二蛋白質(zhì)研究方法課件

蛋白質(zhì)研究方法§3.蛋白質(zhì)變性proteindenaturalization蛋白質(zhì)在某些理化因素的作用下，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,導(dǎo)致生物學(xué)功能喪失,理化性質(zhì)發(fā)生改變,稱為蛋白質(zhì)的變性。僅空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，而一級(jí)結(jié)構(gòu)不改變1、鑒定（1）測(cè)定蛋白質(zhì)活性，如酶活（2）測(cè)物理性質(zhì)：O.D.，粘度，溶解度，圓二色性，電泳遷移率等（3）測(cè)化學(xué)性質(zhì)：顏色反應(yīng)（變性后加強(qiáng)）（4）免疫法測(cè)抗原性2、變性因素溫度熱變性pH——破壞鹽鍵有機(jī)溶劑——削弱疏水作用尿素，鹽酸胍——?dú)滏I，疏水作用表面活性劑

SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后使其表面帶有大量負(fù)電荷，非常穩(wěn)定地溶解于水中第二章蛋白質(zhì)研究方法蛋白質(zhì)研究對(duì)象的選擇和樣品的獲取蛋白質(zhì)檢測(cè)和鑒定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析蛋白質(zhì)生物學(xué)功能分析蛋白質(zhì)研究的發(fā)展趨勢(shì)一、蛋白質(zhì)研究對(duì)象的選擇和樣品的獲取1、研究對(duì)象的選擇往往是組織中含量較高，相對(duì)比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，不過一些新的蛋白質(zhì)正在成為研究者的目標(biāo)直接從生物組織中提取、純化蛋白根據(jù)基因組測(cè)序獲得的信息，獲取有關(guān)基因的cDNA全序列，再通過重組DNA技術(shù)去表達(dá)重組蛋白質(zhì)2、蛋白質(zhì)的提取破碎細(xì)胞：通過機(jī)械的方式，如研磨、超聲、高壓等去垢劑處理溶解膜蛋白許多蛋白質(zhì)在體內(nèi)與質(zhì)膜結(jié)合，需要以去垢劑分離包括：脫氧膽酸鈉，SDS，TritonX-100,NP-40穩(wěn)定從細(xì)胞中釋放的蛋白加蛋白水解酶抑制劑：PMSF,Leupeptin,Aprotinin

低溫操作去除細(xì)胞碎片——離心離心懸浮在溶液中的各種粒子沉降速度是不一樣的，質(zhì)量越大、密度越高的粒子沉降速度越大。相對(duì)離心力（×g)：RCF=F離心力/F重力=mω2x/mg=ω2x/gg=980cm/s2

RCF=1.119×10-5n2x

n:轉(zhuǎn)數(shù)/分，x:懸浮粒子離轉(zhuǎn)軸的距離（厘米）沉降速度dx/dt=d2(ρp-ρm)ω2x/18η（eta）沉降系數(shù)：?jiǎn)挝浑x心力作用下粒子的沉降速度（Svedberg單位，1S=10-13s）3、蛋白質(zhì)純化目的：把目標(biāo)蛋白單獨(dú)分離出來以供研究使用方法：根據(jù)蛋白質(zhì)自身性質(zhì)，可以采用多種方法分子大小：凝膠分子篩層析溶解度：鹽析電荷：離子交換層析，等電點(diǎn)沉淀，電泳特異親和性：親和層析基因表達(dá)（2）離子交換層析（ion-exchangechromatography）利用表面帶電荷的基團(tuán)修飾過的樹脂柱，在特定pH下和流過的蛋白溶液發(fā)生離子交換，并結(jié)合帶相反電荷的蛋白質(zhì)，從而分離純化陽離子交換樹脂，CM-纖維素CM52，CM32陰離子交換樹脂，DEAE-纖維素DE52，DE23（3）排阻層析：根據(jù)蛋白質(zhì)分子大?。ㄇ驙畹鞍祝┑牟町悂矸蛛x葡聚糖凝膠(sephadex)，瓊脂糖凝膠(sepharose)SephadexG-10~200Sephadex的型號(hào)以G值來表示，代表每克干膠吸水的量G-200：20ml/gG值越大，孔徑越大，膠越軟，分子篩效應(yīng)：分子越大走的越快Gelfiltrationchromatography（4）親和層析（affinitychromatography）根據(jù)要分離的目標(biāo)蛋白能與某種被稱為配基的其它分子特異性相互結(jié)合的特點(diǎn)而設(shè)計(jì)配基可以是酶的底物，抗體/抗原，重組蛋白特異序列（GST-GSH；His6-Ni2+）（5）基因工程重組蛋白

（Recombinanttechniques）?Clonetheinterestedproteinencodinggeneinanexpressionvectorwithapurificationtagaddedatthe5’-or3’endofthegene?Proteinover-expressioninacell?Proteinpurificationwithaffinitychromatography.

GST-fusionprotein,sixHis-fusionproteinaffinity:GSH-sepharoseNi2+-sepharose4、蛋白質(zhì)濃縮

超濾

冷凍干燥5、濃度測(cè)定克氏定氮N–16%比色法Folin-酚法，BCA法紫外吸收法排除核酸干擾(mg/ml)=1.55A280-0.76A260Two-dimensionalgelelectrophoresiscanseparateproteinsofsimilarmass.Proteinsarefirstseparatedonthebasisoftheirchargesbyisoelectricfocusing(step1).TheresultinggelstripisappliedtoanSDS-polyacrylamidegelandtheproteinsareseparatedintobandsbymass(step2).3、分子大小層析，超離心，質(zhì)譜4、免疫反應(yīng)檢測(cè)放射性免疫測(cè)定，免疫沉淀，免疫印跡5、氨基酸序列測(cè)定四、蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能分析基因敲除和基因轉(zhuǎn)染檢測(cè)蛋白相互作用：免疫共沉淀GST-pulldown酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用

篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥物對(duì)蛋白質(zhì)之間相互作用的影響