòng)光標(biāo)到ZERO行+/-上,按ENTER鍵即)，使屏幕上pH指示值接近6.8；再將pH計(jì)和溫度電極一起插入標(biāo)準(zhǔn)的酸性或堿性溶液（根據(jù)發(fā)酵液pH范圍選擇，如調(diào)整斜率SLOPE用箭頭鍵移動(dòng)光標(biāo)到SLOPE行+/-上按ENTER鍵即)，使pH指示接近4.0，再重復(fù)上述過(guò)程1～2次，使pH指示達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)溶液的pH值即可。校正完畢用ESC鍵退出。注：斜率SLOPE的變化范圍：0.39～1.89，零位ZERO的變化范圍122～143。實(shí)罐滅菌后及發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)對(duì)pH計(jì)檢測(cè)樣品的pH值，再進(jìn)入CALIB程序，調(diào)整零位ZERO，使液晶顯示器顯示的pHpH計(jì)顯示值相同。DO電極的校正進(jìn)入DO電極校正后，顯示界面如下圖所示。DO2:***%TEMP:***DO2:***%TEMP:***℃SLOPE:*.**ZERO:****CALIBAUTO+/-+/-放入亞硫酸鈉飽和溶液，調(diào)整零位ZERODO0%1%～2%將溶氧電極取出，以濕度飽和的空氣作為100%溶氧量來(lái)標(biāo)定，調(diào)整斜率SLOPE使DO100%1～2次即可。校正完畢用ESC鍵退出。注：SLOPE的調(diào)整范圍：0.5～2.0，ZERO的調(diào)整范圍：1～25。DOCALIBSLOPDO值達(dá)到9～100%。STERIL命令STERILIZATIONSTIRR：***RPMSTERILIZATIONSTIRR：***RPMSETMTEMP：** STEMP：***℃STERILTIME：**MIN OK各參數(shù)設(shè)置完畢后，移動(dòng)光標(biāo)至OK上，按ENTER鍵即進(jìn)入滅菌狀態(tài)。顯示界面：STERILSTERILSTIRR：***TEMP：***℃STOP***℃REMAIN TIME：***MIN滅菌時(shí)，當(dāng)罐內(nèi)溫度達(dá)到所設(shè)置的滅菌溫度STEMP操作人員注意（按鍵可消除鳴叫。滅菌計(jì)時(shí)到，蜂鳴器鳴叫提示滅菌結(jié)束。對(duì)于5~10L的在位滅菌玻璃罐，滅菌設(shè)置時(shí)應(yīng)將中間溫度MTEMP和攪拌速度STIRR設(shè)置為零。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

實(shí)驗(yàn)七發(fā)酵罐的操作方法學(xué)會(huì)發(fā)酵罐的使用方法。二、實(shí)驗(yàn)用品7L機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐，蒸汽發(fā)生器，空氣壓縮機(jī)。三、實(shí)驗(yàn)方法開(kāi)機(jī)：先開(kāi)電源總開(kāi)關(guān)，再打開(kāi)電腦控制系統(tǒng)電源開(kāi)關(guān)。滅菌準(zhǔn)備工作pHDO及攪拌電機(jī)、頂蓋接地線(xiàn)的連接插頭；取出測(cè)溫電極，放置在干燥的機(jī)箱上。注：拔下的連接插頭不可互相纏繞接觸，不可與罐體接觸，不可受潮，應(yīng)放在干燥的機(jī)箱上。機(jī)，橫放在柔軟、干燥桌面上。將密封固定架安裝于軸套上，將瓶架安裝于密封固定架上。位。打開(kāi)蒸汽發(fā)生器準(zhǔn)備提供蒸汽?？障鹥HDO電極孔、三針補(bǔ)料口的堵頭。補(bǔ)料口各膠管彎曲并用專(zhuān)用夾夾緊，將尾氣過(guò)濾瓶安裝于瓶架上。注：尾氣口必須敞開(kāi)。蓋上滅菌罩，擰緊固定螺絲，插上測(cè)溫電極的插頭。STEMP(105~130℃)與滅菌時(shí)間STIMER，將攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)置為0rpm，將中間溫度MTIME0行（5）。注：此時(shí)儀器的電源總開(kāi)關(guān)應(yīng)為關(guān)閉狀態(tài)。提供蒸汽源，打開(kāi)SW2-排水排氣閥，讓蒸汽不斷進(jìn)入罐內(nèi)，使罐體溫度不斷升高。當(dāng)滅菌罩溫度和恒溫槽溫度升至100℃左右后，逐漸關(guān)小W2，使溫度繼續(xù)上升，直到升到所需溫度（注意對(duì)應(yīng)壓力）這時(shí)應(yīng)不斷調(diào)節(jié)SW20.2Mpa130℃。S此時(shí)W2可略開(kāi)大一些，使罐壓逐漸釋放。當(dāng)罐壓到常壓狀態(tài)時(shí)，將W2-排水排汽閥全打開(kāi)，放盡冷凝水。小心取下滅菌罩，空消完成。注意防止內(nèi)部的瓶子掉下。實(shí)消2做好準(zhǔn)備工作。裝上已校正好的pDO電極并旋上保護(hù)蓋（或者用牛皮紙包扎也可以止滅菌時(shí)電極被蒸汽弄潮而損壞。放入發(fā)酵培養(yǎng)液。（4）同步驟3中(2)～(5)。S閥關(guān)閉，W2微開(kāi)，讓罐體自然冷卻。50℃以下，罐內(nèi)壓力達(dá)到常壓狀態(tài)時(shí)，小心取下滅菌罩，將W2-發(fā)酵準(zhǔn)備22－回水管堵頭，關(guān)閉W2－排水排汽閥，打開(kāi)W1－溢流水閥，打開(kāi)冷卻水源。關(guān)閉G7－減壓除水過(guò)濾器的壓力，將壓力調(diào)整至0.1～0.15MPa。注：發(fā)酵罐內(nèi)空氣壓力必須小于0.1MPa。當(dāng)發(fā)現(xiàn)壓力難以調(diào)整時(shí)，應(yīng)關(guān)閉7－減壓除水過(guò)濾器，將G－氣路調(diào)節(jié)閥打開(kāi)，然后重新進(jìn)行調(diào)整。10－進(jìn)氣過(guò)濾器與P1－壓力表用硅膠管連接。先打開(kāi)G松開(kāi)進(jìn)氣、尾氣口膠管夾頭，將氣量調(diào)節(jié)至工藝所需的流量。注：1018190.1Mpa。安裝好攪拌電機(jī)和頂蓋接地線(xiàn)。12(2)。取下DO、pH電極上的保護(hù)蓋或防護(hù)牛皮紙，連接DO電極、測(cè)溫電極、泡沫電極、pH電極和電機(jī)的插頭。注：蠕動(dòng)泵運(yùn)轉(zhuǎn)方向與膠管安裝方向。在非運(yùn)行（即非RUN）RUN，使罐體溫度較快下降。接種尾氣流量。打開(kāi)接種蓋，將其放入干凈滅菌紗布中。將菌種瓶口放在火焰上燒一下，并在火焰上拔下瓶塞將菌種倒入發(fā)酵罐。將接種蓋放在火焰上燒一下，蓋上接種蓋。按工藝要求恢復(fù)罐壓和通氣量。d軟管夾e取樣回氣口取樣瓶罐蓋放料取樣管pH電極進(jìn)行在線(xiàn)校正，將DOd軟管夾e取樣回氣口取樣瓶罐蓋放料取樣管圖7-1取樣示意圖夾緊尾氣膠管（使罐內(nèi)適當(dāng)增壓，但罐壓不得大于0.10Mp?！癲“e”,放去少量培養(yǎng)液后夾緊膠管。把無(wú)菌取樣瓶置于酒精焰上，拔去瓶塞對(duì)準(zhǔn)取料口，調(diào)節(jié)“e”“e”,夾緊取樣管口的膠管。d部位和“e”部位的夾子，放去膠管內(nèi)的殘料。75%酒精對(duì)取料口消毒。關(guān)機(jī)順序：先關(guān)電腦控制系統(tǒng)電源開(kāi)關(guān)，再關(guān)總電源開(kāi)關(guān)。發(fā)酵罐的清洗pH、DO電極按其要求保養(yǎng)。取下頂蓋其它電極、電機(jī)及其連線(xiàn)插頭，擰下進(jìn)氣膠管、冷凝器接頭。刷洗干凈罐內(nèi)部件。注：罐蓋搬動(dòng)清洗時(shí)只能抓住軸套或頂蓋，不能抓攪拌軸、葉輪和其它易變形部件。要平衡并注意罐與罐座間隙均衡，螺絲不要擰得過(guò)緊以免損壞玻璃罐。接口不能進(jìn)水、受潮。第三部分 補(bǔ)料分批培實(shí)驗(yàn)八種子的制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私獍l(fā)酵工業(yè)種子的制備工藝及質(zhì)量控制。二、實(shí)驗(yàn)原理到最高峰時(shí)較為合適。三、實(shí)驗(yàn)用品菌種：大腸桿菌。1%0.3%，NaCl0.5%，pH7.2。12120min。器材搖床，電爐，pH計(jì)，天平，糖度計(jì)，高壓滅菌鍋；燒杯，移液管，試管，三角瓶。四、實(shí)驗(yàn)方法500ml500ml100ml5瓶，滅菌。100ml豆芽汁培養(yǎng)基中，30℃，150rpm15～20。實(shí)驗(yàn)九 發(fā)酵罐培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私獍l(fā)酵罐的操作。二、實(shí)驗(yàn)原理微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法有靜置培養(yǎng)法、振蕩培養(yǎng)法、通氣攪拌培養(yǎng)法等。本實(shí)驗(yàn)以7L發(fā)酵罐培養(yǎng)酵母菌，從而說(shuō)明機(jī)械攪拌發(fā)酵罐的使用方法。三、實(shí)驗(yàn)用品菌種采用實(shí)驗(yàn)八制備的種子液。發(fā)酵培養(yǎng)基1%0.3%，NaCl0.5%，pH7.212130min3．器材7L發(fā)酵罐，蒸汽發(fā)生器，空氣壓縮機(jī)，pH計(jì)，天平；燒杯，移液管，試管。四、實(shí)驗(yàn)方法發(fā)酵罐的空消：發(fā)酵罐中加約70%（4.9L）的蒸餾水，參照實(shí)驗(yàn)七步驟3菌，12130min。滅菌結(jié)束后，冷卻至室溫，倒掉罐中水，準(zhǔn)備實(shí)消。4.5L4的方法校正pH電極、DO電極。參照實(shí)驗(yàn)七步驟4的方法滅菌，121℃滅菌30min。3．接種前準(zhǔn)備：滅菌結(jié)束后，連接進(jìn)氣管路，通入空氣。接通冷卻水管路，打開(kāi)冷卻水，打開(kāi)攪拌在低速100r/min檢測(cè)裝置，以及流加消泡劑管線(xiàn)。當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)溫度維持在37℃后，準(zhǔn)備接種。接種：提高罐壓至0.05MPa，參照實(shí)驗(yàn)七步驟7參照實(shí)驗(yàn)七步驟6500ml200r/mi100L/，罐0.04MPapH電極，使之與測(cè)定值相吻合。在通風(fēng)與攪拌的作用下，DODO電極至100%。20～30g/L0.1mol/LpH5.0；通過(guò)調(diào)節(jié)風(fēng)量和攪拌轉(zhuǎn)速維持溶氧濃度在30%左右。取樣：參照實(shí)驗(yàn)七步驟7取樣，自培養(yǎng)操作開(kāi)始起，每2h1h取一次樣。參照實(shí)驗(yàn)十、十一、十二方法分析樣品。液作為分析樣品外，剩余培養(yǎng)液要進(jìn)行殺菌處理。9方法對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行清洗。五、作業(yè)1hDO9-1。表9-1培養(yǎng)過(guò)程中各發(fā)酵參數(shù)時(shí)間/h pH值 DO值/% 溫度℃ 轉(zhuǎn)速/(r/min) 通風(fēng)/(L/h) 罐壓012345678一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

實(shí)驗(yàn)十 菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)的繪制了解分批培養(yǎng)時(shí)微生物生長(zhǎng)曲線(xiàn)形成的原理及各時(shí)期的主要特點(diǎn)。學(xué)習(xí)微生物生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)用品試樣實(shí)驗(yàn)九不同時(shí)間所取發(fā)酵液。器材分光光度計(jì)；燒杯，試管，濾紙，擦鏡紙。四、實(shí)驗(yàn)方法1．取約5ml樣品，以未接種的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，測(cè)定各樣品在550nm處的吸光度OD 2次，取平均值。5502．以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。五、作業(yè)將OD將550

測(cè)定結(jié)果填入表10-1，并繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。表10-1不同培養(yǎng)時(shí)間的菌體生長(zhǎng)量培養(yǎng)時(shí)/h 0 2 3 4OD550六、思考題

5 6 7每次從發(fā)酵罐中取出一定體積的樣品進(jìn)行測(cè)定，會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？測(cè)定生長(zhǎng)曲線(xiàn)時(shí)，除比濁法，還有哪些方法？它們各有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？實(shí)驗(yàn)十一 發(fā)酵過(guò)程中還原糖的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私膺€原糖在發(fā)酵過(guò)程中的意義。學(xué)習(xí)還原糖的測(cè)定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理的氧化亞銅。使用斐林試劑測(cè)糖的方法甚多，分為重量法、容量法、比色法三類(lèi)。與亞鐵氰化鉀生成可溶性的復(fù)應(yīng)終點(diǎn)由藍(lán)色轉(zhuǎn)為淺更易觀(guān)察。CuOK2 4

FeCN

HOKCu6 2 2

FeCN

2KOH6三、實(shí)驗(yàn)用品試樣實(shí)驗(yàn)九不同時(shí)間所取發(fā)酵液。溶液斐林試劑：

（淺黃色）①35gCuSO5HO0.05g1000m。4 2②乙液：稱(chēng)取117g酒石酸鉀鈉，126.4g氫氧化鈉，9.4g亞鐵氰化鉀，用水溶解并稀釋至1000ml。0.11.0000g（預(yù)先于10～10℃烘干5ml1000ml。器材電爐，電熱干燥箱；試劑瓶，燒杯，碘量瓶，移液管，堿式滴定管。四、實(shí)驗(yàn)方法5ml250ml10ml20ml0.1%（0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液1ml以?xún)?nèi)，搖勻。于電爐上加熱至沸，在沸騰狀態(tài)下立即以每2秒1滴的迅速0.1%1min3次，取接近的兩次滴定結(jié)果的平均值為V0ml。定糖：5ml，加入250ml三角瓶中，加V1ml試樣稀釋液（含葡萄糖量約為5～15mg）及適量的0.1%V2ml。5ml，加入250ml三角瓶中，加V1ml試樣稀釋液和(V2-1)毫升0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，補(bǔ)加[(V0+10)-(V1+V2)]毫升水，搖勻，以下同標(biāo)定時(shí)操作，總耗糖量為Vml。五、注意事項(xiàng)堿性條件下會(huì)發(fā)生分解。誤差。變動(dòng)，故需補(bǔ)加適量水予以調(diào)整。800W電爐，電爐溫度恒定后才能進(jìn)行加熱，并控制2min5．滴定速度需一致。滴定速度過(guò)快，會(huì)增加，反之糖消耗量會(huì)減少。次甲基藍(lán)也是一個(gè)氧化還原型物質(zhì)，過(guò)早加入、加量過(guò)多都會(huì)引入滴定誤差。動(dòng)三角瓶，更不能從電爐上取下后再行滴定。六、作業(yè)將測(cè)定結(jié)果記錄于表11-1，并根據(jù)附錄方法計(jì)算還原糖含量。表11-1不同培養(yǎng)時(shí)間的還原糖含量V0/ml時(shí)間/h 023 4V1/mlV2/mlV/ml還原糖/(g/100ml)

5 6 7附：還原糖含量的計(jì)算：

1還原糖（%）V0-V)×C×nV1

×100%0V：斐林試劑標(biāo)定值（ml）0V：斐林試劑測(cè)定值C：標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液濃度n：試樣稀釋倍數(shù)V1：所取試驗(yàn)稀釋液體積第四部分傳統(tǒng)產(chǎn)品的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)十二酸乳的發(fā)酵一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私馊樗峋纳L(zhǎng)特性和乳酸發(fā)酵的基本原理。學(xué)習(xí)酸乳的制作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理的益生菌，有利于維持人體腸道中的菌群平衡，因而是一種微生態(tài)制劑類(lèi)保健飲料。嗜熱乳酸鏈球菌（Streptococcusthermophilus）和保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus）是兩類(lèi)最常用的乳酸發(fā)酵菌種，乳酸菌種可以從市場(chǎng)銷(xiāo)售的各類(lèi)酸乳中分離。2發(fā)酵。雙歧桿菌菌體尖端呈分枝狀（Y型或V型，是一種無(wú)芽孢革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌，最37～41pH6.5～7.0CO。雙歧桿菌產(chǎn)生的