醫(yī)科考研-藥分5體內(nèi)藥物分析

第五內(nèi)藥物分 ysisinBiologaical1體內(nèi)藥物分析：體內(nèi)樣品中藥物及其代謝物或內(nèi)源性生物活性物質(zhì)的定量分析。建立在臨床藥理學(xué)(Clinicalpharmacology)、生物藥劑學(xué)(Biopharmacy)和現(xiàn)代藥物分析學(xué)(Modernpharmaceuticalysis)基礎(chǔ)上的新型2【大綱要1、掌握體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)和應(yīng)用，體內(nèi)樣品分析的前處理、體內(nèi)樣品分析方法驗(yàn)證的內(nèi)2、熟悉體內(nèi)樣品 方法、體內(nèi)樣品3、 內(nèi)藥物分析的重要性質(zhì)與意3藥理作用強(qiáng)度與作用部位的濃度直接

分吸 代相 化學(xué)等價(jià)而生物學(xué)不等

療效不4臟活性代謝內(nèi)源性活性物5人6任務(wù)方法學(xué)研為新藥研究提供基本數(shù)為治療藥物監(jiān)測(cè)（TherapeuticDrug7干擾8◆采樣量◆待測(cè)物濃度◆干擾物質(zhì)需前處方法靈敏度及專(zhuān)屬性要求工作量色譜分析◆免疫分析◆生物學(xué)方9 yticalGasChromatography/GC-MSHPLC/HPLC-MS/MS/ChiralHPLC Enzymeimmunoassay第一節(jié)常用體內(nèi)樣品 與貯一、體內(nèi)樣品的種尿樣：用于藥物劑量回收、尿清組織：藥物在臟器的分布情頭發(fā)：體內(nèi)微量元素、用藥史、毒性藥物監(jiān)二、體內(nèi)樣 血 （靜脈采血血漿靜脈血置含的放置30-

1000×g

淡黃色上清淡黃色上清（二）特濃度高，收集量大，易受飲食、排汗干貯加入適當(dāng)防唾組處三、體內(nèi)樣品 與處冷藏和冷凍 長(zhǎng)期冷凍（-20℃或-80~-去活性例：班布特羅（毒扁豆堿分分離濃集分測(cè)改性使待測(cè)藥物游其其去蛋衍生分離濃綴合水（一）溶劑解乙腈、甲體積比：1：2～390％去除2、加入中性常用中性鹽比例 90％去除方法：超速離心3、加入強(qiáng)常用溶10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫體積比：1：0.690％去除方法：超速離心精密取血漿樣品0.2mL于置1.5mLEP，加入內(nèi)標(biāo)溶液（頭孢氨芐，1mg/mL）20圖1空白血漿加舒巴坦色譜圖2空白血漿加入頭孢他啶和頭孢氨芐的色譜（A）頭孢他啶（B）頭孢氨圖3受試者給予1.5g頭孢他啶-舒巴坦（2:1）受試制劑30min時(shí)血漿色24(A頭孢他啶(B頭孢氨（二）液－液提取法是水溶性的，當(dāng)用萃取時(shí)，藥物被萃取出來(lái)而內(nèi)源性物質(zhì)被除去，因此采用萃的特劑 劑選 選 3、水相的pH3、水相的pH值：堿性藥物→24、提取次數(shù)：往往進(jìn)行的是一次萃取，個(gè)別pH水進(jìn)行反萃?。˙ackextraction)

必要時(shí)調(diào)pH血漿或其他生血漿或其他生物樣分分取流動(dòng)相溶解后進(jìn)樣分 減壓氮?dú)獯凳纠蝴}酸曲美他嗪緩釋片生物等效性示例：鹽酸曲美他嗪緩釋片生物等效性精密量取血漿樣品200μl，置2mlEP管中，精密加入甲醇-水（1：1）溶液20μl，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液（200.0000ng/ml丁咯地爾）20μl，加入堿化試劑（1mol/LNaOH溶液）50μl，渦旋混合30秒，加入提取溶劑甲基叔丁基醚2ml，渦旋混合1分鐘，離心（14000rpm）5，分取上層有機(jī)相，于40，殘留物加流動(dòng)相200μl，渦旋混合1分鐘，離心（14000rpm）3分鐘，取上清液180μl進(jìn)樣

圖1-3空白血漿色譜Intensity,Intensity,

圖1-4待測(cè)物曲美他嗪（10.0000ng/ml）與內(nèi)標(biāo)丁咯地爾（20.0000ng/ml）的血漿樣品色譜2、固相萃取Solidphaseextraction,（1）藥物與固定相的親和力>雜質(zhì)與固定相（2）（2）藥物與固定相的親和力<雜質(zhì)與固定相SPE方法建立－以親脂性鍵合硅膠1、以甲醇潤(rùn)濕小柱，活化填料，甲醇含量2、用水或緩沖液沖洗小柱，洗去多余的3、上樣，棄去廢4、用水或緩沖液沖洗小柱除去水溶性雜5、用合適的洗脫劑洗脫小柱，收集洗脫6、回收溶劑后進(jìn)行分析和監(jiān)4、萃取堿性藥物時(shí)，常需在洗脫機(jī)中加酸、有機(jī)胺 洗6、選用反相硅 時(shí)，少量的甲醇和乙腈即可完成SPE方法的優(yōu) 的形色譜分析法、免疫分析法、生物學(xué)分析分析方法建實(shí)際樣品的二、分析方法的驗(yàn)1、生物樣品量2、濃3、內(nèi)源性物質(zhì)的干4、生物 差異較 需要(validation 首先為分析方—特異性、精密度與準(zhǔn)確度、回收率、定量限與檢測(cè)限、溶液穩(wěn)定性其次為生物基質(zhì)中待測(cè)藥物穩(wěn)定性的驗(yàn)—室溫放置、冷凍（或冷藏）、凍-融循Freeze-and-thaw 方法的特異性—選擇性—系指將待測(cè)物質(zhì)與其代謝物及同服的其它藥物加以區(qū)分(分離) 11比較—待測(cè)藥物或其活性代謝產(chǎn)物檢測(cè)信號(hào)對(duì)照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）空白生物基模擬生物樣品（空白生物基質(zhì)中添加對(duì)照品—如HPLC色譜峰tR、nT是否一致及與內(nèi)源性物質(zhì)色譜峰R確證—內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)分析方法有無(wú)干 22比較模擬生物樣品和用藥后的實(shí)際生物樣品的檢測(cè)信號(hào)與代謝產(chǎn)物的R如HPLC色譜峰的tR、n和T〔或改變色譜條件(色柱)再比較〕來(lái)確證其它代謝產(chǎn)物對(duì)分析方法有無(wú) 33TDM—還要考慮患者可能同時(shí)服用藥物的干的檢測(cè)信號(hào)如HPLC色譜峰的tR、nT是否一來(lái)確證同時(shí)服用藥物對(duì)分析方法的 精密量取4名受試者空白血漿200μl，置2mlEP管中，精密加入乙腈40μl，按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下自“加入堿化試劑（1mol/LNaOH溶液）50μl”起同法試驗(yàn)。得色譜圖1-3；精密量取空白血漿200μl，置2mlEP（102.4000ng/ml）20μl和內(nèi)標(biāo)溶液（200.0000ng/ml丁咯地爾）20，按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下自“加入堿化試劑（1mol/LNaOH溶液μl”起同法試驗(yàn)，得色譜圖1-精密量取受試者13單次口服受試制劑0.75小時(shí)后的血漿樣品200μl，置2mlEP管中，按“血漿樣品處理方法”同法試驗(yàn)，得色譜圖1-5。上述色譜圖結(jié)果表明曲美他嗪的保留時(shí)間為3.16分鐘左右，丁咯地爾的保留時(shí)間為1.96

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（standardcurve）calibrationcurveorworking——除少數(shù)方法（免疫分析法）—回歸分析法為最小二乘法（leastsquares） 最小二乘法（weightedleast線(xiàn)性范圍（linearrang）—— 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)—用模擬生物樣品建—范圍(不包括零點(diǎn))應(yīng)覆蓋全部生物樣品中的藥物濃—不能使用外推的方法求算未知生物樣品中的藥物濃 標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液內(nèi)內(nèi)標(biāo)溶液標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)系列模擬生物樣品標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪最小最小二乘限度要 1.標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的濃度較低— 至少含5～8個(gè)濃度點(diǎn)(不包括零點(diǎn),即空白—可覆蓋全部待測(cè)生物樣品中的藥物濃如：1、2、5、10、0、50、10(等比梯度模式—)若體內(nèi)平均達(dá)峰濃度為50，其1/20為設(shè)定最高濃度為100，最低濃度為1 差異 2、內(nèi)標(biāo)溶液如：某標(biāo)準(zhǔn)溶液5、10、20、40、80、160、320μg/ml，則內(nèi)標(biāo)的濃度應(yīng)配制成40μg/ml 3.③渦旋混 4.4.以待測(cè)藥物的檢測(cè)響應(yīng)(如色譜峰面積或峰高)或與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)響應(yīng)的比值(內(nèi)標(biāo)法)(因變量,y)對(duì)模擬血藥濃度(自變量,x)—求得回歸方程y＝a＋bx)及其相關(guān)系在一組由至少7個(gè)濃度(不包括零點(diǎn))構(gòu)成的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中，至多可有2個(gè)濃度點(diǎn)數(shù)據(jù)，可予剔除。但應(yīng)有確切原因，如：（1）樣品處理有損失；（2）色譜圖有問(wèn)題；顯著偏離標(biāo)準(zhǔn)曲—其余應(yīng)有至少5個(gè)濃度點(diǎn)在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 普通最小二乘法—每個(gè)濃度點(diǎn)絕對(duì)誤差(yi－yi’予同等的重要

(

y')2 iyy2yii標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上的高低濃度相差懸殊(范圍達(dá)i—低濃度區(qū)的計(jì)算值相對(duì)誤差過(guò) 以滿(mǎn)足規(guī)定要求。—式中，i為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上第i個(gè)濃度點(diǎn)的權(quán)重因子2w(yy' 當(dāng)

=1/(y’)2時(shí)，

y'w(yy')2

i而yi與xi成正

y' y'（3）所以，令 (通常當(dāng)高濃度點(diǎn)測(cè)量值的準(zhǔn)確度下降過(guò)低濃度點(diǎn)權(quán)重過(guò)大，降低低濃度點(diǎn)的權(quán)重， 藥代動(dòng)力學(xué)或生物利用度研—標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)至少包括5個(gè)濃度(通常為5～8個(gè)濃度,不包括零點(diǎn)—最高濃度應(yīng)高于達(dá)峰濃度(Cmax)；最低濃度應(yīng)低于Cmax的5%，并應(yīng)為方法的LOQ(非—回歸方程的截距應(yīng)接近于零，b≥使之具有較高的靈敏—相關(guān)系數(shù)要求≥0.99(色譜法)或≥0.98(生物學(xué)方—若非線(xiàn)性，可分為高低兩個(gè)濃度區(qū)間(每個(gè)區(qū)間不少于5個(gè)濃度分 回歸—如、、 精密量取空白血漿200μl，置2mlEP管中，分別精密加入不同濃度曲美他嗪標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各20μl，配制成血漿中曲美他嗪濃度0.50001.00002.500010.000050.000000，200nml的血漿樣品，按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下自“精密加入內(nèi)標(biāo)溶液（00/ml丁咯地爾）”起同法試驗(yàn)，每一濃度進(jìn)行雙樣本分析，曲美他嗪的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以待測(cè)物濃度與內(nèi)標(biāo)物濃度比值為橫坐標(biāo)X，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值（As/i）為縱坐標(biāo)Y，用最小二乘法[]（權(quán)重系數(shù)：WX）進(jìn)行線(xiàn)性回歸運(yùn)算，求得的線(xiàn)性回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程。結(jié)果表明，曲美他嗪在000～00/ml范圍內(nèi)待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物峰面積之比線(xiàn)性關(guān)系良[]。 100110120130140150160170180190（三）、定量方法定量限(limitof—系指在保證具有一定可靠性(準(zhǔn)確度與精密度符合要求)的前提下，能測(cè)定出生物樣品中藥物的最—標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上的最低濃度 體內(nèi)藥物分 11同一同一生物介質(zhì)，5個(gè)獨(dú)立的標(biāo)準(zhǔn)濃度大于（S/N）＝5體內(nèi)體內(nèi)藥物分LODLOD 體內(nèi)藥物分 22要求—應(yīng)能滿(mǎn)足測(cè)定3～5個(gè)消除半衰期后生—準(zhǔn)確度在80%～120%(或RE在±20—（四）（四）方方法精密度(precisionQ的RSD—包括批內(nèi)和批間—反映分析方法的可操作性，是方法驗(yàn)證的基—使用模擬生物樣品測(cè)方法準(zhǔn)確度—系指用該方法測(cè)得的生物樣品中待測(cè)藥—應(yīng)使用實(shí)際生物樣品測(cè)定，但實(shí)際生物樣品的濃度是未知的所以，通常使用模擬生—一般用相對(duì)回收率(relativeRR對(duì)誤差(relativeerror，RE)表 1. DSSAn(Xi DSSAn(XiX)iI1100(%) I 100(%)DXXSStotSSA NI100(%) N ）XX =（XX2i1jn(XiX 2i N ）X批內(nèi) 計(jì)—測(cè)定值M(measured)的平均值與理論濃度(加入 相對(duì)

RRA

相對(duì)限度要

RE

MA

RR—相對(duì)回收率應(yīng)在85%～115%(LOQ附近—RE在±15%(LOQ附近為 在生物樣品的分析中，需要對(duì)樣品的存放條件和時(shí)間進(jìn)行，以保證分析結(jié)果的方法穩(wěn)生物樣品的穩(wěn)定相關(guān)穩(wěn)定性的測(cè)定方法與要 生物樣品的穩(wěn)定短期穩(wěn)定性主要模擬生物樣品在室溫、4℃或－20℃以及凍－融循環(huán)條件長(zhǎng)期穩(wěn)定性主要生物樣品長(zhǎng)期冰（－20℃或－80℃）后的穩(wěn)定 測(cè)定方法與要1、取高、中、低三個(gè)濃度的QC樣品，在不同條件下存放不同時(shí)間后，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次，平均值應(yīng)為零時(shí)測(cè)定的±5％以?xún)?nèi)（經(jīng)衍生化處理±15％以?xún)?nèi)）。時(shí)間大于1天，則應(yīng)與新制QC時(shí)間很長(zhǎng)，可與反復(fù)在液氮中保存的樣品在相同條件下的測(cè)定值比較2室溫下－個(gè)工作日（、2、482）冰箱中－數(shù)個(gè)工作日數(shù)星期、數(shù)月） （六）生物樣品的預(yù)處理方（1）方法準(zhǔn)確度(或相對(duì)回收率，relativerecovery)，操（2）取回收對(duì)回收absoluterecovery)提取回收率與相對(duì)回收率的比萃取回收率主 生物樣品預(yù)處理過(guò)程造成的藥物程度損 測(cè)定方法的準(zhǔn)確度，采用標(biāo)準(zhǔn) 1測(cè)定取空白生物基質(zhì)(如血漿)， 高、中、低3個(gè)濃度另取等量的相同3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用溶解模擬生物樣品經(jīng)提取處理后的殘?jiān)娜軇┫♂屩镣w R

體內(nèi)藥物分 22在生物利用度或TDM低濃度的RSD內(nèi)標(biāo)法中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的提