基因缺失疫苗研制課件

傳統疫苗：不能區(qū)分自然感染野毒和疫苗免疫豬基因缺失疫苗：缺失主要毒力基因（TK）和非必需糖蛋白基因（gG或gE），使臨床上實現區(qū)分自然感染野毒豬和疫苗免疫豬成為可能。以鄂A株為親本的

TK-/gG-/Lacz+、TK-/gE-

雙基因缺失弱毒活疫苗和gG-、gE-單基因缺失滅活疫苗為臨床上區(qū)分PrV自然感染豬和疫苗免疫豬,達到最終根除該病提供了有效的工具。利用體外表達被缺失的糖蛋白基因作抗原，建立鑒別診斷方法，為逐步淘汰自然感染豬，建立健康豬群，最終實現消滅偽狂犬病的目的?；蛉笔б呙缪兄苹蚬こ掏蛔冎甑臉嫿耙呙缪兄?/p>

從PrVEa株基因組DNA文庫篩選含TK基因的文庫片段

缺失TK基因將LacZ基因表達盒插入gG基因使其失活將LacZ基因表達盒插入gE基因使其失活

與Ea株野毒基因組重組

TK-缺失突變株與Ea株野毒基因組重組

gG-/LacZ+突變株TK-/gG-/LacZ+缺失突變株gE-/LacZ+突變株TK-/gE-/LacZ+缺失突變株

基因缺失活疫苗研制油乳劑滅活苗

動物試驗動物試驗

田間中試田間中試重組已構建的基因工程突變株

TK-/LacZ+

TK-

gG-/LacZ+

TK-/gG-/LacZ+

gE-/LacZ+

TK-/gE-TK-/gG-/LacZ+雙基因缺失疫苗株對小白鼠毒力的測定

病毒毒株試驗動物數量LD50

TK-/gG-/LacZ+

Balb/c小鼠60>10-1.0/0.1mL

鄂A強毒株6010-25/0.1mLBartha株6010-1.0/0.1mL與Bartha株相比，TK-/gG-/LacZ+缺失株對小白鼠的毒力更低TK-/gG-/LacZ+雙基因缺失疫苗株對妊娠母豬的安全性試驗

接種劑量試驗動物數產仔成績數活仔數死胎數流產數107.0TCID50

2222200106.0TCID50

2202000105.0TCID50

2232300對照組

3303000將TK-/gG-/LacZ+疫苗毒株作10倍系列稀釋，即10-1、10-2、10-3滴度，接種妊娠40-90天的母豬，觀察其產仔成績，以確定該疫苗對妊娠母豬及胎兒的影響。試驗結果說明，107.0—105.0TCID50的劑量接種后，母豬均能正常產仔，對胎兒均不造成損害，所產仔豬無死胎、木乃伊胎，與非接種疫苗對照組之間的差異也不顯著（P>0.05）。

TK-/gG-/LacZ+雙基因缺失株對1日齡仔豬的安全性

接種劑量(TCID50)動物數(頭)接種前(℃)接種后（天）體溫變化(℃)

123456107.0106.0105.0對照755439.3±0.1839.4±0.2439.8±0.1839.3±0.2839.1±0.2438.4±0.1938.8±0.2739.3±0.2839.5±0.3439.2±0.2239.9±0.1939.0±0.2139.4±0.3539.4±0.2439.5±0.2138.7±0.1939.9±0.3439.4±0.2740±0.1939.3±0.1840.0±0.2639.2±0.1939.1±0.2839.6±0.2039.6±0.2839.3±0.2139.5±0.2439.9±0.18將TK-/gG-/LacZ+疫苗株病毒按原液、10-1、10-2、10-3稀釋度，接種1日齡仔豬，觀察其精神狀態(tài)、測量體溫，觀察21天，確定其安全性.這幾組接種疫苗的仔豬至21日齡時全部存活，無一死亡；各劑量組之間、各劑量組與對照組之間引起仔豬的體溫變化差異不顯著（P>0.05），而且不導致發(fā)熱反應（≥40℃）。不同劑量TK-/gG-/LacZ+突變株免疫

21天后攻毒的體溫變化

接種劑量組攻毒前體溫動物數(頭)攻毒后（天）的體溫變化

123456107.0106.0105.0對照組38.9±0.3139.0±0.2839.0±0.2838.9±0.19755439.0±0.2039.2±0.1739.5±0.1939.7±0.2139.4±0.1939.5±0.1940.2±0.1939.6±0.2439.3±0.2539.3±0.2839.1±0.2139.6±0.1939.5±0.3939.7±0.2439.1±0.1939.9±0.2839.2±0.2639.6±0.1639.5±0.2739.7±0.2939.3±0.1939.2±0.2739.5±0.2439.3±0.27TK-/LacZ+突變株的構建TK-突變株與野毒株所形成空斑的比較左圖為Ea株親本形成的空斑右圖為Ea株TK缺失突變株形成的空斑gG-/LacZ+突變株的構建gG-/LacZ+突變株形成的藍斑TK-/gE-突變株的構建

TK-/gG-/LacZ+突變株形成的藍斑偽狂犬病TK-/gG-/LacZ+雙基因缺失疫苗生物學特性動物實驗遺傳穩(wěn)定性安全性與免疫效果免疫劑量與免疫程序中試與區(qū)域試驗已通過了農業(yè)部生物安全性評價申報了新獸藥證書，按照新獸藥證書的要求，完成了TK-/gG-/LacZ+雙基因缺失疫苗株與其它

毒株在不同細胞上的生長滴度

毒株細胞類型培養(yǎng)條件TCID50

鄂A強毒株IBRS-2大扁瓶，靜止培養(yǎng)，37℃

10-7.0/0.1mL

TK-/gG-/LacZ+

IBRS-2大扁瓶，靜止培養(yǎng)，37℃10-7.0/0.1mL

雞胚成纖維細胞1萬毫升瓶，旋轉培養(yǎng)

10-5.33/0.1mL

Bartha株IBRS-2大扁瓶，靜止培養(yǎng)，37℃10-6.0/0.1mL

在豬源細胞（IBRS-2）中，該疫苗毒株與親本毒株（鄂A株）增殖滴度未發(fā)生改變，Bartha株增殖能力較低?；蛉笔е暝陔u胚成纖維細胞增殖滴度為10-5.33/0.1mL

。TK-/gE-/LacZ+突變株形成的藍斑TK-/gG-/LacZ+雙基因缺失疫苗的研制按常規(guī)方法制備雞胚成纖維單層細胞，將TK-/gG-/LacZ+雙基因缺失突變株按所加培養(yǎng)液1：10的比例接種到雞胚成纖維單層細胞，吸附1小時后，加入培養(yǎng)基，轉瓶培養(yǎng)，出現細胞病變后凍融細胞收毒。經測定，TCID50為10-5.3/0.1ml。理論上，1ml病毒液可以作為13個免疫劑量。該疫苗株的增殖滴度已能滿足大規(guī)模生產疫苗時對抗原量的要求。將1ml病毒培養(yǎng)液加入適當的保護劑后按《獸用生物制品學》的要求進行凍干、抽真空、加塞等過程，制成凍干活毒疫苗，用于實驗室檢測和部分田間試驗。凍干活疫苗置-20℃保存，每隔2個月抽樣測定疫苗活病毒的含量，未發(fā)生明顯變化，疫苗可保存12個月以上。

該疫苗的獨特效果

可用于新生仔豬的超前免疫，安全性高可用于緊急預防注射，16-24h左右產生極顯著的治療效果產生的抗體水平高、作用時間快、安全性高、免疫效果好等方面都超過國外的同類產品。通過在全國100萬頭份的臨床應用充分證實了這一效果的確實性和可靠性與國外同類產品的技術參數比較使用疫苗免疫劑量動物數免疫后1個月中