分子克隆技術(shù)第一部分課件

將某載體上的水稻DNA片段亞克隆到另一載體上第一部分：分子克隆技術(shù)pUC19pU1301+1.5KB外源雙酶切：

BamHI+KpnI兩種載體的抽提瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量兩種載體的限制性內(nèi)切酶消化目的片段的回收及亞克隆載體的去磷酸化載體與外源DNA的連接感受態(tài)細胞的制備連接子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞重組子篩選及鑒定亞克隆的主要步驟質(zhì)粒載體的提取是一個復(fù)制子，載體在受體細胞中能大量繁殖，其攜帶的外源基因才能在受體細胞中得到大量擴增有1到多個限制內(nèi)切酶的單一識別與切割位點，便于外源基因的插入具有選擇性的遺傳標記(如抗生素抗性標記等)以此知道它是否已進入受體細胞，并據(jù)此標記將攜帶載體的細胞從其他細胞中分離出來載體必備條件雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子，具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能使子代細胞保持它們恒定的拷貝數(shù)，可表達它所攜帶的遺傳信息。它可獨立游離于細胞質(zhì)中，也可整合到細菌染色體上。質(zhì)粒在細胞內(nèi)的復(fù)制可分為嚴謹型（只在細胞周期的一定階段進行復(fù)制，一個細胞內(nèi)只有1至幾個拷貝）和松弛型（細胞周期中隨時可以復(fù)制，拷貝數(shù)較多，一般在細胞內(nèi)有20個以上）質(zhì)粒的基本特點SolutionI: Tris.HCl（pH7.5） 50mM EDTA 10mM RNaseA 100μg/mlSolutionII:NaOH 0.2M SDS 1%SolutionIII:Finalconcentration KAC1.32M UsingHACtoadjustpHto4.8TE(pH8.0)：Tris.HCl（pH8.0） 10mM EDTA（pH8.0）

1mM苯酚/氯仿無水乙醇或異丙醇

堿裂解法用到的試劑SolutionIII中和后，宿主DNA由于很大，堿基還未來得及配對就在冰冷的條件下與SDS、蛋白質(zhì)、高分子量的RNA等纏繞在一起沉淀下來，而質(zhì)粒DNA由于很小且雙鏈未分開，能夠迅速配對重新形成超螺旋，處于溶解狀態(tài)。試劑的作用（二）試劑的作用（三）苯酚/氯仿：純化質(zhì)粒，去除質(zhì)粒溶液中殘留的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)；無水乙醇或95%乙醇或異丙醇：沉淀質(zhì)粒DNATE或H2O：溶解質(zhì)粒DNA實驗材料攜帶pUC19質(zhì)粒載體的大腸桿菌菌液攜帶含有水稻DNA片段的pU1301載體的大腸桿菌菌液。操作步驟取含有相應(yīng)載體的大腸桿菌菌液于含有相應(yīng)抗生素的LA培養(yǎng)基上涂布或劃線分離單菌落，37℃過夜培養(yǎng)）；用無菌牙簽或接種環(huán)挑取單菌落，接種于含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床~250r/min過夜培養(yǎng)吸取1.5ml菌液，12000g離心2鐘，收集菌體，倒掉上清；再次吸取1.5ml菌液收集菌體，盡量將菌液倒干凈；加入300l溶液I振蕩打勻，重新懸浮細胞，震蕩混勻（注意：應(yīng)徹底打勻沉淀或碎塊）；加入300l溶液II，輕柔顛倒混勻，放置至清亮，一般不超過5分鐘（最好不超過2分鐘）；

加入300l溶液III顛倒混勻，放置于冰上10分鐘，使雜質(zhì)充分沉淀；氨芐青霉素（ampicillin）：其主要是通過阻礙細胞壁的合成最終導(dǎo)致細胞的裂解。氨芐青霉素抗性基因（ampr）：合成β-內(nèi)酰胺酶，在氨芐青霉素進入細胞之前將其水解(使用濃度100μg/ml)卡那霉素（Kanamycinsulfate）

：核糖體結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)的合成（使用濃度：50μg/ml)RNaseA:

C或U的3’－P與相鄰的5’－OH處切開RNA。配制：一般以10mg/ml溶于TE中，然后在沸水中煮15分鐘，分裝成小份儲存于－20℃。試驗中用到的抗生素和酶DNA純度：吸光值檢測：檢測260nm、280nm吸光值，紫外分光光度計A260/A280=1.8－1.9；1.8最佳，低于1.8說明有蛋白質(zhì)，大于1.8說明有RNA。質(zhì)量檢測：瓊脂糖凝膠電泳：一般有一至三條帶（超螺旋、線型、開環(huán)三種構(gòu)型），點樣孔附近無DNA帶（無染色體DNA污染）。質(zhì)粒DNA質(zhì)量檢測DNA的瓊脂糖凝膠電泳

帶電荷的物質(zhì)在電場中的趨向運動稱為電泳。電泳的種類多，應(yīng)用非常廣泛，它已成為分子生物學(xué)技術(shù)中分離生物大分子的重要手段。瓊脂糖凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點，已成為分離和鑒定核酸的常用方法。

影響DNA遷移速率的因素

DNA分子大?。哼w移速率U與logN成反比（N為堿基對數(shù)目）。分子大小相等，電荷基本相等（DNA結(jié)構(gòu)重復(fù)性）。分子越大，遷移越慢。瓊脂糖濃度：logU=logU0-Kr

膠濃度，U為遷移率，U0

為DNA的自由電泳遷移率，為膠濃度，Kr為介質(zhì)阻滯系數(shù)。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNAAgarose： 0.5%：1-30kb； 0.7%：0.8-12kb1.2%：0.4-7kb；1.5%：0.2-3kb.DNA構(gòu)象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀>線狀DNA>開環(huán)；當條件變化時，情況會相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強度、離子強度及EB含量有關(guān)。所加電壓：低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過5V/cm堿基組成與溫度：4-30℃一般影響不大嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率，(不提倡加在電泳液中)電泳緩沖液的組成及其離子強度：影響DNA的遷移率，無離子存在時，核酸基本不泳動，離子強度過大產(chǎn)熱厲害，熔化凝膠并導(dǎo)致DNA變性，一般采用1×TAE，0.5×或1×TBE，1×TPE（均含EDTApH8.0）實驗步驟：將洗凈、干燥的制膠板放入制膠槽中，水平放置在工作臺上；配制0.8%的瓊脂糖凝膠：稱取0.24g瓊脂糖于30ml0.5×TBE中，在微波爐中使瓊脂糖顆粒完全溶解，冷卻至溫?zé)釙r倒膠；凝膠凝固后，小心拔去梳子電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍（bromophenolblue,Bb）呈藍紫色；二甲苯晴（xylenecyanol,Xc）呈藍色，它攜帶的電荷量比溴酚藍少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍慢。

1.含甘油或蔗糖，利于DNA樣品沉入點樣孔中2.含有電泳指示劑，以指示電泳的進程上樣緩沖液：EB：溴化乙錠，可嵌入DNA分子中，受紫外光激發(fā)而發(fā)出熒光，利用它可檢測DNA。是誘變劑，可引起插入突變，并有中度毒性，操作時應(yīng)注意防護。操作時應(yīng)戴手套，盡量減少臺面污染。1000×貯存液(0.5mg/mL)，使用時按1：1000稀釋配制染色液。質(zhì)粒電泳檢測：一般有一至三條帶（質(zhì)粒DNA的三種構(gòu)型）超螺旋線型開環(huán)質(zhì)粒電泳檢測本科生試驗圖片質(zhì)粒載體的抽提，外源DNA的準備瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量亞克隆載體與外源DNA的限制性內(nèi)切酶消化(目的片段的回收，亞克隆載體的去磷酸化)載體與外源DNA的連接感受態(tài)細胞的制備連接子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞重組子的轉(zhuǎn)化及篩選、鑒定利用質(zhì)?？寺⊥庠碊NA片段的主要步驟外源DNA克隆的要求特點不同的突出端用兩種限制酶消化后需純化質(zhì)粒以提高連接效率一般酶切位點可保留,非重組克隆背景低不需CIP處理外源DNA只以一個方向插入重組質(zhì)粒中相同的突出端線狀質(zhì)粒DNA常需用磷酸酶（CIP）處理一般酶切位點?？杀Ａ敉庠碊NA會以兩個方向插入重組質(zhì)?？蓭в型庠碊NA的串聯(lián)拷貝末端為平端要求較高的DNA及連接酶不同酶切的平頭可連接非重組克隆的背景高質(zhì)粒及外源DNA連接處的酶切位點消失（不同平端酶）重組質(zhì)粒可能帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝載體及外源片段的限制酶消化:限制性內(nèi)切酶切出相互匹配的粘性末端（一種酶）或不相匹配的粘性末端（不同酶消化）或平端；載體的去磷酸化:堿性磷酸酶去除載體的5’－P基團，以防載體自連；線狀載體與外源片段的連接:連接酶使雙鏈DNA5’－P與相鄰的3’－OH之間形成新的共價鍵，若質(zhì)粒載體的兩條鏈都帶有5’磷酸基團，則可形成4個新的磷酸二酯鍵，但如質(zhì)粒已去磷酸化，則只能形成2個新的磷酸二酯鍵，且產(chǎn)生的兩個雜交分子帶有2個單鏈切口，當雜合體導(dǎo)入到感受態(tài)細胞后可被修復(fù)。限制性內(nèi)切酶堿性磷酸酶連接酶幾種工具酶有特定的識別序列，通常為4－6堿基的回文對稱序列。切割位點位于識別序列內(nèi)的固定位置上，切割后在5’末端有磷酸基團，3’末端有羥基。切割后形成粘性末端或平末端，前者又分為3’突出端（如PstI）和5’突出端(如EcoRI)兩種其活性發(fā)揮只需Mg2＋作輔酶。II類限制性內(nèi)切酶的特點限制酶的一個活性單位（1U）：原則上指在50μl反應(yīng)體系中，37℃下，經(jīng)過1小時的反應(yīng)將1μg的DNA完全分解所需要的酶量。限制酶的star活性：限制酶在極端非標準條件下使用時對底物DNA的特異性可能降低，即可將與原來識別的特定DNA序列不同的堿基序列切斷，這種現(xiàn)象叫限制酶的star活性。它的出現(xiàn)的頻率與酶、底物及反應(yīng)條件有關(guān)。高濃度的甘油（>5％）；酶過量（>100U/ug）；低離子強度（<25mM）；高pH(>pH8.0)；有機溶劑（DMSO，乙醇，乙二醇，二甲基乙酰胺；用其他二價陽離子代替Mg2+(Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+)不同的酶對上述因素的敏感程度不同引起星星活性的主要因素：氯化鎂、氯化鈉/鉀、Tris鹽酸鹽、β－巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）牛血清白蛋白（BSA）典型的限制性內(nèi)切酶作用的緩沖體系成分包括：BamHI：

G▼GATTC CCTAA▲GKpnI: GGTAC▼C C▲CATGG含外源DNA片段的載體(M812)（50l反應(yīng)體系，用1.5mltube，冰上操作）

質(zhì)粒DNA

30lBamHI(10u/μl) 1lKpnI(10u/μl)

1l

10×buffer 5lddH2O 13l分別取5l酶切產(chǎn)物用0.8％－1.2%凝膠檢測酶切效果

50

lTotal目的載體（Puc19)的限制性內(nèi)切酶消化電泳檢測MarkerpUC19質(zhì)粒對照pUC19質(zhì)粒酶切產(chǎn)物M812質(zhì)粒對照M812質(zhì)粒酶切產(chǎn)物點樣順序：2011本科生酶切圖片

lane1-4,pUC19酶切產(chǎn)物L(fēng)ane5,pUC19質(zhì)粒Lane6，M812質(zhì)粒Lane7-10,M812酶切產(chǎn)物L(fēng)ane11,DL-2000

marker,1

11造成DNA酶切不完全的主要原因有：DNA不干凈，反應(yīng)體系中存在酶的抑制劑；操作不當，酶或DNA加至管壁上，反應(yīng)體系沒完全混合；反應(yīng)條件不合適，用錯了緩沖液或溫度不合適；酶的活力不夠DNA樣品中抑制酶活的污染物主要有：DNA樣品中的蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高濃度的鹽等均能抑制酶切活性解決辦法：增加酶作用的單位數(shù)（10-20U/μgDNA)增大反應(yīng)體積以稀釋可能的抑制劑延長反應(yīng)時間消化基因組DNA時，加入終濃度1-2.5mmol/L多聚陽離子亞精胺可改善酶切效果，其作用是結(jié)合帶負電荷的污染物。純化DNA酶切反應(yīng)的終止加入終農(nóng)度為12.5mmol/L的EDTA以鰲合鎂離子而終止酶的反應(yīng)多數(shù)酶在65°C10分鐘可被不可逆滅活，少數(shù)65°C不失活的酶在75°C15分鐘也能失活若酶對熱具完全抗性，可通過酚抽提乙醇沉淀來純化pUC19酶切產(chǎn)物的純化：加入ddH2O150l（擴大體積），加入200μl氯仿/異戊醇（24:1），顛倒混勻后離心10min；

吸出上清，加1/10體積3MNaAc和兩倍體積乙醇，-20℃放置15分鐘以上；12000rpm4℃冷凍離心15分鐘；倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，風(fēng)干后溶于10lddH2O；

氯仿對眼睛、皮膚、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌劑并可損傷肝臟和腎臟，操作時需戴手套、安全鏡并在通風(fēng)櫥中進行。苯酚是強腐蝕劑，能引起嚴重?zé)齻２僮鲿r應(yīng)戴手套、安全鏡、穿防護服，并在通風(fēng)櫥中進行。注意當一個體系中有多種DNA分子，而我們只需要其中的某種DNA時或者反應(yīng)體系中含有目的DNA子以外的其它分子如各種工具酶、dNTPs、引物及礦物油等時，可以利用凝膠電泳分離各種DNA，然后挖膠回收目的DNA帶?；厥辗椒ㄖ饕校?/p>

1.低熔點瓊脂糖

2.透析帶電洗脫法

3.glassmilk純化

4.柱回收試劑盒DNA的回收純化：柱式DNA膠回收試劑盒操作步驟：1.通過瓊脂糖凝膠將目的DNA帶與載體帶分開；2.紫外燈下用干凈的刀片切下含目的DNA帶的膠塊放入1.5ml離心管中；（注意：不含DNA的膠盡可能切除，在長波長的紫外燈下切膠，并盡量縮短DNA暴露在紫外光下的時間）3.按400μl/100mg膠的比例加入BindingBufferII,50-60oC水浴中10分鐘，使膠融化，每2-3分鐘混勻一次；（注意若膠的濃度較大需增加BindingBufferII的比例、增加融膠的時間，若膠塊體積較大也需增加融膠的時間）4.將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到套放在2ml收集管內(nèi)的UNIQ-10柱中，放置2分鐘，8000rpm離心1分鐘；5.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管內(nèi)的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個收集管內(nèi)，加入500μlWashSolution,8000rpm室溫離心1分鐘；6.重復(fù)5步一次，7.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管內(nèi)的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個收集管內(nèi)，12000rpm室溫離心15秒；8.將UNIQ-10柱放入一個新的1.5ml離心管內(nèi)，在柱子膜中央加40μlElutionBuffer或水（pH>7.0），室溫或37oC放置2分鐘；（提高洗脫溫度到55oC-80oC有利于提高DNA的洗脫效率）9.12000rpm室溫離心1分鐘，離心管中的溶液即為回收的DNA片段注意1.首次使用前，必須在WashSolution中加入4倍體積的無水乙醇，充分搖勻后使用，每次使用后將瓶蓋擰緊，以保持WashSolution中的乙醇含量。2.ElutionBuffer為2.0mmol/LTris-HCl,pH8.5.4oC保存。也可用PH8.0的TE或PH≥7.0的水代替。載體去磷酸化細菌堿性磷酸酶（BAP）,牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）以及小蝦堿性磷酸酶（SAP）都能催化磷酸單脂鍵的水解（包括DNA、RNA、dNTP和NTP上的5’－磷酸殘基），不能催化磷酸三脂的水解。比較而言，CIAP的活性比BAP的高10－20倍,CIAP經(jīng)加熱處理，容易失活但不能完全失活,若要使酶完全失活，不論是BAP還是CIAP還需要經(jīng)苯酚處理。而SAP經(jīng)65?C加熱15分鐘就可完全失活?；钚远x：在37?C、pH9.8的條件下，1分鐘內(nèi)水解對硝基苯磷酸鹽（ρ-nitrophenylphosphate)生成1μM的對硝基苯(ρ-nitrophenol)所需的酶量定義為1個活性單位（U）.堿性磷酸酶載體去磷酸化反應(yīng)體系：DNA 20lCIAP（TaKaRa） 0.5l10buffer 4.0lddH2O 15.5l37℃

或50℃反應(yīng)30min以上

Total40l去磷酸化載體的純化加0.4l0.5M的EDTA（終濃度5mM)，75℃水浴10min,使CIAP失活；加入ddH2O150l（擴大體積），加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1），顛倒混勻后離心10min；

吸出上清，加1/10體積3MNaAc和兩倍體積乙醇，-20℃放置15分鐘以上；12000rpm4℃冷凍離心15分鐘；倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，風(fēng)干后溶于10lddH2O（0.5mltube中）載體與外源DNA片段的連接連接酶使雙鏈DNA5’－P與相鄰的3’－OH之間形成新的共價鍵，若質(zhì)粒載體的兩條鏈都帶有5’磷酸基團，則可形成4個新的磷酸二酯鍵，但如質(zhì)粒已去磷酸化，則只能形成2個新的磷酸二酯鍵，且產(chǎn)生的兩個雜交分子帶有2個單鏈切口，當雜合體導(dǎo)入到感受態(tài)細胞后可被修復(fù)。大腸桿菌連接酶T4噬菌體連接酶。連接酶各種連接酶特性的比較：T4DNALigase

E.coliDNALigaseT4RNALigaseLigasesofthermophilicbacteria最適pH輔酶7.2-7.8ATP7.5-8.0NAD7.2-8.4ATPNAD平滑末端可能*不能NODNA5’P末端和RNA3’OH末端可能可能不能NORNA5’P末端和DNA3’OH末端可能不能不能NORNA和RNA少數(shù)可能不能可能NO外源DNA 4l目的載體DNA 4l10buffer 1lT4ligase(1U/l) 1l

連接反應(yīng)體系：16oC水浴保溫過夜Total10l感受態(tài)細胞的制備及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)?；蛞运鼮檩d體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細菌的過程。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中，實現(xiàn)重組克隆的增殖，便于后續(xù)分子操作?？梢圆捎枚喾N方法篩選和鑒定目的克隆。

感受態(tài)細胞的制備體外連接的DNA重組分子導(dǎo)入合適的受體細胞才能大量增殖。為了提高受體菌攝取外源DNA的能力，提高轉(zhuǎn)化效率以獲得更多的轉(zhuǎn)化子，人們摸索出了不同的方法處理細菌，使其處于感受態(tài)。目前主要采用電轉(zhuǎn)化法和CaCl2法將外源DNA導(dǎo)入受體細胞中，因此需要相應(yīng)地制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞和CaCl2感受態(tài)細胞。將外源DNA導(dǎo)入大腸桿菌主要有兩種方法：CaCl2法：利用冰冷的CaCl2處理對數(shù)生長期的細胞，可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生短暫的“感受態(tài)”，易于攝取外源DNA。106～107轉(zhuǎn)化子/gDNA。電轉(zhuǎn)化法：利用瞬間高壓在細胞上打孔。因而需用冰冷的超純水多次洗滌處于對數(shù)生長前期的細胞，以使細胞懸浮液中應(yīng)含有盡量少的導(dǎo)電離子。109～1010轉(zhuǎn)化子/gDNA；所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進行；所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細菌的轉(zhuǎn)化效率。操作注意事項前夜接種受體菌（DH5），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜（約16小時）；取1ml過夜培養(yǎng)物于100ml添加有20mMMgCl2的LB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時（300rpm）；將0.1MCaCl2溶液置于冰上預(yù)冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；CaCl2感受態(tài)細胞的制備（一）4℃下4000rpm冷凍離心10分鐘；棄去上清，加入100l預(yù)冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；4℃下4000rpm冷凍離心10分鐘；棄去上清，加入100l預(yù)冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮，4℃下4000rpm冷凍離心10分鐘；棄去上清，加入20l預(yù)冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸??；細胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實驗,48小時內(nèi)使用，可以暫時保存在4℃.長時間保存，需添加冷凍保護劑（15%～20%甘油）后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ǎ?0℃）。CaCl2感受態(tài)細胞的制備（二）操作注意事項

密切注視細菌的生長狀態(tài)和密度，盡量使用對數(shù)生長期的細胞（一般通過檢測OD600來控制。DH5菌株OD600為0.5時細胞密度是5×107/ml）；所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進行；所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細菌的轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化步驟

制備選擇性培養(yǎng)基平板：在融化的250mlLA培養(yǎng)基中250lAmp，250lX-gal，25lIPTG，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中；取出3管制備好的感受態(tài)細胞，放在冰上融化；3管感受態(tài)細胞分別加DNA連接產(chǎn)物、標準超螺旋質(zhì)粒DNA（陽性對照）及不加入任何DNA（陰性對照），用移液器輕輕吸打均勻，在冰上放置30分鐘；熱擊：將離心管放置42℃水浴，熱擊90秒，注意：勿搖動離心管；冰鎮(zhèn)：快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴，放置1－2分鐘；復(fù)蘇：每管加400lSOC培養(yǎng)基，在37℃搖床溫和搖動溫育45分鐘，使細菌復(fù)蘇；布皿：取適當體積均勻涂布于含有IPTG、X-gal、抗生素（Amp）的LA平板；培養(yǎng)：倒置培養(yǎng)皿，于37℃培養(yǎng)12－16小時

即可觀察到藍白相間的菌落（其中白色菌落為含有外源插入片段的轉(zhuǎn)化子，藍色菌落是載體自連的轉(zhuǎn)化子）注意：利用氨芐青霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子時，轉(zhuǎn)化細胞鋪平板的密度要低（90mm平板上不得超過105個菌落），同時37℃培養(yǎng)不應(yīng)超過20小時，具氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化體可將－內(nèi)酰胺酶分泌到培養(yǎng)基中，迅速滅活菌落周圍的抗生素，從而導(dǎo)致對氨芐青霉素敏感的衛(wèi)星菌落的出現(xiàn)。電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備（一）前夜接種受體菌（DH5），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜（約16小時）；取1ml過夜培養(yǎng)物于100mlLB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時（300rpm）；將菌液迅速置于冰上，同時10%的甘油置于冰上預(yù)冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；4℃下3000g低溫離心5-10分鐘；電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備（二）棄去上清，加入1500l預(yù)冷的10％的甘油，用移液器輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮；4℃下3000g低溫離心5-10分鐘；棄去上清，加入750l預(yù)冷預(yù)冷的10％的甘油，用移液器輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸??；4℃下3000g低溫離心5-10分鐘；棄去上清，加入20l預(yù)冷預(yù)冷的10％的甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ǎ?0℃）。使用的培養(yǎng)基最好用NaCl減半的LB培養(yǎng)基；密切注視細菌的生長狀態(tài)和密度，盡量使用對數(shù)生長期的細胞（一般通過檢測OD600來控制。DH5菌株OD600為0.5時細胞密度是5×107/ml）；制備感受態(tài)細胞及配制試劑所用的水應(yīng)達到18MΩ,即使用超純水；化學(xué)試劑應(yīng)是分子生物學(xué)級；所使用的槍頭和器皿都應(yīng)是新的，干凈無菌的；無菌操作；低溫（冰上）進行。操作注意事項——特別控制鹽離子的殘留影響電轉(zhuǎn)化效率的因素細胞的生長狀