膜分離和電泳課件

膜分離和電泳

Membraneseparationandelectrophoresis

Chapter9

膜分離和電泳

Membraneseparationand本章主要知識點膜分離技術的概念。膜分離技術的分類。各種膜的分離特性。對于膜材料的基本要求。主要的膜組件類型。超濾和反滲透過程中滲透壓的影響本章主要知識點膜分離技術的概念。超濾的基本方程了解親和膜分離技術了解電滲析的工作原理超濾的基本方程膜分離技術膜分離的概念：利用膜的選擇性（孔徑大?。?，以膜的兩側存在的能量差作為推動力，由于溶液中各組分透過膜的遷移率不同而實現(xiàn)分離的一種技術。膜分離技術膜分離的概念：利用膜的選擇性（孔徑大?。?，以膜的兩膜的概念在一種流體相間有一層薄的凝聚相物質，把流體相分隔開來成為兩部分，這一薄層物質稱為膜。膜本身是均一的一相或由兩相以上凝聚物構成的復合體被膜分開的流體相物質是液體或氣體膜的厚度應在0.5mm以下，否則不能稱其為膜膜的概念在一種流體相間有一層薄的凝聚相物質，把流體相分隔開來膜分離技術的類型和定義膜分離過程的實質是物質透過或被截留于膜的過程，近似于篩分過程，依據(jù)濾膜孔徑大小而達到物質分離的目的，故而可以按分離粒子大小進行分類：微濾（MF）：以多孔細小薄膜為過濾介質，壓力差為推動力，使不溶性物質得以分離的操作，孔徑分布范圍在0.025~14μm之間；超濾（UF）：分離介質同上，但孔徑更小，為0.001~0.02μm，分離推動力仍為壓力差，適合于分離酶、蛋白質等生物大分子物質；膜分離技術的類型和定義膜分離過程的實質是物質透過或被截留于膜反滲透（RO）：是一種以壓力差為推動力，從溶液中分離出溶劑的膜分離操作，孔徑范圍在0.0001 ~0.001μm之間；（由于分離的溶劑分子往往很小，不能忽略滲透壓的作用，故而成為反滲透）；納濾：以壓力差為推動力，從溶液中分離300~1000小分子量的膜分離過程，孔徑分布在平均2nm；電滲析：以電位差為推動力，利用離子交換膜的選擇透過性，從溶液中脫除或富集電解質的膜分離操作；反滲透（RO）：是一種以壓力差為推動力，從溶液中分離出溶劑的微濾超濾納濾反滲透懸浮顆粒大分子有機物糖類等小分子有機物，二價鹽或多價鹽單價鹽水各種膜的分離特性微濾超濾納濾反滲透懸浮顆粒大分子有機物糖類等小分子有機物，二膜的分類按孔徑大?。何V膜、超濾膜、反滲透膜、納濾膜按膜結構：對稱性膜、不對稱膜、復合膜按材料分：合成有機聚合物膜、無機材料膜膜的分類按孔徑大?。何V膜、超濾膜、反滲透膜、納濾膜膜材料的特性對于不同種類的膜都有一個基本要求：耐壓：膜孔徑小，要保持高通量就必須施加較高的壓力，一般模操作的壓力范圍在0.1~0.5MPa，反滲透膜的壓力更高，約為1~10MPa耐高溫:高通量帶來的溫度升高和清洗的需要耐酸堿：防止分離過程中，以及清洗過程中的水解；化學相容性：保持膜的穩(wěn)定性；生物相容性：防止生物大分子的變性；成本低；膜材料的特性對于不同種類的膜都有一個基本要求：各種膜材料有機高分子膜： 纖維素酯膜、縮合系聚合物（聚砜類）、聚烯烴及其共聚物、脂肪族或芳香族聚酰胺類聚合物、全氟磺酸共聚物和全氟羧酸共聚物、聚碳酸酯；無機多孔膜：陶瓷膜各種膜材料有機高分子膜：各種膜組件平板式管式中空纖維螺旋卷繞式各種膜組件平板式平板式膜組件平板式膜組件管式膜組件管式膜組件螺旋卷式膜組件螺旋卷式膜組件中空纖維式膜組件中空纖維式膜組件膜過濾的基本概念和理論超濾和反滲透目的：將溶質通過一層具有選擇性的薄膜，從溶液中分離出來。分離時的推動力都是壓強，由于被分離物質的分子量和直徑大小差別及膜孔結構不同，其采用的壓強大小不同。反滲透膜的操作壓力高達10MPa。膜過濾的基本概念和理論超濾和反滲透超濾和反滲透操作中的滲透壓由于超濾和反滲透過程都是用一種半透膜把兩種不同濃度的溶液隔開（淡水或鹽水），因此都存在滲透壓。滲透壓的大小取決于溶液的種類、濃度和溫度；一般說來，無機小分子的滲透壓要比有機大分子溶質的滲透壓高得多。超濾和反滲透操作中的滲透壓由于超濾和反滲透過程都是用一種半透膜分離和電泳課件滲透與反滲透滲透與反滲透實現(xiàn)超濾和反滲透的條件超濾：需要增加流體的靜壓力，改變天然過程的方向，才可能發(fā)生含有低分子量化合物的溶劑流通過膜，此時的推動力是流體靜壓力與滲透壓的壓差；反滲透：過程類似于超濾，只是純溶劑通過膜，而低分子量的化合物被截留。因此，操作壓力比超濾大得多。

因此，超濾和反滲透通常又被稱之為“強制膜分離過程”實現(xiàn)超濾和反滲透的條件超濾：需要增加流體的靜壓力，改變天然過膜過濾的基礎理論通透量理論：一種基于粒子懸濁液在毛細管內流動的毛細管理論。水通量（Jw）和截留率（R）W—透水量，A—膜的有效面積，τ—時間c1—料液中溶質濃度，c2—透過液中溶質濃度膜過濾的基礎理論通透量理論：一種基于粒子懸濁液在毛細管內流動超濾的基本方程：穿透度（單位時間、單位膜面積的處理量）超濾的基本方程：穿透度（單位時間、單位膜面積的處理量）納米膜過濾技術介于反滲透與超濾膜之間，能截留有機小分子而使大部分無機鹽通過；特點：在過濾分離過程中，能截留小分子有機物，并可以同時透析除鹽，集濃縮與透析為一體；操作壓力低納米膜過濾技術介于反滲透與超濾膜之間，能截留有機小分子而使大納濾膜的性質與特點有多層聚合薄膜組成，濾膜為多孔性材料，平均孔徑為2nm，截留分子量范圍在100~200道爾頓之間；同樣要求其具有良好的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、有機溶劑穩(wěn)定性；主要產品：MembraneproductsKiryatWeizmann，MPW(以色列)DesalinationSystem(美國)SelRO,DESAL-5,FT-40等系列膜，F(xiàn)ilmtech公司（美國，明尼蘇達）納濾膜的性質與特點有多層聚合薄膜組成，濾膜為多孔性材料，平均納米過濾的分離機理納濾分離機理與反滲透膜了類似，同樣遵循，基本的膜傳遞方程：納米過濾的分離機理納濾分離機理與反滲透膜了類似，同樣遵循，基納濾的應用行業(yè)處理對象行業(yè)處理對象制藥工業(yè)母液中有效成分的回收抗菌素的分離純化維生素的分離純化氨基酸的脫鹽與純化化工行業(yè)酸堿純化、回收電鍍液中銅的回收食品工業(yè)乳清脫鹽與濃縮苛性堿回收純水制備超高純水水的脫鹽地下水的凈化染料工業(yè)活性染料的脫鹽與回收廢水處理印染廠廢水脫色造紙廠廢水凈化納濾的應用行業(yè)處理對象行業(yè)處理對象制藥工業(yè)母液中有效成分膜親和過濾法膜親和過濾法是傳統(tǒng)膜分離技術與親和分離技術的集成，是一種十分有效的分離方法。內容：包括兩個分支親和膜分離：制備帶有親和配基的分離膜，直接進行產物分離；親和-錯流膜過濾：將水溶性或非水溶性的高分子親和載體與產物進行特異性反應，然后進行錯流過濾；膜親和過濾法膜親和過濾法是傳統(tǒng)膜分離技術與親和分離技術的集成親和膜分離技術分離膜的改性：通過化學改性，在載體表面連接上一條“手臂鏈”（大于三個碳原子）；親和膜制備：選用合適的配基(Ligand)，與手臂鏈相連，構成帶有親和配基的分離介質；親和絡合：將混合物緩慢地通過膜，使要分離的物質與親和配基產生特異性作用，形成配基與配位物（Ligate）的復合體；洗脫：改變條件（洗脫液組成、pH、離子強度、溫度等），使復合物解離；親和膜再生：洗滌、再生、平衡，以備下次操作使用；親和膜分離技術分離膜的改性：通過化學改性，在載體表面連接上一需解決的關鍵問題膜表面要有足夠多的并可利用的化學基團；表面積和孔徑要足夠大孔分布要窄而均勻，以獲得高的通透量和分離效率：機械強度要高：要耐酸堿和高溫；需解決的關鍵問題膜表面要有足夠多的并可利用的化學基團；親和膜分離操作方式親和超濾過程（分離目標物的同時，濃縮其他成分）親和膜分離操作方式親和超濾過程（分離目標物的同時，濃縮其他成微孔親和過濾過程（僅分離目標物）微孔親和過濾過程（僅分離目標物）親和膜過濾純化伴刀豆蛋白A的實驗裝置親和膜過濾純化伴刀豆蛋白A的實驗裝置電滲析技術電滲析技術是在直流電場的作用下，由于離子交換膜的阻隔作用，實現(xiàn)溶液的淡化和濃縮，分離推動力是靜電引力。電滲析技術電滲析技術是在直流電場的作用下，由于離子交換膜的阻膜分離和電泳課件膜分離過程在生物工程中的應用過程應用對象實例微濾消毒、澄清收集細胞培養(yǎng)懸浮液除菌，產品消毒，細胞收集超濾大分子物質分離酶及蛋白質的分離、濃縮、純化，血漿分離、脫鹽、去熱源，膜反應器納濾小分子物質分離糖，二價鹽、游離酸的分離反滲透小分子物質濃縮單加鹽、非游離酸的分離透析小分子有機物和無機離子脫除小分子有機物或無機離子膜分離過程在生物工程中的應用過程應用對象實例微濾消毒、澄本章作業(yè)膜分離技術的概念。根據(jù)膜孔徑大小，膜分離技術可分為哪幾類？主要的膜組件有哪些？何謂反滲透膜分離過程？其特點有哪些？何謂強制膜分離過程？簡述電滲析膜分離的基本原理。本章作業(yè)膜分離技術的概念。電泳技術

Electrophoresis電泳技術

Electrophoresis本章主要知識點電泳的概念電泳的基本原理電泳技術的分類常用的凝膠電泳技術有哪些？電泳裝置的基本組成聚丙稀酰胺凝膠電泳的一般過程本章主要知識點電泳的概念SDS電泳的基本原理及過程瓊脂糖電泳的特點及其應用等電聚焦電泳的基本原理雙相電泳的概念及其特點SDS電泳的基本原理及過程電泳概念ArneTiselius——物理化學家、諾貝爾獎金獲得者定義——荷電的膠體粒子在電場中的移動；電泳決定于環(huán)繞每個離子的離子霧中的擴散雙電層，離子尺寸越大、溶液中的離子強度越高時，電泳現(xiàn)象變得越明顯。因此，電泳現(xiàn)象中的表面電勢和雙電層的因素起著決定性的作用。電泳概念ArneTiselius——物理化學家、諾貝爾獎金電泳的簡單原理蛋白質、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中，它們的凈電荷取決于介質的H+濃度或與其它大分子的相互作用。帶電粒子在電場中的遷移方式主要依據(jù)分子尺寸大小和形狀、分子所帶電荷或分子的生物學與化學特性。電泳的簡單原理蛋白質、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中，它們膜分離和電泳課件Stoke’sLaw（斯托克斯定律）如果把生物大分子的膠體溶液放在一個沒有干擾的電場中，使顆粒具有恒定遷移速率的驅動力來自于顆粒上的有效電荷Q和電位梯度E，它們與介質的摩擦阻力f相抗衡，這種抗衡服從斯托克斯定律：

f=6πrvηv是介質粘度為η中半徑為r的顆粒的移動速度。但實際情況中，f還取決于凝膠厚度、顆粒尺寸、甚至是介質的內滲等。Stoke’sLaw（斯托克斯定律）如果把生物大分子的膠體電泳遷移率電泳遷移率（mobility）:在電位梯度E的影響下，帶電顆粒在時間t中的遷移距離d。其單位是cm2·sec-1·V-1電泳遷移率的不同提供了從混合物中分離不同物質的基礎電泳遷移率電泳遷移率（mobility）:在電位梯度E的影響電泳的大致分類依據(jù)電泳原理，現(xiàn)有三種形式的電泳分離系統(tǒng)移動界面電泳（movingboundaryelectrophoresis）區(qū)帶電泳（zoneelectrophoresis）穩(wěn)態(tài)電泳（steadystateelectrophoresis）其中區(qū)帶電泳是目前常用的電泳系統(tǒng)。電泳的大致分類依據(jù)電泳原理，現(xiàn)有三種形式的電泳分離系統(tǒng)區(qū)帶電泳的主要技術區(qū)帶電泳中的常用技術載體電泳：粉末電泳、紙電泳、凝膠電泳、聚焦電泳無載體電泳：自由電泳、毛細管電泳區(qū)帶電泳的主要技術區(qū)帶電泳中的常用技術凝膠電泳作為電泳支持介質必須具有：化學惰性、不干擾大分子的電泳過程，化學穩(wěn)定性好、均勻、重復性好、電內滲小等特性。凝膠電泳的支持介質：聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamidegel,PGA） 由丙烯酰胺和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和增速劑的作用下，聚合而成；瓊脂糖凝膠： 從瓊脂中精制分離出的膠狀多糖，其分子結構大部分是由1,3連接的β-D吡喃半乳糖和1,4連接的3,6脫水α-D吡喃半乳糖交替形成的；凝膠電泳作為電泳支持介質必須具有：化學惰性、不干擾大分子的電丙烯酰胺的聚合丙烯酰胺的聚合通常是由化學或光化學過程完成的，通常采用過硫酸銨、過硫酸鉀或核黃素（引發(fā)劑）來引發(fā)該過程；以N，N，N’，N’-四甲基乙二胺（TEMED）為增速劑。該引發(fā)-增速的催化系統(tǒng)實質是自由基催化的氧化-還原過程。丙烯酰胺的化學聚合是由過硫酸銨在堿性條件下，產生游離氧自由基引發(fā)單體丙烯酰胺成為自由基狀態(tài)，經過一系列的自由基反應得到的聚合物；丙烯酰胺的聚合丙烯酰胺的聚合通常是由化學或光化學過程完成的，影響聚合的主要因素引發(fā)劑和增速劑的濃度：濃度小易導致聚合速度慢；濃度過大則易導致電泳時的燒膠以及電泳帶的畸變；一般控制使聚合過程在40~60分鐘內完成。系統(tǒng)pH值：酸性條件、堿性條件均可，但仍然存在一個最佳pH值，以獲得最佳的聚合結果；溫度：低溫下聚合導致凝膠變脆和混濁；適當提高溫度可以是凝膠透明而有彈性；分子氧：分子氧的存在會阻礙凝膠的化學聚合；抽氣系統(tǒng)純度：金屬離子會影響凝膠的聚合；影響聚合的主要因素引發(fā)劑和增速劑的濃度：濃度小易導致聚合速度聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分子篩效應在使用凝膠介質的電泳中，由于電泳介質具有高粘度和高的摩擦阻力，因此不僅可以防止對流，而且可以把擴散減到最小。凝膠中的大分子分離取決于它的電荷、尺寸和形狀凝膠的這種用于分離不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸篩分能力（Sizesievingcapacity），這種現(xiàn)象被稱為分子篩效應（molecularsievingeffect）聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分子篩效應在使用凝膠介質的電泳中，由于分子篩效應圖中A，B，C均為陽離子，在直流電場作用下電泳情況示意圖分子量大小依次為MA=MB>MC，所帶電荷量相同QA=QB=QC。ABC+-分子篩效應圖中A，B，C均為陽離子，在直流電場作用下電泳情況瓊脂糖凝膠的性能、結構與特點其優(yōu)點如下：瓊脂糖凝膠孔徑較大，0.075%瓊脂糖的孔徑為800nm，可以分析百萬道爾頓分子量的大分子，但分辨率較凝膠電泳低。機械強度高：可以在濃度1%以下使用；無毒；染色、脫色程序簡單，背景色較低；熱可逆性；生物中性：一般不與生物材料結合；電內滲（EEO）大：對于對流電泳有益瓊脂糖凝膠的性能、結構與特點其優(yōu)點如下：電泳新介質N-取代聚丙烯酰胺介質：Poly-N-acryl-tris(NAT)gelN-AcryloylsugarsAcryloylmorpholineHydrolinkgelsN-acryloylaminoethoxyethanol(AAEE)特點：具有極強的水解穩(wěn)定性具有高度親水性孔徑大電泳新介質N-取代聚丙烯酰胺介質：電泳系統(tǒng)的基本組成電泳槽：是凝膠電泳系統(tǒng)的核心部分，管式電泳槽、垂直板電泳槽、水平板電泳槽電源:聚丙烯酰胺凝膠電泳200~600V，載體兩性電解質等電聚焦電泳1000~2000V，固相梯度等電聚焦3000~8000V外循環(huán)恒溫系統(tǒng):高電壓會產生高熱，需冷卻；凝膠干燥器:用于電泳和染色后的干燥；灌膠模具：制膠，玻璃板和梳子；電泳轉移裝置：利用低電壓，大電流的直流電場，使凝膠電泳的分離區(qū)帶或電泳斑點轉移到特定的膜上，如PVDF膜電泳系統(tǒng)的基本組成電泳槽：是凝膠電泳系統(tǒng)的核心部分，管式電泳電泳洗脫儀：回收樣品凝膠掃描和攝錄裝置：對電泳區(qū)帶進行掃描，從而給出定量的結果。電泳洗脫儀：回收樣品垂直電泳槽及灌膠模具垂直電泳槽及灌膠模具電泳的一般過程電泳的一般過程膜分離和電泳課件常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：由于聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是多孔介質，不僅能防止對流，把擴散減少到最低；而且其孔徑大小與生物大分子具有相似的數(shù)量級，能主動參與生物分子的分離，具有分子篩效應。因此，在使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白質分離時，在電泳過程中不僅取決于蛋白質的電荷密度，還取決于蛋白質的尺寸和形狀。PAGE可以用圓盤電泳、垂直電泳或水平電泳常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：電泳前的準備工作緩沖系統(tǒng)的選擇：保證蛋白質的溶解性能、穩(wěn)定性以及生物活性的保持；電泳時間和分辨率：從理論上講PAGE可以在任何pH進行，但實際上過酸或過堿的條件下將發(fā)生某種水解（脫酰胺）。因此，pH應限制在3~10之間。電泳前的準備工作緩沖系統(tǒng)的選擇：緩沖系統(tǒng)的選擇原則是兩種標準的對立權衡如果緩沖液的pH選擇在遠離樣品中各種蛋白的等電點，蛋白質分子所帶電荷的密度大，電泳時間短，區(qū)帶細而窄；如果緩沖pH選擇在靠近被分離樣品的一種或幾種蛋白質的等電點，則蛋白質分子之間的電荷密度差別大，分辨率就高；

因此，常常選擇pH8.0~9.5的緩沖，常用的緩沖液有Tris-甘氨酸（pH8.3~9.5），Tris-硼酸(pH8.3~9.3)和Tris-醋酸（pH7.2~8.5）緩沖系統(tǒng)的選擇原則是兩種標準的對立權衡離子強度的選擇離子強度不宜過高，此時電導率低，產熱少，電泳速度快；但也不可過低，必須具有一定的緩沖能力，過低的離子強度容易導致蛋白質絮凝。一般選擇緩沖液的離子強度為0.01~0.1mol/L之間離子強度的選擇離子強度不宜過高，此時電導率低，產熱少，電泳速凝膠濃度的選擇由于PAGE電泳分離不僅取決于蛋白質的電荷密度，而且取決于分子的大小、形狀。因此，與凝膠的分子篩效應（即凝膠的孔徑與電泳的分辨率、電泳速度）密切相關。根據(jù)凝膠孔徑與被分離分子的大小和形狀，可以將凝膠分為：非排阻性凝膠（unrestrictivegel）:濃度0.7~1.0%的瓊脂糖凝膠；排阻性凝膠（restrictivegel）：濃度大于1%的瓊脂糖凝膠和常規(guī)PAGE凝膠濃度的選擇由于PAGE電泳分離不僅取決于蛋白質的電荷密度凝膠濃度太大，孔徑小于樣品分子尺寸，電泳時蛋白質分子不能進入凝膠，樣品仍留在加樣位置；凝膠濃度太小，孔徑太大，樣品中各種蛋白質分子均隨緩沖液推進，不能得到很好的分離；凝膠濃度太大，孔徑小于樣品分子尺寸，電泳時蛋白質分子不能進入凝膠濃度(C=2.6%)分子量范圍(kDa)凝膠濃度(C=5%)分子量范圍(kDa)530~200560~7001015~1001022~2801510~501510~200202~15205~150凝膠濃度與分子量測定的關系凝膠濃度分子量范圍凝膠濃度分子量范圍530~200560~7PAGE的具體操作過程制膠：確定凝膠配方（凝膠、引發(fā)劑、增速劑的濃度和緩沖液），使用灌膠模具灌膠；樣品準備：選擇合適的樣品緩沖液、確定合適的樣品濃度（1~2mg/L，考染），加樣（溴酚藍）；電泳：4~6小時，待溴酚藍前沿到達陽極底部；檢測：紫外掃描或染色（考馬斯亮藍R-250、銀染色—靈敏度比考染高100倍、熒光探針）；照相、凝膠干燥：定量測定：PAGE的具體操作過程制膠：確定凝膠配方（凝膠、引發(fā)劑、增速SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳主要用于測定蛋白質亞基分子量以及未知蛋白質分子量的測定；特點：設備簡單、操作簡便、測定快速、重復性高、樣品無需純化。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS的原理蛋白質分子的解聚SDS是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶性試劑，能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質分子的二級、三級結構；而強還原劑，如二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。因此，在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，蛋白質分子被解聚為組成它們的多肽鏈，解聚后的氨基酸側鏈與SDS結合后，形成帶負電的蛋白質-SDS膠束，所帶電荷遠遠超過了蛋白質原有的電荷量，消除了不同分子間的電荷差異；同時，蛋白質-SDS聚合體的形狀也基本相同，這就消除了在電泳過程中分子形狀對遷移率的影響。SDS的原理蛋白質分子的解聚蛋白質樣品用SDS處理后亞基的解聚和分子形狀的改變蛋白質樣品用SDS處理后亞基的解聚和分子形狀的改變未知蛋白質分子量的測定基于上述SDS的原理介紹，我們可以利用SDS電泳進行未知蛋白質的分子量測定；以不同分子量的標準蛋白進行SDS電泳得到不同標準蛋白的電泳遷移率，制作標準校正曲線，然后對未知蛋白在相同條件下進行SDS電泳，測定遷移率，從標準曲線得到相應的分子量；未知蛋白質分子量的測定基于上述SDS的原理介紹，我載體兩性電解質pH梯度等電聚焦等電聚焦（isoelectrofocusing）,IEF 利用蛋白質分子或其它兩性分子的等電點不同，在一個穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的pH梯度中進行蛋白質的分離和分析。利用等電聚焦技術分離、分析的對象僅限于蛋白質和兩性分子。根據(jù)建立pH梯度的原理不同，梯度有分為載體兩性電解質梯度（CarrierampholytespHgradient）和固相梯度。載體兩性電解質pH梯度等電聚焦等電聚焦（isoelectro工作原理蛋白質的等電點 蛋白質最主要的特性是它的帶電行為，它們在不同的pH環(huán)境中帶不同數(shù)量的正電或負電，只是在某一pH時，蛋白質的凈電荷為0，此pH即為該蛋白的等電點（isoelectricpointpI）。蛋白質的等電點取決于它的氨基酸組成和構象，是一個物理化學常數(shù)。可以利用等電點差異來進行蛋白質的分離、分析

工作原理蛋白質的等電點載體兩性電解質pH梯度等電聚焦原理載體兩性電解質pH梯度等電聚焦是在支持介質中加入載體兩性電解質，通以直流電后在兩極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)和線性的pH梯度，當帶電的蛋白質分子進入該體系時，便會產生移動，并聚集于相當于其等電點的位置。載體兩性電解質pH梯度等電聚焦原理載體兩性電解質pH梯度等電等電聚焦分離示意圖等電聚焦分離示意圖常規(guī)PAGE和等電聚焦電泳的區(qū)別常規(guī)PAGE和等電聚焦電泳的區(qū)別載體兩性電解質和pH梯度的形成等電聚焦技術的關鍵在于pH梯度的建立載體兩性電解質的概念：

作為載體兩性電解質應該具有以下特點：應該是兩性的，使它們在分離柱中也能達到一個平衡位置；應該可以作為“載體”，兩性電解質不能用于等電聚焦，只有載體兩性電解質，即具有好的導電性和好的緩沖能力的化合物才能用于等電聚焦。載體兩性電解質和pH梯度的形成等電聚焦技術的關鍵在于pH梯度用于等電聚焦的主要載體兩性電解質Ampholine(瑞典LKB公司)由許多脂肪族的多氨基多羧基的異構體和同系物組成，它們具有連續(xù)改變的氨基與羧基比Servalyte(德國Serva公司)產品BiolytePharmalyte(瑞典Pharmacia公司)產品分為九種pH范圍用于等電聚焦的主要載體兩性電解質Ampholine(瑞典LKpH梯度的形成在沒有電場時，載體兩性電解質的pH值大約是該溶液pH范圍的平均值，所有載體兩性電解質分子都荷電。當引入電場時，載體兩性電解質分子將向陰極或陽極遷移，帶有最低等電點的分子（荷最多負電）將最快地向陽極移動；當它達到凈電荷為0的位置時才停止，這個位置靠近陽極，由于它具有高的緩沖能力，使環(huán)境溶液的pH等于分子本身的pI。pH梯度的形成在沒有電場時，載體兩性電解質的pH值大約是該溶其次，一些低pI的載體兩性電解質（荷其次多的負電）也向陽極移動，直到它的凈電荷減少到0才停止。同樣的，其周圍環(huán)境溶液pH值也等于它本身的pI。依次類推，所有的載體兩性電解質分子用增加pI級數(shù)的方法將分別在陽極、陰極之間到達它們自己的位置，從而給出一個pH梯度。其次，一些低pI的載體兩性電解質（荷其次多的負電）也向陽極移載體兩性電解質在電場中

形成pH梯度的模式圖載體兩性電解質在電場中

形成pH梯度的模式圖水平等電聚焦電泳制膠：溶液配制（丙烯酰胺、N，N’-甲叉雙丙烯酰胺、載體兩性電解質等），灌膠；電泳：加樣可在凝膠上的任何位置，濃度一般為0.5~2mg/ml；固定：染色：脫色：水平等電聚焦電泳制膠：溶液配制（丙烯酰胺、N，N’-甲叉雙丙膜分離和電泳課件等電聚焦的主要應用同工酶分離、分析pI測定 實際應用當中，等電聚焦的操作過程要復雜得多，具體內容可參考《蛋白質電泳實驗技術》，作者：郭堯君，科學出版社。等電聚焦的主要應用同工酶分離、分析雙相電泳第一相等電聚焦第二相SDS－PAGE目的：為了獲得更詳細的組分信息目前已經廣泛應用于蛋白質組研究中雙相電泳第一相等電聚焦膜分離和電泳課件膜分離和電泳課件膜分離和電泳

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Chapter9

膜分離和電泳

Membraneseparationand本章主要知識點膜分離技術的概念。膜分離技術的分類。各種膜的分離特性。對于膜材料的基本要求。主要的膜組件類型。超濾和反滲透過程中滲透壓的影響本章主要知識點膜分離技術的概念。超濾的基本方程了解親和膜分離技術了解電滲析的工作原理超濾的基本方程膜分離技術膜分離的概念：利用膜的選擇性（孔徑大?。阅さ膬蓚却嬖诘哪芰坎钭鳛橥苿恿?，由于溶液中各組分透過膜的遷移率不同而實現(xiàn)分離的一種技術。膜分離技術膜分離的概念：利用膜的選擇性（孔徑大小），以膜的兩膜的概念在一種流體相間有一層薄的凝聚相物質，把流體相分隔開來成為兩部分，這一薄層物質稱為膜。膜本身是均一的一相或由兩相以上凝聚物構成的復合體被膜分開的流體相物質是液體或氣體膜的厚度應在0.5mm以下，否則不能稱其為膜膜的概念在一種流體相間有一層薄的凝聚相物質，把流體相分隔開來膜分離技術的類型和定義膜分離過程的實質是物質透過或被截留于膜的過程，近似于篩分過程，依據(jù)濾膜孔徑大小而達到物質分離的目的，故而可以按分離粒子大小進行分類：微濾（MF）：以多孔細小薄膜為過濾介質，壓力差為推動力，使不溶性物質得以分離的操作，孔徑分布范圍在0.025~14μm之間；超濾（UF）：分離介質同上，但孔徑更小，為0.001~0.02μm，分離推動力仍為壓力差，適合于分離酶、蛋白質等生物大分子物質；膜分離技術的類型和定義膜分離過程的實質是物質透過或被截留于膜反滲透（RO）：是一種以壓力差為推動力，從溶液中分離出溶劑的膜分離操作，孔徑范圍在0.0001 ~0.001μm之間；（由于分離的溶劑分子往往很小，不能忽略滲透壓的作用，故而成為反滲透）；納濾：以壓力差為推動力，從溶液中分離300~1000小分子量的膜分離過程，孔徑分布在平均2nm；電滲析：以電位差為推動力，利用離子交換膜的選擇透過性，從溶液中脫除或富集電解質的膜分離操作；反滲透（RO）：是一種以壓力差為推動力，從溶液中分離出溶劑的微濾超濾納濾反滲透懸浮顆粒大分子有機物糖類等小分子有機物，二價鹽或多價鹽單價鹽水各種膜的分離特性微濾超濾納濾反滲透懸浮顆粒大分子有機物糖類等小分子有機物，二膜的分類按孔徑大小：微濾膜、超濾膜、反滲透膜、納濾膜按膜結構：對稱性膜、不對稱膜、復合膜按材料分：合成有機聚合物膜、無機材料膜膜的分類按孔徑大小：微濾膜、超濾膜、反滲透膜、納濾膜膜材料的特性對于不同種類的膜都有一個基本要求：耐壓：膜孔徑小，要保持高通量就必須施加較高的壓力，一般模操作的壓力范圍在0.1~0.5MPa，反滲透膜的壓力更高，約為1~10MPa耐高溫:高通量帶來的溫度升高和清洗的需要耐酸堿：防止分離過程中，以及清洗過程中的水解；化學相容性：保持膜的穩(wěn)定性；生物相容性：防止生物大分子的變性；成本低；膜材料的特性對于不同種類的膜都有一個基本要求：各種膜材料有機高分子膜： 纖維素酯膜、縮合系聚合物（聚砜類）、聚烯烴及其共聚物、脂肪族或芳香族聚酰胺類聚合物、全氟磺酸共聚物和全氟羧酸共聚物、聚碳酸酯；無機多孔膜：陶瓷膜各種膜材料有機高分子膜：各種膜組件平板式管式中空纖維螺旋卷繞式各種膜組件平板式平板式膜組件平板式膜組件管式膜組件管式膜組件螺旋卷式膜組件螺旋卷式膜組件中空纖維式膜組件中空纖維式膜組件膜過濾的基本概念和理論超濾和反滲透目的：將溶質通過一層具有選擇性的薄膜，從溶液中分離出來。分離時的推動力都是壓強，由于被分離物質的分子量和直徑大小差別及膜孔結構不同，其采用的壓強大小不同。反滲透膜的操作壓力高達10MPa。膜過濾的基本概念和理論超濾和反滲透超濾和反滲透操作中的滲透壓由于超濾和反滲透過程都是用一種半透膜把兩種不同濃度的溶液隔開（淡水或鹽水），因此都存在滲透壓。滲透壓的大小取決于溶液的種類、濃度和溫度；一般說來，無機小分子的滲透壓要比有機大分子溶質的滲透壓高得多。超濾和反滲透操作中的滲透壓由于超濾和反滲透過程都是用一種半透膜分離和電泳課件滲透與反滲透滲透與反滲透實現(xiàn)超濾和反滲透的條件超濾：需要增加流體的靜壓力，改變天然過程的方向，才可能發(fā)生含有低分子量化合物的溶劑流通過膜，此時的推動力是流體靜壓力與滲透壓的壓差；反滲透：過程類似于超濾，只是純溶劑通過膜，而低分子量的化合物被截留。因此，操作壓力比超濾大得多。

因此，超濾和反滲透通常又被稱之為“強制膜分離過程”實現(xiàn)超濾和反滲透的條件超濾：需要增加流體的靜壓力，改變天然過膜過濾的基礎理論通透量理論：一種基于粒子懸濁液在毛細管內流動的毛細管理論。水通量（Jw）和截留率（R）W—透水量，A—膜的有效面積，τ—時間c1—料液中溶質濃度，c2—透過液中溶質濃度膜過濾的基礎理論通透量理論：一種基于粒子懸濁液在毛細管內流動超濾的基本方程：穿透度（單位時間、單位膜面積的處理量）超濾的基本方程：穿透度（單位時間、單位膜面積的處理量）納米膜過濾技術介于反滲透與超濾膜之間，能截留有機小分子而使大部分無機鹽通過；特點：在過濾分離過程中，能截留小分子有機物，并可以同時透析除鹽，集濃縮與透析為一體；操作壓力低納米膜過濾技術介于反滲透與超濾膜之間，能截留有機小分子而使大納濾膜的性質與特點有多層聚合薄膜組成，濾膜為多孔性材料，平均孔徑為2nm，截留分子量范圍在100~200道爾頓之間；同樣要求其具有良好的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、有機溶劑穩(wěn)定性；主要產品：MembraneproductsKiryatWeizmann，MPW(以色列)DesalinationSystem(美國)SelRO,DESAL-5,FT-40等系列膜，F(xiàn)ilmtech公司（美國，明尼蘇達）納濾膜的性質與特點有多層聚合薄膜組成，濾膜為多孔性材料，平均納米過濾的分離機理納濾分離機理與反滲透膜了類似，同樣遵循，基本的膜傳遞方程：納米過濾的分離機理納濾分離機理與反滲透膜了類似，同樣遵循，基納濾的應用行業(yè)處理對象行業(yè)處理對象制藥工業(yè)母液中有效成分的回收抗菌素的分離純化維生素的分離純化氨基酸的脫鹽與純化化工行業(yè)酸堿純化、回收電鍍液中銅的回收食品工業(yè)乳清脫鹽與濃縮苛性堿回收純水制備超高純水水的脫鹽地下水的凈化染料工業(yè)活性染料的脫鹽與回收廢水處理印染廠廢水脫色造紙廠廢水凈化納濾的應用行業(yè)處理對象行業(yè)處理對象制藥工業(yè)母液中有效成分膜親和過濾法膜親和過濾法是傳統(tǒng)膜分離技術與親和分離技術的集成，是一種十分有效的分離方法。內容：包括兩個分支親和膜分離：制備帶有親和配基的分離膜，直接進行產物分離；親和-錯流膜過濾：將水溶性或非水溶性的高分子親和載體與產物進行特異性反應，然后進行錯流過濾；膜親和過濾法膜親和過濾法是傳統(tǒng)膜分離技術與親和分離技術的集成親和膜分離技術分離膜的改性：通過化學改性，在載體表面連接上一條“手臂鏈”（大于三個碳原子）；親和膜制備：選用合適的配基(Ligand)，與手臂鏈相連，構成帶有親和配基的分離介質；親和絡合：將混合物緩慢地通過膜，使要分離的物質與親和配基產生特異性作用，形成配基與配位物（Ligate）的復合體；洗脫：改變條件（洗脫液組成、pH、離子強度、溫度等），使復合物解離；親和膜再生：洗滌、再生、平衡，以備下次操作使用；親和膜分離技術分離膜的改性：通過化學改性，在載體表面連接上一需解決的關鍵問題膜表面要有足夠多的并可利用的化學基團；表面積和孔徑要足夠大孔分布要窄而均勻，以獲得高的通透量和分離效率：機械強度要高：要耐酸堿和高溫；需解決的關鍵問題膜表面要有足夠多的并可利用的化學基團；親和膜分離操作方式親和超濾過程（分離目標物的同時，濃縮其他成分）親和膜分離操作方式親和超濾過程（分離目標物的同時，濃縮其他成微孔親和過濾過程（僅分離目標物）微孔親和過濾過程（僅分離目標物）親和膜過濾純化伴刀豆蛋白A的實驗裝置親和膜過濾純化伴刀豆蛋白A的實驗裝置電滲析技術電滲析技術是在直流電場的作用下，由于離子交換膜的阻隔作用，實現(xiàn)溶液的淡化和濃縮，分離推動力是靜電引力。電滲析技術電滲析技術是在直流電場的作用下，由于離子交換膜的阻膜分離和電泳課件膜分離過程在生物工程中的應用過程應用對象實例微濾消毒、澄清收集細胞培養(yǎng)懸浮液除菌，產品消毒，細胞收集超濾大分子物質分離酶及蛋白質的分離、濃縮、純化，血漿分離、脫鹽、去熱源，膜反應器納濾小分子物質分離糖，二價鹽、游離酸的分離反滲透小分子物質濃縮單加鹽、非游離酸的分離透析小分子有機物和無機離子脫除小分子有機物或無機離子膜分離過程在生物工程中的應用過程應用對象實例微濾消毒、澄本章作業(yè)膜分離技術的概念。根據(jù)膜孔徑大小，膜分離技術可分為哪幾類？主要的膜組件有哪些？何謂反滲透膜分離過程？其特點有哪些？何謂強制膜分離過程？簡述電滲析膜分離的基本原理。本章作業(yè)膜分離技術的概念。電泳技術

Electrophoresis電泳技術

Electrophoresis本章主要知識點電泳的概念電泳的基本原理電泳技術的分類常用的凝膠電泳技術有哪些？電泳裝置的基本組成聚丙稀酰胺凝膠電泳的一般過程本章主要知識點電泳的概念SDS電泳的基本原理及過程瓊脂糖電泳的特點及其應用等電聚焦電泳的基本原理雙相電泳的概念及其特點SDS電泳的基本原理及過程電泳概念ArneTiselius——物理化學家、諾貝爾獎金獲得者定義——荷電的膠體粒子在電場中的移動；電泳決定于環(huán)繞每個離子的離子霧中的擴散雙電層，離子尺寸越大、溶液中的離子強度越高時，電泳現(xiàn)象變得越明顯。因此，電泳現(xiàn)象中的表面電勢和雙電層的因素起著決定性的作用。電泳概念ArneTiselius——物理化學家、諾貝爾獎金電泳的簡單原理蛋白質、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中，它們的凈電荷取決于介質的H+濃度或與其它大分子的相互作用。帶電粒子在電場中的遷移方式主要依據(jù)分子尺寸大小和形狀、分子所帶電荷或分子的生物學與化學特性。電泳的簡單原理蛋白質、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中，它們膜分離和電泳課件Stoke’sLaw（斯托克斯定律）如果把生物大分子的膠體溶液放在一個沒有干擾的電場中，使顆粒具有恒定遷移速率的驅動力來自于顆粒上的有效電荷Q和電位梯度E，它們與介質的摩擦阻力f相抗衡，這種抗衡服從斯托克斯定律：

f=6πrvηv是介質粘度為η中半徑為r的顆粒的移動速度。但實際情況中，f還取決于凝膠厚度、顆粒尺寸、甚至是介質的內滲等。Stoke’sLaw（斯托克斯定律）如果把生物大分子的膠體電泳遷移率電泳遷移率（mobility）:在電位梯度E的影響下，帶電顆粒在時間t中的遷移距離d。其單位是cm2·sec-1·V-1電泳遷移率的不同提供了從混合物中分離不同物質的基礎電泳遷移率電泳遷移率（mobility）:在電位梯度E的影響電泳的大致分類依據(jù)電泳原理，現(xiàn)有三種形式的電泳分離系統(tǒng)移動界面電泳（movingboundaryelectrophoresis）區(qū)帶電泳（zoneelectrophoresis）穩(wěn)態(tài)電泳（steadystateelectrophoresis）其中區(qū)帶電泳是目前常用的電泳系統(tǒng)。電泳的大致分類依據(jù)電泳原理，現(xiàn)有三種形式的電泳分離系統(tǒng)區(qū)帶電泳的主要技術區(qū)帶電泳中的常用技術載體電泳：粉末電泳、紙電泳、凝膠電泳、聚焦電泳無載體電泳：自由電泳、毛細管電泳區(qū)帶電泳的主要技術區(qū)帶電泳中的常用技術凝膠電泳作為電泳支持介質必須具有：化學惰性、不干擾大分子的電泳過程，化學穩(wěn)定性好、均勻、重復性好、電內滲小等特性。凝膠電泳的支持介質：聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamidegel,PGA） 由丙烯酰胺和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和增速劑的作用下，聚合而成；瓊脂糖凝膠： 從瓊脂中精制分離出的膠狀多糖，其分子結構大部分是由1,3連接的β-D吡喃半乳糖和1,4連接的3,6脫水α-D吡喃半乳糖交替形成的；凝膠電泳作為電泳支持介質必須具有：化學惰性、不干擾大分子的電丙烯酰胺的聚合丙烯酰胺的聚合通常是由化學或光化學過程完成的，通常采用過硫酸銨、過硫酸鉀或核黃素（引發(fā)劑）來引發(fā)該過程；以N，N，N’，N’-四甲基乙二胺（TEMED）為增速劑。該引發(fā)-增速的催化系統(tǒng)實質是自由基催化的氧化-還原過程。丙烯酰胺的化學聚合是由過硫酸銨在堿性條件下，產生游離氧自由基引發(fā)單體丙烯酰胺成為自由基狀態(tài)，經過一系列的自由基反應得到的聚合物；丙烯酰胺的聚合丙烯酰胺的聚合通常是由化學或光化學過程完成的，影響聚合的主要因素引發(fā)劑和增速劑的濃度：濃度小易導致聚合速度慢；濃度過大則易導致電泳時的燒膠以及電泳帶的畸變；一般控制使聚合過程在40~60分鐘內完成。系統(tǒng)pH值：酸性條件、堿性條件均可，但仍然存在一個最佳pH值，以獲得最佳的聚合結果；溫度：低溫下聚合導致凝膠變脆和混濁；適當提高溫度可以是凝膠透明而有彈性；分子氧：分子氧的存在會阻礙凝膠的化學聚合；抽氣系統(tǒng)純度：金屬離子會影響凝膠的聚合；影響聚合的主要因素引發(fā)劑和增速劑的濃度：濃度小易導致聚合速度聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分子篩效應在使用凝膠介質的電泳中，由于電泳介質具有高粘度和高的摩擦阻力，因此不僅可以防止對流，而且可以把擴散減到最小。凝膠中的大分子分離取決于它的電荷、尺寸和形狀凝膠的這種用于分離不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸篩分能力（Sizesievingcapacity），這種現(xiàn)象被稱為分子篩效應（molecularsievingeffect）聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分子篩效應在使用凝膠介質的電泳中，由于分子篩效應圖中A，B，C均為陽離子，在直流電場作用下電泳情況示意圖分子量大小依次為MA=MB>MC，所帶電荷量相同QA=QB=QC。ABC+-分子篩效應圖中A，B，C均為陽離子，在直流電場作用下電泳情況瓊脂糖凝膠的性能、結構與特點其優(yōu)點如下：瓊脂糖凝膠孔徑較大，0.075%瓊脂糖的孔徑為800nm，可以分析百萬道爾頓分子量的大分子，但分辨率較凝膠電泳低。機械強度高：可以在濃度1%以下使用；無毒；染色、脫色程序簡單，背景色較低；熱可逆性；生物中性：一般不與生物材料結合；電內滲（EEO）大：對于對流電泳有益瓊脂糖凝膠的性能、結構與特點其優(yōu)點如下：電泳新介質N-取代聚丙烯酰胺介質：Poly-N-acryl-tris(NAT)gelN-AcryloylsugarsAcryloylmorpholineHydrolinkgelsN-acryloylaminoethoxyethanol(AAEE)特點：具有極強的水解穩(wěn)定性具有高度親水性孔徑大電泳新介質N-取代聚丙烯酰胺介質：電泳系統(tǒng)的基本組成電泳槽：是凝膠電泳系統(tǒng)的核心部分，管式電泳槽、垂直板電泳槽、水平板電泳槽電源:聚丙烯酰胺凝膠電泳200~600V，載體兩性電解質等電聚焦電泳1000~2000V，固相梯度等電聚焦3000~8000V外循環(huán)恒溫系統(tǒng):高電壓會產生高熱，需冷卻；凝膠干燥器:用于電泳和染色后的干燥；灌膠模具：制膠，玻璃板和梳子；電泳轉移裝置：利用低電壓，大電流的直流電場，使凝膠電泳的分離區(qū)帶或電泳斑點轉移到特定的膜上，如PVDF膜電泳系統(tǒng)的基本組成電泳槽：是凝膠電泳系統(tǒng)的核心部分，管式電泳電泳洗脫儀：回收樣品凝膠掃描和攝錄裝置：對電泳區(qū)帶進行掃描，從而給出定量的結果。電泳洗脫儀：回收樣品垂直電泳槽及灌膠模具垂直電泳槽及灌膠模具電泳的一般過程電泳的一般過程膜分離和電泳課件常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：由于聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是多孔介質，不僅能防止對流，把擴散減少到最低；而且其孔徑大小與生物大分子具有相似的數(shù)量級，能主動參與生物分子的分離，具有分子篩效應。因此，在使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白質分離時，在電泳過程中不僅取決于蛋白質的電荷密度，還取決于蛋白質的尺寸和形狀。PAGE可以用圓盤電泳、垂直電泳或水平電泳常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：電泳前的準備工作緩沖系統(tǒng)的選擇：保證蛋白質的溶解性能、穩(wěn)定性以及生物活性的保持；電泳時間和分辨率：從理論上講PAGE可以在任何pH進行，但實際上過酸或過堿的條件下將發(fā)生某種水解（脫酰胺）。因此，pH應限制在3~10之間。電泳前的準備工作緩沖系統(tǒng)的選擇：緩沖系統(tǒng)的選擇原則是兩種標準的對立權衡如果緩沖液的pH選擇在遠離樣品中各種蛋白的等電點，蛋白質分子所帶電荷的密度大，電泳時間短，區(qū)帶細而窄；如果緩沖pH選擇在靠近被分離樣品的一種或幾種蛋白質的等電點，則蛋白質分子之間的電荷密度差別大，分辨率就高；

因此，常常選擇pH8.0~9.5的緩沖，常用的緩沖液有Tris-甘氨酸（pH8.3~9.5），Tris-硼酸(pH8.3~9.3)和Tris-醋酸（pH7.2~8.5）緩沖系統(tǒng)的選擇原則是兩種標準的對立權衡離子強度的選擇離子強度不宜過高，此時電導率低，產熱少，電泳速度快；但也不可過低，必須具有一定的緩沖能力，過低的離子強度容易導致蛋白質絮凝。一般選擇緩沖液的離子強度為0.01~0.1mol/L之間離子強度的選擇離子強度不宜過高，此時電導率低，產熱少，電泳速凝膠濃度的選擇由于PAGE電泳分離不僅取決于蛋白質的電荷密度，而且取決于分子的大小、形狀。因此，與凝膠的分子篩效應（即凝膠的孔徑與電泳的分辨率、電泳速度）密切相關。根據(jù)凝膠孔徑與被分離分子的大小和形狀，可以將凝膠分為：非排阻性凝膠（unrestrictivegel）:濃度0.7~1.0%的瓊脂糖凝膠；排阻性凝膠（restrictivegel）：濃度大于1%的瓊脂糖凝膠和常規(guī)PAGE凝膠濃度的選擇由于PAGE電泳分離不僅取決于蛋白質的電荷密度凝膠濃度太大，孔徑小于樣品分子尺寸，電泳時蛋白質分子不能進入凝膠，樣品仍留在加樣位置；凝膠濃度太小，孔徑太大，樣品中各種蛋白質分子均隨緩沖液推進，不能得到很好的分離；凝膠濃度太大，孔徑小于樣品分子尺寸，電泳時蛋白質分子不能進入凝膠濃度(C=2.6%)分子量范圍(kDa)凝膠濃度(C=5%)分子量范圍(kDa)530~200560~7001015~1001022~2801510~501510~200202~15205~150凝膠濃度與分子量測定的關系凝膠濃度分子量范圍凝膠濃度分子量范圍530~200560~7PAGE的具體操作過程制膠：確定凝膠配方（凝膠、引發(fā)劑、增速劑的濃度和緩沖液），使用灌膠模具灌膠；樣品準備：選擇合適的樣品緩沖液、確定合適的樣品濃度（1~2mg/L，考染），加樣（溴酚藍）；電泳：4~6小時，待溴酚藍前沿到達陽極底部；檢測：紫外掃描或染色（考馬斯亮藍R-250、銀染色—靈敏度比考染高100倍、熒光探針）；照相、凝膠干燥：定量測定：PAGE的具體操作過程制膠：確定凝膠配方（凝膠、引發(fā)劑、增速SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳主要用于測定蛋白質亞基分子量以及未知蛋白質分子量的測定；特點：設備簡單、操作簡便、測定快速、重復性高、樣品無需純化。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS的原理蛋白質分子的解聚SDS是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶性試劑，能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質分子的二級、三級結構；而強還原劑，如二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇能