第2課時(shí)引物及探針設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)

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Real-time12312344最重要、最關(guān)鍵的步驟：引物/探針的設(shè)Realtime-PCR所用引物與普通PCR引物設(shè)計(jì)的區(qū)普通PCR引目的是獲得目 ，對非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求不嚴(yán)格Realtime-的 ，擴(kuò)效、異及物聚。結(jié)論：Realtime-PCR對引物設(shè)計(jì)要求嚴(yán)重要原擴(kuò)增片段大重要原擴(kuò)增片段大＜200bp(80-150bp最佳引物長★18-GC★40%-60%(45%-55%最佳退火溫上下游Tm盡量接近引物序★1的保守區(qū)域整體上堿基不能過偏避免多個(gè)重復(fù)的堿基引物3’★末尾5個(gè)堿基＜2個(gè)末位堿基最好為避免出現(xiàn)3個(gè)及以上連續(xù)相同的堿互補(bǔ)引物避免3個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列引物3’端避免2兩條引物間避免3個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列特異Blast檢索RT-PCR盡量跨過內(nèi)含子，設(shè)計(jì)在兩個(gè)不同的外顯子重要原探針長25-重要原探針長25-65-72℃，高出引物★1的保守區(qū)域且富含2避免多個(gè)重復(fù)的堿基引物5’不能為探針避免3個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列與兩條引物間避免3個(gè)堿Blast檢索★盡量靠近上游引物，最佳距離為1第一步：查找序 軟件：NCBI以NCBI為演示打開找到gene選輸入ERCC1，點(diǎn)擊Search查找找到human點(diǎn)擊，進(jìn)入頁面的基本信息介紹ERCC1在組織的表達(dá)情況ERCC1SNP匯總。其他的相互SNPSNP 組信mRNA及蛋白的信ERCC1mRNA有3種剪接剪接體2和點(diǎn)擊進(jìn)入mRNA頁面，點(diǎn)擊 核苷酸序列至txt上txt上不同剪接體的序列用>號隔開★★，保存到指定位置第二步：序列比對，找到保守區(qū)軟件：BioEdit、MEGA、DNAman（1）打開BioEdit軟點(diǎn)擊file，下拉菜單，找到找到保存好的BioEdit（4）點(diǎn)擊AccessoryApplication，下單，找到ClustalWMultiple勾選outputClustalformat點(diǎn)擊RunClustalW，點(diǎn)擊比對結(jié)果（表示堿基序列相同結(jié)論：181bp-892bp范圍內(nèi)堿第三步：設(shè)計(jì)引PrimerBlast等以ERCC1的190bp-890bp之間的序列為板，設(shè)計(jì)引（1）打開Primer5.0軟2點(diǎn)擊File，下拉菜單New，點(diǎn)擊 模板堿基序列，Ctrl+V粘貼S：上游引A：下游引F:5'GAGAGACGCCCAACCAGGR:5'CGCACGAACTTCAGTACGGPro:5'FAM-距離上游引物

F:5'TCAGAGCCCCTGGCAGGAGAGR:5'GGGATTGCCCCTCTGCCGAGG引物F:5'AGAGACGCCCAACCAGGCCCTR:5'GGGATTGCCCCTCTGCCGAGGF:5'TCCAACAGCATCATTGTGAGCR:5'GGAATTACGTCGCCAAATTCC軟件：NCBI打開NCBI，拉至底部，找將上下游引 過去勾選Human+transcript選勾選Somewhatsequence(blastn)選點(diǎn)擊（8）分析結(jié)結(jié)果：與ERCC1匹配度100%，其他為 點(diǎn)擊每一個(gè)結(jié)果，可看到具體比對序 由大約22個(gè)核苷酸組成的單鏈miRNA長度過于短小無法直接應(yīng)用常規(guī)的PCR技術(shù)擴(kuò)必須要延長待測miRNA的長度，構(gòu)建出一個(gè)足夠長的PCR模板方法：莖環(huán)法和加尾法（逆轉(zhuǎn)錄方法有差異加尾對miRNA進(jìn)行加PolyA尾處理，改造成的結(jié)構(gòu)，再采用mRNA常用的oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄引進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，從而得到較長的模板鏈莖環(huán)設(shè)計(jì)一種特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中直接完成模板鏈的引物設(shè)計(jì)原“一對“一對”是指PCR擴(kuò)增的上下游引物“半”是反轉(zhuǎn)PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)原則遵守常規(guī)PCR引物設(shè)計(jì)原則數(shù)據(jù)庫miRBase打開miRBase，輸hsa-miR-21，點(diǎn)擊提交加尾 下游引物為公司提供，根據(jù)RT引物的同下游引物可通用下游引物是5’CAGTGCGTGTCGTGGAGT上游引物采用Primer5.0設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)過程同一般上游引物與RT引物中miRNA的序列不得超過兩個(gè)，防止非特異性結(jié)miR-21的引物F:R:5’CAGTGCGTGTCGTGGAGT 發(fā)叉結(jié)