細(xì)胞工程nn課件

細(xì)胞工程

CELLENGINEERING——改造和培養(yǎng)細(xì)胞、組織、器官、個(gè)體的工程劉廣發(fā)1《細(xì)胞工程》主要內(nèi)容（1）細(xì)胞工程的基礎(chǔ)知識(shí)與基本技術(shù)；植物組織培養(yǎng)；懸浮細(xì)胞培養(yǎng)和次生代謝物生產(chǎn)；花藥及單倍體植株培養(yǎng)；原生質(zhì)體制備與細(xì)胞融合；人工種子制備；植物脫病毒技術(shù)；2《細(xì)胞工程》主要內(nèi)容（2）動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞融合細(xì)胞重構(gòu)與動(dòng)物克隆淋巴細(xì)胞雜交瘤與單克隆抗體染色體轉(zhuǎn)移與基因轉(zhuǎn)移人類干細(xì)胞研究原核細(xì)胞的原生質(zhì)體融合真菌細(xì)胞的原生質(zhì)體融合3參考文獻(xiàn)自編.細(xì)胞工程講義羅立新等.細(xì)胞工程.華南理工大學(xué)出版社，2003李志勇編著.細(xì)胞工程.科學(xué)出版社，20034探究式自主學(xué)習(xí)計(jì)劃自愿組成學(xué)習(xí)小組，3人左右，選出組長(zhǎng)；每組選一個(gè)主題，時(shí)間約10min；各組需準(zhǔn)備PowerPoint;各組最高可得8分；其他同學(xué)可提問、補(bǔ)充或更正；教師講評(píng)和討論；5探究式自主學(xué)習(xí)安排（2）順序課題學(xué)習(xí)小組8動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)9動(dòng)物細(xì)胞融合10細(xì)胞重構(gòu)與動(dòng)物克隆11染色體轉(zhuǎn)移與基因轉(zhuǎn)移12人工種子制備13原生質(zhì)體制備與細(xì)胞融合（植物）14原核細(xì)胞的原生質(zhì)體融合15真菌細(xì)胞的原生質(zhì)體融合7細(xì)胞工程的三個(gè)層次細(xì)胞水平：細(xì)胞培養(yǎng),細(xì)胞融合，整株培養(yǎng)；細(xì)胞器水平：細(xì)胞核，染色體，各細(xì)胞器；基因水平：基因轉(zhuǎn)化；8第一章細(xì)胞工程發(fā)展簡(jiǎn)史

一.植物細(xì)胞工程1902德國(guó)植物學(xué)家Harberlandt預(yù)言植物細(xì)胞具全能性；1904德國(guó)胚胎學(xué)家Hanning成功培養(yǎng)蘿卜胚并長(zhǎng)成植株；1922Robbins以豌豆等的莖尖在培養(yǎng)基上形成缺綠的葉和根；1930-34李繼侗發(fā)現(xiàn)銀杏胚乳提取物能促進(jìn)銀杏胚正常生長(zhǎng)；1934美國(guó)White成功培養(yǎng)番茄離體根，發(fā)現(xiàn)愈靠根尖病毒愈少；10植物細(xì)胞工程1935-36中國(guó)羅宗洛父子發(fā)現(xiàn)嫩桑葉可促進(jìn)玉米離體根生長(zhǎng)；1937美國(guó)White發(fā)現(xiàn)VitB促進(jìn)離體根生長(zhǎng)，指出IAA能調(diào)控生長(zhǎng)；1937美國(guó)Michel首創(chuàng)用0.5MNaNO3融合兩個(gè)植物細(xì)胞原生質(zhì)體；1941Overbeek以椰子乳加入培養(yǎng)基，成功培養(yǎng)曼佗羅幼胚；？Skoog和崔澄發(fā)現(xiàn)腺嘌呤等能誘導(dǎo)芽生成，指出腺嘌呤與生長(zhǎng)素之比，比例高則生芽，比例低則生根；11植物細(xì)胞工程1956Miller發(fā)現(xiàn)激動(dòng)素，證明其促芽能力是腺嘌呤的三萬倍；1958Steward進(jìn)行胡蘿卜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，還長(zhǎng)成胚狀體和植株；1953Muir成功對(duì)煙草細(xì)胞進(jìn)行懸浮液體培養(yǎng)；1960英國(guó)Cocking用纖維素酶制備番茄根細(xì)胞原生質(zhì)體；1964印度Maheshwari以花藥培養(yǎng)出單倍體組織；1968Reinhard用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)出哈爾堿；12二.動(dòng)物細(xì)胞工程1885Wilhelm取出雞胚髓板，在鹽水中存活數(shù)天；1903Jolly將蠑螈的白細(xì)胞在懸滴中保存1個(gè)月；1907美國(guó)Harrison培養(yǎng)的蛙神經(jīng)存活數(shù)周，且長(zhǎng)出軸突；1914Tomson創(chuàng)立能在培養(yǎng)基中維持器官小塊的方法；？Carrel發(fā)現(xiàn)雞胚浸出液明顯促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，使雞胚心臟細(xì)胞傳代3400次，生存34年，可無限生長(zhǎng)；14動(dòng)物細(xì)胞工程1940Earle建立可無限傳代的小鼠結(jié)締組織L系；1951Gay建立第一個(gè)永生人宮頸癌Hela細(xì)胞系；1958岡田善雄用滅活仙臺(tái)病毒誘發(fā)腹水瘤細(xì)胞融合；1960s童第周和牛滿江進(jìn)行魚和蛙的核移植，獲核質(zhì)雜種魚；15第二章細(xì)胞工程的基礎(chǔ)知識(shí)與基本技術(shù)基礎(chǔ)知識(shí)

1.原核細(xì)胞：DNA裸露，生長(zhǎng)迅速，易于操作；但具細(xì)胞壁，表達(dá)真核基因受一定限制。

2.真核細(xì)胞：接近人類需要，但具細(xì)胞周期，要同步化培養(yǎng)；生長(zhǎng)慢，植物細(xì)胞和真菌細(xì)胞具細(xì)胞壁。17二.基本操作無菌操作概念與技術(shù)無菌室布局、衛(wèi)生、消毒、超凈臺(tái)18基本操作2.細(xì)胞培養(yǎng)取樣滅菌培養(yǎng)傳代收獲除菌取樣3.細(xì)胞融合原生質(zhì)體融合篩選4.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞（個(gè)體）19第三章植物細(xì)胞工程植物組織培養(yǎng)；懸浮細(xì)胞培養(yǎng)和次生代謝物生產(chǎn)；花藥及單倍體植株培養(yǎng)；原生質(zhì)體制備與細(xì)胞融合；人工種子制備；植物脫病毒技術(shù)；主要內(nèi)容：20第一節(jié)植物組織培養(yǎng)

在無菌和人工控制營(yíng)養(yǎng)及環(huán)境條件下研究植物的細(xì)胞、組織和器官以及控制其生長(zhǎng)、發(fā)育的技術(shù)。

全世界通過植物細(xì)胞培養(yǎng)再生成植株已超過600種，已使許多具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的果樹、藥材、蔬菜和花卉等實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn)。21植物組織培養(yǎng)過程離體的植物器官、組織、細(xì)胞脫分化愈傷組織再分化芽根植物體培養(yǎng)22配MS培養(yǎng)基1.基本組分：mg/L

蔗糖3%,KNO31900,NH4NO31650,CaCl2440,MgSO4370,KH2PO4170,2.微量無機(jī)物：Na2?EDTA37.3,FeSO427.8,MnSO422.3,ZnSO48.6,H3BO36.2,KI0.83,Na2MoO40.25,CoCl20.025,CuSO40.0253.微量有機(jī)物：mg/L

肌醇100，腺嘌呤5，甘氨酸2，煙酸0.5,吡咯醇0.5，硫胺素0.1，生物素0.01，

激動(dòng)素(KT)0.04—10吲哚乙酸（IAA）1—304.Agar10g/L預(yù)備階段（1）246-芐基腺嘌呤（6-BA）：先加少量0.1mol/L的NaOH和蒸餾水稍加熱使其溶解；萘乙酸（NAA）：先用少量95%乙醇和少量0.1mol/L的NaOH溶解；25預(yù)備階段（2）選擇合適的外植體外植體大小要適宜；外植體的部位影響其分化能力和器官分化的類型；外植體的年齡影響其分化率；同一植物不同部位的分化需不同的生長(zhǎng)素/激動(dòng)素比例；不同物種的相同部位外植體分化能力不一樣；27預(yù)備階段（3）除菌

自來水多次漂洗消毒劑處理無菌水反復(fù)沖洗外植體

無菌濾紙吸干切割

無菌外植體若干塊無菌外植體置培養(yǎng)基上28常用消毒劑的使用和效果

消毒劑使用濃度/%清除消毒時(shí)間/min滅菌效果次氯酸鈉2容易5~30很好次氯酸鈣9~10容易5~30很好漂白粉飽和溶液容易5~30很好升汞0.1~1較難2~10最好酒精70~75容易0.2~2好過氧化氫10~12最容易5~15好溴水1~2容易2~10很好硝酸銀1較難5~30好抗生素4~50mg/L中等30~60較好29植物不同器官的消毒和處理種子

純酒精浸10min，無菌水洗凈，次氯酸鈣（10％）浸20～30min，無菌水洗3～5次，無菌濾紙吸干；；果實(shí)

純酒精迅速漂洗，次氯酸鈉（2％）浸10min，無菌水反復(fù)沖洗，剝除種子和內(nèi)部組織；莖切段

自來水洗凈，純酒精漂洗，次氯酸鈉（2％）浸15～20min，無菌水洗3次，無菌濾紙吸干；葉片

自來水洗凈，純酒精漂洗，升汞（0.1％）浸1min，或次氯酸鈉（2％）浸15～20min，無菌水反復(fù)沖洗，無菌濾紙吸干；

30誘導(dǎo)去分化形成愈傷組織添加較高濃度的生長(zhǎng)素；固體培養(yǎng)；液體培養(yǎng)；光照培養(yǎng)；黑暗培養(yǎng)；31形成愈傷組織所需的激素只需生長(zhǎng)素類激素，如菊芋的塊莖；只需細(xì)胞分裂素激素，如蕪菁根；需上述兩類激素，但有不同比例，多數(shù)植物；還需復(fù)雜的天然提取物（椰子乳）等；32生長(zhǎng)素類激素吲哚乙酸（IAA）,常用1～10mg/L;吲哚丁酸（IBA）,常用1～5mg/L；2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），常用10-5～10-7mol/L;萘乙酸（NAA），常用1.0mg/L；33細(xì)胞分裂素類激素激動(dòng)素（KT）6-芐氨基嘌呤（6-BA）玉米素先加少量堿液預(yù)溶34繼代增殖階段移植擴(kuò)增；分割繼代；35光照培養(yǎng)室36生根長(zhǎng)芽階段生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)與分化具有協(xié)同作用，它們的量以及比例的不同配合，對(duì)細(xì)胞分化起著重要的作用；外植體本身內(nèi)源激素水平的差異，導(dǎo)致它們分化時(shí)對(duì)培養(yǎng)基中所添加的這兩種激素量及其比例反應(yīng)不盡相同；37長(zhǎng)芽生根階段38移栽成活階段保濕是關(guān)鍵；避免強(qiáng)光直射；溫度適宜；39植物組培的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：ABCD缺點(diǎn)：ABC40手指玫瑰41第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)和次生代謝物生產(chǎn)本方法的歷史、現(xiàn)狀1956年，Routier&Nickell首先提出把植物細(xì)胞當(dāng)作工業(yè)合成天然產(chǎn)物的途徑；1968年，Reinhard,Corduan&Volks經(jīng)培養(yǎng)生產(chǎn)出“哈爾堿”（harmine);1972年，F(xiàn)uruya&Ishii經(jīng)培養(yǎng)生產(chǎn)出“維斯納精”（Visnagin);1981年，F(xiàn)ujita等經(jīng)培養(yǎng)生產(chǎn)出“紫草素”；1991年，我國(guó)培養(yǎng)紅豆杉細(xì)胞生產(chǎn)“紫杉醇”，達(dá)到60mg/L；目前世界最大的細(xì)胞培養(yǎng)罐達(dá)20t；42紅豆杉合成的紫杉醇是著名的抗癌藥物43細(xì)胞培養(yǎng)和原植物的天然產(chǎn)物量的比較

產(chǎn)量

物種

天然產(chǎn)物細(xì)胞培養(yǎng)原植物橘葉雞眼藤

蒽醌900微克/克干重

110微克/克干重決明蒽醌鮮重的0.334%

種子干重的0.21%長(zhǎng)春花

蛇根堿干重的1.3%

干重的0.26%三角葉薯蕷

薯蕷皂苷26mg/克干重

20mg/克干塊根人參

人參皂角苷鮮重的0.38%

鮮重的0.3~3.3%煙草

煙堿干重的3.4%

干重的2~5%煙草

泛醌0.5mg/克干重

16mg/克干葉大紅罌粟

蒂巴因130mg/克干重

140mg/克干葉44從植物培養(yǎng)細(xì)胞中獲得的各類物質(zhì)氨基酸核酸蛋白質(zhì)碳水化合物脂類維生素有機(jī)酸抗白血病藥抗腫瘤藥抗病毒藥抗微生物藥酶抑制劑色素香料甜味劑鴉片殺蟲劑激素強(qiáng)心苷核苷酸橡膠阿司匹林奎寧可卡因第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)和次生代謝物生產(chǎn)45培養(yǎng)植物細(xì)胞制造疫苗2006年2月，美國(guó)Dow

AgroSciences公司完成了世界上第一個(gè)注冊(cè)的植物制造疫苗；將病原菌抗原決定基因轉(zhuǎn)入植物基因組中，利用植物細(xì)胞而不是整株植物在一個(gè)安全的室內(nèi)環(huán)境中生產(chǎn)疫苗，以激活人體的免疫能力。在制造過程中完全不含有任何動(dòng)物成份。

46第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)和次生代謝物生產(chǎn)懸浮培養(yǎng)

1.成批培養(yǎng)（封閉式培養(yǎng)）優(yōu)點(diǎn)：易于操作；次生代謝物含量高；缺點(diǎn)：效率低；2.半連續(xù)和連續(xù)培養(yǎng)47第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)和次生代謝物生產(chǎn)固定化細(xì)胞培養(yǎng)

次生代謝物的積累和細(xì)胞分化具有正相關(guān)性；細(xì)胞固定化有利于組織化的形成；細(xì)胞固定化有利于在細(xì)胞團(tuán)間和細(xì)胞團(tuán)內(nèi)形成化學(xué)物質(zhì)和各種物理因素的梯度，這是高產(chǎn)次生代謝物的關(guān)鍵；細(xì)胞固定化有利于對(duì)外環(huán)境參數(shù)進(jìn)行調(diào)控；細(xì)胞固定化有利于回收次生代謝物；48第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)和次生代謝物生產(chǎn)平床培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：制作簡(jiǎn)單；能生產(chǎn)較多次生代謝物；缺點(diǎn)：占地面積大；分化區(qū)比例較小；02供應(yīng)受限；49包埋法固定細(xì)胞

將細(xì)胞包埋在凝膠載體的微小空格內(nèi)或包埋于半透性聚合物的超濾膜內(nèi)，它又分為凝膠包埋法和微膠囊法。⑴凝膠包埋法固定化（gelimmobilization)

①海藻酸鹽（alginate)β-角叉膠（β-carrageenan)瓊脂糖（agarose)瓊脂（agar)聚丙烯酰胺（polyacrylamide)殼聚糖（chitosan)白明膠（gelatin)50微膠囊法

微膠囊法是利用天然的或合成的高分子材料作為微囊壁材，包裹成微小球囊，培養(yǎng)基成分和代謝產(chǎn)物等小分子物質(zhì)可以通過，細(xì)胞不能通過，使囊內(nèi)成為一個(gè)微小環(huán)境。51第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)和次生代謝物生產(chǎn)立柱培養(yǎng)系統(tǒng)

1.細(xì)胞固定化瓊脂固定細(xì)胞52褐藻酸鈣固定細(xì)胞無菌大量培養(yǎng)植物細(xì)胞

等量混合→注入尼龍網(wǎng)→配制4%褐藻酸鈉，滅菌氯化鈣溶液（2%）浸浴褐藻酸鈣固定的細(xì)胞團(tuán)

第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)和次生代謝物生產(chǎn)53第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)和次生代謝物生產(chǎn)立柱培養(yǎng)系統(tǒng)

優(yōu)點(diǎn)：占地面積小次生代謝物產(chǎn)量高缺點(diǎn)：制作較復(fù)雜O2供應(yīng)受限54立柱培養(yǎng)系統(tǒng)操作要素：取靜止期細(xì)胞，并使細(xì)胞達(dá)到一定密度；控制營(yíng)養(yǎng)液的成分（包括激素）、濃度及O2供應(yīng)；某些種的細(xì)胞培養(yǎng)需光照；盡可能選擇次生代謝物能自然或誘導(dǎo)后從細(xì)胞內(nèi)釋出的植物（品種）；第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)和次生代謝物生產(chǎn)55提高次生代謝物產(chǎn)量的途徑生物種性：

1.選擇高產(chǎn)的品系或細(xì)胞系；目測(cè)法，化學(xué)分析法，外因選擇法；2.誘變篩選高產(chǎn)細(xì)胞系：化學(xué)法，物理法；3.通過細(xì)胞融合或基因工程創(chuàng)造高產(chǎn)細(xì)胞系；第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)和次生代謝物生產(chǎn)56提高次生代謝物產(chǎn)量的途徑培養(yǎng)條件:1.培養(yǎng)基：

A碳源：常用蔗糖，但應(yīng)因種摸索；

B氮源：常用NO3-和NH4+，（或單用或兼用）；

C生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：生長(zhǎng)素及細(xì)胞分類素。兩者的比例對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及次生代謝物生產(chǎn)具極大影響；

D供給目的產(chǎn)物的直接或近直接前體物質(zhì)；

第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)和次生代謝物生產(chǎn)57提高次生代謝物產(chǎn)量的途徑培養(yǎng)條件:2.物理因子：

A光質(zhì)和光量（適量光照）；

B溫度：25~30℃；

C通氣：底部通氣好；

DpH值：5~6第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)和次生代謝物生產(chǎn)58第三節(jié)植物原生質(zhì)體制備與融合原生質(zhì)體（protoplast):去除全部細(xì)胞壁的細(xì)胞；亞原生質(zhì)體（subprotoplast):只含有部分原生質(zhì)的原生質(zhì)體（有核或無核）；微原生質(zhì)體（miniprotoplast):經(jīng)細(xì)胞松弛素B處理得到的僅含少量胞質(zhì)及核或染色體的小原生質(zhì)體；原生質(zhì)球（球狀體，spheroplast):殘存少量細(xì)胞壁的原生質(zhì)體；幾個(gè)名詞：59植物原生質(zhì)體研究的意義有利于進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交；有利于引入生物大分子、細(xì)胞器等；有利于進(jìn)行細(xì)胞操作（核、葉綠體等）；60植物原生質(zhì)體的制備(1)機(jī)械法：高滲處理植物（外植體，愈傷組織，液培細(xì)胞）質(zhì)壁分離機(jī)械切割原生質(zhì)體（亞原生質(zhì)體）缺點(diǎn)：難，少，分生組織不宜；61酶解法1.酶的購置與純化

市售的纖維素酶一般都是復(fù)合酶，含：纖維素酶C1；纖維素酶Cx；纖維二糖酶；果膠酶；

磷脂酶；

核酸酶；

過氧化物酶；酚類；此外，還有蝸牛酶；植物原生質(zhì)體的制備(2)最好應(yīng)純化62酶解法2.取材：干凈，高活性A幼嫩的根、莖、葉；B懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞和體細(xì)胞胚；

無需滅菌，最好同步化；

C花粉母細(xì)胞和四分體；

分生能力強(qiáng)，應(yīng)使用蝸牛酶；植物原生質(zhì)體的制備(3)63外植體除菌：外植體肥皂水洗清水洗酒精（75%，10s）次氯酸鈉（3%，15min）無菌水洗3~4次無菌濾紙吸干

植物原生質(zhì)體的制備(4)64外植體酶解

除菌后葉片撕去下表皮切塊放入反應(yīng)液25～30℃不時(shí)輕搖反應(yīng)液轉(zhuǎn)綠2～4h

植物原生質(zhì)體的制備(5)65外植體酶解緩沖液：pH值5.5~5.8滲透壓穩(wěn)定劑：糖、甘露醇、山梨醇等膜保護(hù)劑：鈣鹽、牛血清蛋白、葡萄糖硫酸鉀（0.3%）表面活性劑：Tween80適當(dāng)時(shí)間適當(dāng)溫度植物原生質(zhì)體的制備(6)66原生質(zhì)體分離

過濾法離心法（低速）漂浮法（不同比重）植物原生質(zhì)體的制備(7)67原生質(zhì)體洗滌

以新的滲透壓穩(wěn)定劑或培養(yǎng)液輕輕洗滌2~4次;植物原生質(zhì)體的制備(8)68原生質(zhì)體鑒定1.直接鏡檢：球形，低滲破裂，熒光增白劑(UV下細(xì)胞壁顯綠色熒光）2.活力測(cè)定：雙醋酸熒光素（FDA）染色法：FDA進(jìn)入細(xì)胞，被脂酶分解產(chǎn)生有熒光的極性熒光素;FDA不能進(jìn)入死細(xì)胞；臺(tái)盼藍(lán)染色：臺(tái)盼藍(lán)不能進(jìn)入活細(xì)胞；胞質(zhì)環(huán)流觀察；植物原生質(zhì)體的制備(9)69植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)基無機(jī)成分:KNO3725;CaCl2·2H2O685;MgSO4560;NH4NO3288;K2HPO468;Na2·EDTA37.3;Fe2SO4·7H2O27.8;H3BO43.0;MnSO4·4H2O10.0;ZnSO4·7H2O2.0;KI0.75;Na2MoO4·2H2O0.25;CoCl2·6H2O0.025;CuSO4·5H2O0.025糖類：(mg/L)

葡萄糖68000；蔗糖250；果糖250；核糖250；木糖250；甘露糖250；甘露醇250；鼠李糖250；山梨醇250；纖維二糖250；維生素：

(mg/L)

維生素C2.0；維生素B11.0；維生素B61.0；氫化膽堿1.0；對(duì)氨基苯甲酸0.02；葉酸0.4；生物素0.01；維生素A0.01；維生素D30.01；維生素B120.01；生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物：

酪蛋白250；肌醇100；椰子汁20ml；NAA1.0；6BA0.5；2,4-D0.2；有機(jī)酸：

檸檬酸40；蘋果酸40；反丁烯二酸20；丙酮酸鈉20；V-KM培養(yǎng)基(mg/L)70植物原生質(zhì)體再生培養(yǎng)方法（1）固體平皿培養(yǎng)法原生質(zhì)體懸液2ml小培養(yǎng)皿MS培養(yǎng)基配制的1.2%agar2ml

（25~28℃，置大皿內(nèi)（預(yù)加濕濾紙）臘帶封口培養(yǎng)100~300lux，12h?d-1)分化培養(yǎng)基

愈傷組織成苗搖勻冷卻71固體平皿培養(yǎng)法

優(yōu)點(diǎn)：便于定點(diǎn)觀察原生質(zhì)體不易破裂

缺點(diǎn)：通氣較差原生質(zhì)體與瓊脂混合不易掌握原生質(zhì)體過于分散植物原生質(zhì)體再生培養(yǎng)方法（1）72液體培養(yǎng)法原生質(zhì)體置液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不時(shí)輕搖，能較快生長(zhǎng)。細(xì)胞團(tuán)形成后應(yīng)移到固體培養(yǎng)基中才能繼續(xù)生長(zhǎng)或誘導(dǎo)分化成苗。缺點(diǎn)：原生質(zhì)體易受損通氣較差操作較麻煩植物原生質(zhì)體再生培養(yǎng)方法（2）73液體淺層培養(yǎng)法（液-固法）營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（0.6%）小皿凝固放置無菌濾紙注入3mL原生質(zhì)體懸浮液放大皿內(nèi)（墊濕濾紙）封口保溫，光照

（或不光照）輕搖愈傷組織分化培養(yǎng)基成苗植物原生質(zhì)體再生培養(yǎng)方法（3）74液體淺層培養(yǎng)法（液-固法）

優(yōu)點(diǎn)：通氣好營(yíng)養(yǎng)均勻生長(zhǎng)較快

缺點(diǎn)：需定期添加培養(yǎng)基不易更換培養(yǎng)基植物原生質(zhì)體再生培養(yǎng)方法（3）75小塊液培法

原生質(zhì)體懸浮液瓊脂糖（0.8%）

切小塊置液體培養(yǎng)基中80~100rpm，25~28℃愈傷組織移放分化培養(yǎng)基成苗植物原生質(zhì)體再生培養(yǎng)方法（4）混勻倒平皿凝固

76小塊液培法

優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：植物原生質(zhì)體再生培養(yǎng)方法（4）77固體活性炭培養(yǎng)基

瓊脂培養(yǎng)基+1%活性炭原生質(zhì)體懸浮液

平皿培養(yǎng)成苗植物原生質(zhì)體再生培養(yǎng)方法（5）混勻凝固優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：78混合培養(yǎng)（液體或固體培養(yǎng)基）

將兩種原生質(zhì)體混合培養(yǎng)

有何意義？植物原生質(zhì)體再生培養(yǎng)方法（6）79植物原生質(zhì)體融合回顧1909Kuster把洋蔥根放在濃硝酸鈣溶液中，見質(zhì)壁分離的亞原生質(zhì)體，復(fù)原時(shí)觀察到亞原生質(zhì)體的融合；1931Plower用針插入原生質(zhì)體，使質(zhì)膜和液泡膜融合；1937Michels觀察到同種和不同種原生質(zhì)體的融合；1960Cocking用真菌纖維素酶獲得大量番茄根的原生質(zhì)體；1970Power用NaNO3使燕麥和玉米的原生質(zhì)體融合；1971Takete首次將煙草原生質(zhì)體再生成完整的植株；1972Carlson首次經(jīng)原生質(zhì)體融合獲得種間雜種煙草；1973Keller提出高pH高鈣法誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合；1974

Kao提出聚乙二醇法誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合；1977Kao把高pH高鈣法與聚乙二醇法相結(jié)合；1978Melchers獲得屬間雜種（番茄╳馬鈴薯）；1979Senda提出電激法融合原生質(zhì)體；1987斯維格將電融合與微培養(yǎng)結(jié)合；80化學(xué)法誘導(dǎo)融合

（無菌操作）按一定比例混合雙親原生質(zhì)體懸液；吸一份混合液于表面皿上，靜置10min；滴加3份聚乙二醇（PEG）溶液，輕輕搖勻；

PEG溶液組成：PEG50%（MW=1560~6000)glucose0.1mol/LCaCl210.5mmol/LKH2PO40.7mmol/L

pH5.5

植物原生質(zhì)體融合（1）81植物原生質(zhì)體融合（2）化學(xué)法誘導(dǎo)融合(續(xù)前）25℃保溫15~45min，不時(shí)輕搖；滴加1份高鈣高pH溶液稀釋，搖勻；

高鈣高pH溶液組成：

glycine50mmol/LCaCl2

50mmol/Lglucose300

mmol/LpH10.510~15min后，再滴加1份高鈣高pH溶液稀釋，搖勻；10~15min后，再加1~2mL原生質(zhì)體培養(yǎng)液，搖勻；用20mL原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗5次，間隔5min；加0.5mL原生質(zhì)體培養(yǎng)液，微滴培養(yǎng)；82物理法誘導(dǎo)融合微電極法兩個(gè)微電極尖端分別與兩個(gè)靠近的原生質(zhì)體表面接觸，用5~12μA的電流刺激1~5毫秒，促成融合。平行電極法相距200μm的微電極插入原生質(zhì)體溶液中，先通入交變電場(chǎng)，使其緊密接觸成串珠狀；再施以適當(dāng)電脈沖，原生質(zhì)體接觸區(qū)發(fā)生可逆擊穿而融合；植物原生質(zhì)體融合（3）83不對(duì)等細(xì)胞融合（滅活一方原生質(zhì)體）植物原生質(zhì)體融合（4）84原生質(zhì)體融合后的產(chǎn)物親和雜種細(xì)胞（難）部分親和的雜種細(xì)胞

含雙方胞質(zhì)及一方核含雙方胞質(zhì)及一方核和少量它方染色體

（細(xì)胞周期短或繼代次數(shù)少的一方，染色體易保留）3.異核質(zhì)雜種（少）4.嵌合植株85融和體的鑒別細(xì)胞鑒別

細(xì)胞大小色素有無細(xì)胞核大小熒光鑒別植株鑒別

形態(tài)特征染色體顯帶同功酶法、過氧化物酶法分子雜交法RFLP法RAPD法86雜種細(xì)胞篩選顯微操作法要有：可識(shí)別標(biāo)志顯微操作儀能培養(yǎng)單個(gè)原生質(zhì)體的培養(yǎng)基遺傳互補(bǔ)法要有具突變標(biāo)記的品種1.白化互補(bǔ)法2.生長(zhǎng)互補(bǔ)法3.抗性互補(bǔ)法4.代謝互補(bǔ)法

87西紅柿與馬鈴薯雜交研究進(jìn)展1971年，Power提出設(shè)想1978年，Melchers用原生質(zhì)體融合法獲得9株雜種株1983年，Shepard亦融合成功亟待解決的問題：

1.哪些基因和條件決定果實(shí)與塊莖的形成2.光合作用產(chǎn)物的運(yùn)輸方向與分配3.光合作用產(chǎn)物是否足以供應(yīng)地上和地下部分的生長(zhǎng)、發(fā)育需要1994年,Schoenmakers繼續(xù)本研究1995年，Wolters還在研究88第四節(jié)單倍體植物的誘發(fā)與利用

一.單倍體植物的特點(diǎn)：株矮，葉、花、果小，生活力弱；高度不育；？89二.單倍體植物的利用：可加快培育新品種；有利于突變體的選擇與利用；？第四節(jié)單倍體植物的誘發(fā)與利用（2）90三.誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體植株的途徑：

(一）自然發(fā)生1.孤雌生殖2.孤雄生殖3.無融合生殖第四節(jié)單倍體植物的誘發(fā)與利用（3）91三.誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體植株的途徑：

(二）人工誘導(dǎo)：1.花藥培養(yǎng)：1.1選取成熟度適中的花蕾或幼穗；1.2花藥預(yù)處理；

1.3選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基與培養(yǎng)條件：

1.3.1只需簡(jiǎn)單培養(yǎng)基；1.3.2培養(yǎng)基尚需添加激素；1.3.3培養(yǎng)基添加脯氨酸、羥脯氨酸、谷氨酰胺；第四節(jié)單倍體植物的誘發(fā)與利用（4）921.4培養(yǎng)條件：

降低氣壓；純N2密閉處理30~60min，或摻入O22.5~5.0%；0.5mol/L甘露醇處理2天；花藥平放；適當(dāng)密植；第四節(jié)單倍體植物的誘發(fā)與利用（5）931.5花藥單倍體植株的形成途徑：

1.5.1生殖細(xì)胞退化，由營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞分裂產(chǎn)生；（常見）1.5.2小孢子細(xì)胞不分化成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞，直接分裂、分化長(zhǎng)成；（常見）

1.5.3營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞都參與愈傷組織和胚的形成；1.5.4僅由生殖細(xì)胞分裂形成；第四節(jié)單倍體植物的誘發(fā)與利用（6）942.離體花粉培養(yǎng)擠壓法分離花粉；自然散開法分離花粉；3.未授粉子房或胚珠的培養(yǎng)4.雜交法獲單倍體植株第四節(jié)單倍體植物的誘發(fā)與利用（7）955.單倍體植物的加倍用秋水仙素（0.2~0.4%）處理24~48h；

加倍方式？第四節(jié)單倍體植物的誘發(fā)與利用（8）96Section5.ResearchesonArtificialSeeds

人工種子的研制（1）人工種子：含有植物胚狀體或芽、營(yíng)養(yǎng)成分、激素以及其它成分的人工膠囊；人工種子的構(gòu)成：胚狀體：由組織培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生；人工胚乳：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)+激素+農(nóng)藥+抗生素

+除草劑等；人工種皮：抗壓，保水，透氣；97Charactersofartificialseeds：不受環(huán)境因素制約,一年四季進(jìn)行工廠化生產(chǎn)；有利于保存該種系的優(yōu)良性狀；成本低，適合于機(jī)械化播種；可添加營(yíng)養(yǎng)物、激素、農(nóng)藥、抗生素、除草劑等，以利胚狀體的健康生長(zhǎng)。

Section5.ResearchesonArtificialSeeds

（2）98Thesynchronousgrowthofembryoid

胚狀體的同步化生長(zhǎng)：低溫法抑制劑法分離法：分離胚性細(xì)胞團(tuán)；通氣法：通入N2或乙烯；滲透壓法？Section5.ResearchesonArtificialSeeds

（3）99Preparationforartificialendosperm人工胚乳的制備：

MS培養(yǎng)基+淀粉水解物+激素+抗生素+農(nóng)藥+除草劑等；Anyoneelse？Section5.ResearchesonArtificialSeeds

（4）100Embedmentofartificialseeds人工種子的包埋（滴注法）胚狀體褐藻酸鈉（終濃4%）

混勻合成胚乳

Section5.ResearchesonArtificialSeeds（5）還有其他方法？10~15minCaCl2（2.0～2.5%）圓形膠囊無菌水漂洗撈起Elvax4260處理干燥圓形人工種子101人工種子的直徑由

決定；人工種子內(nèi)含胚狀體數(shù)目取決于

；人工種皮的厚度因

而定；

Section5.ResearchesonArtificialSeeds（6）102人工種子的干燥：

自然干燥人工干燥：22±2℃,相對(duì)濕度70±5%4~6d;胚狀體由玻璃狀轉(zhuǎn)為不透明表示發(fā)育成熟。Section5.ResearchesonArtificialSeeds（7）干燥的目的？103病毒對(duì)植物的危害植物哪些部位可能沒病毒或較少病毒？

植物哪些器官或部位無維管束（或維管束不發(fā)達(dá)）？切割外植體時(shí)是大些還是小些比較可能獲得無毒組織塊？組織塊大些還是小些比較容易獲得愈傷組織？第六節(jié)植物脫病毒技術(shù)（1）104脫除不同病毒時(shí)所取的莖尖大小一樣嗎？莖尖很小，實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)注意哪些問題？為什么有人喜歡用花瓣來脫病毒？哪些外因能被用于脫除病毒？通過培養(yǎng)愈傷組織能脫毒嗎？Why？哪些途徑可使脫毒植株不再染毒？第六節(jié)植物脫病毒技術(shù)（2）105第六節(jié)植物脫病毒技術(shù)（3）莖尖脫毒

1.莖尖培養(yǎng)：莖尖越小越?jīng)]病毒，但越小越難成活,一般要超過2萬個(gè)細(xì)胞，或至少3~10mg莖尖。2.花瓣培養(yǎng)3.花藥培養(yǎng)

106植物脫毒檢測(cè)（4）電鏡法免疫血清法

離心去渣植物組織勻漿上清液純化病毒

待檢植物勻漿上清液動(dòng)物免疫抗血清（抗體）免疫檢測(cè)107植物脫病毒進(jìn)展（5）脫毒馬鈴薯（青海）染有病毒的普通馬鈴薯畝產(chǎn)約1噸，脫病毒的馬鈴薯畝產(chǎn)達(dá)4噸；全國(guó)年種馬鈴薯3400萬公頃；脫毒草莓

紅寶石色，酸甜適口，果汁豐潤(rùn)，果香四溢；脫毒唐菖蒲長(zhǎng)勢(shì)旺盛，花色艷麗，品質(zhì)提高1~2個(gè)等級(jí)；脫毒水仙108Chapter3.AnimalCellEngineering

第三章動(dòng)物細(xì)胞工程Themaincontent：動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng);動(dòng)物細(xì)胞融合;動(dòng)物細(xì)胞核移植與胚胎克隆;淋巴細(xì)胞雜交瘤與單克隆抗體;染色體轉(zhuǎn)移與基因轉(zhuǎn)移;109Section1.CultivationofAnimalCellsandTissues

第一節(jié)動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞在體外條件下的保存和生長(zhǎng)，在培養(yǎng)過程中不形成組織；組織培養(yǎng)：組織在體外條件下的保存和生長(zhǎng)，繼續(xù)保持組織的結(jié)構(gòu)和功能；器官培養(yǎng)：器官的胚芽、整個(gè)器官或器官的一部分在體外條件下的保存和生長(zhǎng)，可有器官的分化，并保持器官的立體結(jié)構(gòu)和功能；110細(xì)胞系

（Cellline)原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后的細(xì)胞培養(yǎng)物，包括：有限細(xì)胞系和連續(xù)細(xì)胞系；

細(xì)胞株

（Cellstrain)通過選擇或克隆從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的培養(yǎng)物；111一.細(xì)胞培養(yǎng)Section1.Cultivationofanimalcellsandtissues第一節(jié)動(dòng)物細(xì)胞組織培養(yǎng)制備動(dòng)物細(xì)胞：

培養(yǎng)液漂洗切割解離液無菌取出目的組織無菌組織小組織塊

細(xì)胞移放培養(yǎng)瓶抗生素漂洗離心洗滌112動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)113Quantitativecultivationofmammalcells二.大量培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞微導(dǎo)管法以醋酸纖維素或硝酸纖維素構(gòu)成空心纖維管，搭成多層培養(yǎng)床。管內(nèi)通空氣，管外為培養(yǎng)液；微載體法葡萄糖等聚合物形成直徑50~500μm的微球懸浮培養(yǎng)液中細(xì)胞貼附生長(zhǎng)微膠囊法

細(xì)胞與褐藻酸鈉混合液滴入CaCl2中褐藻酸鈣膠囊懸浮培養(yǎng)114動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)器115Tissuescultivation三.組織培養(yǎng)

動(dòng)物表面消毒獲組織小組織塊

雞胚心肌組織如何培養(yǎng)？無菌刀切加培養(yǎng)液

吸放培養(yǎng)瓶

靜置培養(yǎng)（37℃）

組織塊長(zhǎng)大傳代眾多組織塊培養(yǎng)液、抗生素漂洗解剖116Generationofthecultivatedcell四.培養(yǎng)細(xì)胞的傳代

胰酶·EDTA離心培養(yǎng)細(xì)胞貼壁細(xì)胞游離

棄上清加新培養(yǎng)液

分瓶

細(xì)胞沉淀懸浮細(xì)胞培養(yǎng)117Non-serumcultivation

五.無血清培養(yǎng)血清培養(yǎng)的缺點(diǎn)：成分不確定，批次有差異，容易受污染，價(jià)格較昂貴；無血清培養(yǎng)基的組成：基礎(chǔ)培養(yǎng)基：常用DME與F12培養(yǎng)基等量混合；基質(zhì)：纖粘素，血清鋪展因子，胎球蛋白，多聚賴氨酸，膠原；生長(zhǎng)因子、維生素和激素等約30余種微量有機(jī)和無機(jī)物；118六.無血清培養(yǎng)基常用生長(zhǎng)因子與激素胰高血糖素神經(jīng)生長(zhǎng)因子胰島素甲狀腺釋放激素前列腺素E2a表皮生長(zhǎng)因子成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子前列腺素E1生長(zhǎng)激素黃體化激素釋放激素黃體化激素甲狀旁腺激素轉(zhuǎn)鐵蛋白母羊因子氫化考的松SometomedinC無脂肪酸牛血清白蛋白雌二醇孕酮促卵泡刺激因子睪酮三碘甲狀腺氨酸亞油酸維生素A醇-生育酚維生素C腐胺CdSO4H2SeO3119Keepfreefrombiologicalcontamination

七.防治污染(1)微生物污染：細(xì)菌污染；真菌污染；支原體污染；病毒污染其它細(xì)胞污染；120Keepfreefrombiologicalcontamination

七.防治污染(2)污染來源：不潔動(dòng)物標(biāo)本；空氣：操作室與超凈臺(tái)的過濾設(shè)備老化；器械滅菌不徹底；人員操作；血清；121Keepfreefrombiologicalcontamination

七.防治污染(3)污染物鑒別：肉眼觀察；光學(xué)顯微鏡觀察；電子顯微鏡觀察；特殊培養(yǎng)觀察：支原體122Keepfreefrombiologicalcontamination

七.防治污染污染源治理

細(xì)菌青霉素（200u·mL-1),鏈霉素（200μg·mL-1)真菌制霉菌素（100u·mL-1)

支原體卡那霉素（100μg·mL-1，不能根除)

病毒？

其它細(xì)胞1.同一工作面不能有其它細(xì)胞系存在；2.兩種細(xì)胞系不能共用培養(yǎng)器具；123Long-termconservationofcellculture八.細(xì)胞培養(yǎng)物的長(zhǎng)期保存?zhèn)鞔ǎ篊arrel使雞胚心細(xì)胞傳3400次，34年;液氮法：

培養(yǎng)細(xì)胞甘油/二甲亞砜（5~10%）混勻安瓿封裝細(xì)胞/安瓿降溫至-30℃（1~3℃/min）降溫至-150℃（15~30℃/min）置液氮（-196℃）中低溫保存細(xì)胞124AnabiosisofCell

細(xì)胞復(fù)蘇

取出安瓿，投入37℃水浴，輕搖，重新形成細(xì)胞懸液

（注意防護(hù)）125Section2FusionofAnimalCells第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞融合1958年，日本岡田善雄意外發(fā)現(xiàn)經(jīng)UV滅活的仙臺(tái)病毒可誘發(fā)艾氏腹水瘤細(xì)胞相互融合；1960年，法國(guó)Barski發(fā)現(xiàn)兩種不同類型細(xì)胞混合培養(yǎng)會(huì)自發(fā)形成融合細(xì)胞；1965年，岡田善雄等采用滅活的仙臺(tái)病毒融合產(chǎn)生第一個(gè)動(dòng)物種間異核體；1966年，Yerganian用相同的方法獲得能增殖的雜種細(xì)胞；126AnimalCellFusionInducedbyVirus病毒誘導(dǎo)融合雙親本細(xì)胞

滅活仙臺(tái)病毒（皰疹病毒，副黏液病毒）細(xì)胞沉淀細(xì)胞凝集

各種融合子

混勻，冰浴20min，稍搖37℃30min洗滌選擇培養(yǎng)基所需的融合子分別制懸液混合離心127CellFusionInducedbyChemicals化學(xué)誘導(dǎo)融合1974年，高國(guó)南發(fā)現(xiàn)PEG能誘導(dǎo)植物細(xì)胞原生質(zhì)體融合；1975年，Pontecorvo用PEG法融合動(dòng)物細(xì)胞成功；懸浮法

PEG400040~50%，處理1~2min;

離心法

PEG100030~40%，離心5~8min;

(可加5~15%二甲亞砜）128電激誘導(dǎo)融合

與植物原生質(zhì)體相同129ScreeningHybridCells

雜種細(xì)胞篩選抗藥篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選130ApplicationofCellFusion

細(xì)胞融合的應(yīng)用基因定位;體細(xì)胞雜種致瘤性分析;遺傳缺陷的基因互補(bǔ)研究;分化功能表達(dá)調(diào)控;131Section3Monoclonalantibodyproducedbylymphocytehybridoma

第三節(jié)淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體

抗原

記憶細(xì)胞B淋巴細(xì)胞（脾）漿細(xì)胞特異抗體

融和小鼠骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞2002年12月神舟4號(hào)飛船搭載B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞升空進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)特異抗體產(chǎn)生產(chǎn)生篩選132淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體技術(shù)示意圖133Screenofhybridoma

雜交瘤細(xì)胞的篩選(1)HGPRT基因缺陷的腫瘤細(xì)胞不能在含HAT的選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；B淋巴細(xì)胞具有HGPRT基因但不能在體外生長(zhǎng)。利用這兩種細(xì)胞各自的特點(diǎn)，篩選能在體外含HAT的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的融合子。HGPRT:次黃嘌呤核糖磷酸轉(zhuǎn)移酶HAT：次黃嘌呤，氨基喋呤，胸腺嘧啶134Screenofhybridoma

雜交瘤細(xì)胞的篩選(2)如何獲得融和細(xì)胞？如何得到單個(gè)融和細(xì)胞？鑒別是否分泌所需抗體；融和細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性；135Section4CellReconstruction&AnimalClone

第四節(jié)細(xì)胞重構(gòu)與動(dòng)物克隆

將細(xì)胞的各部件進(jìn)行重新組合裝配，主要有核移植、葉綠體移植、核糖體重建及線粒體裝配等技術(shù)。136TechniqueforAnimalClone動(dòng)物克隆技術(shù)一.細(xì)胞核移植細(xì)胞核的制備：顯微操作法細(xì)胞松弛素B處理法

細(xì)胞培養(yǎng)獲得核質(zhì)體和胞質(zhì)體

離心細(xì)胞松弛素B處理如何分離？1372.童第周、牛滿江等的魚類移核研究鯉魚囊胚期胚胎的細(xì)胞核鯽魚去核受精卵雜合細(xì)胞

成魚（口須和咽區(qū)象鯉魚，脊椎骨數(shù)象鯽魚，側(cè)線鱗片數(shù)為中間類型，血清與血紅蛋白電泳證明確為雜種魚。）部分細(xì)胞分裂

發(fā)育核移植138金魚與鰟鲏?mèng)~(亞種間）

獲中間性狀雜種魚草魚與團(tuán)頭魴(亞種間）

子代像草魚，雄性不育139牛滿江教授在海南大學(xué)作學(xué)術(shù)演講

2005年10月31日，美籍華人牛滿江教授來海南大學(xué)為該校師生們作了精彩的學(xué)術(shù)演講。

當(dāng)天還是牛滿江教授93歲大壽。牛滿江教授祖籍河北博野，1936年畢業(yè)于北京大學(xué)生物系。1953年起，發(fā)表有關(guān)核酸（RNA）誘導(dǎo)功能論文，引起生物學(xué)界的重視，成功地創(chuàng)立了“外基因?qū)W說”。140科學(xué)家發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)影響克隆魚發(fā)育新證據(jù)

中科院水生所朱作言院士發(fā)表在2005年3月美國(guó)《繁殖生物學(xué)》上的文章“細(xì)胞質(zhì)對(duì)來源于轉(zhuǎn)基因鯉魚的細(xì)胞核與金魚去核卵配合的屬間克隆魚發(fā)育的影響”報(bào)道：以轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素基因鯉魚的胚胎細(xì)胞核為供體，以金魚去核未受精卵為受體，進(jìn)行屬間克隆，在總共501枚操作卵中，得到7尾正常發(fā)育為成體魚的屬間克隆魚。克隆魚的外形特征酷似細(xì)胞核供體鯉魚而不同于受體金魚，PCR檢測(cè)和總DNA的RAPD比較分析均證實(shí)克隆魚的核基因組DNA來源于供體鯉魚；在血液循環(huán)期以前的克隆胚胎中共存著來源于供體和受體兩種類型的線粒體DNA，在其后續(xù)發(fā)育階段的克隆胚胎直至克隆魚個(gè)體中，僅存在受體細(xì)胞質(zhì)的線粒體DNA；在7尾克隆魚中，6尾個(gè)體的脊椎骨數(shù)量是26-28個(gè)，1尾個(gè)體的脊椎骨數(shù)量是31個(gè)，而通常鯉的脊椎骨數(shù)量是33～36個(gè)，金魚的脊椎骨數(shù)量是26～28個(gè)。

141Cloneofmammalian

3.哺乳動(dòng)物克隆1952年，Briggs取出蛙中胚層細(xì)胞的細(xì)胞核植入去核受精卵中，未發(fā)育；但改用囊胚期細(xì)胞核獲得部分成功；1964年，Gurdon將非洲爪蟾小腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞核取出，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，部分發(fā)育成蝌蚪；1984年，維拉特森以未成熟胚胎細(xì)胞克隆出一只活產(chǎn)羊；1421994年，菲爾斯特用120個(gè)細(xì)胞的胚胎克隆出牛；1996年，維爾穆特用羊胚細(xì)胞克隆了羊；1997年，維爾穆特用羊乳腺細(xì)胞克隆了“多莉”羊；

143Viableoffspringderivedfromfetalandadultmammalian

I.Wilmutetal.

Nature,1997,27,Feb.385(6619):810-813CelltypeNo.offusedcoupletsNo.ofrecoveredfromoviductNo.ofmorulaorblastocyststransferredNo.ofpregnancies/No.ofrecipientsNo.oflivelambMammaryepithelium277/434(63.8%)247(89.2%)29(11.7%)1/13(7.7%)1(3.4%)144Birthof“Dolly”1997年，維爾穆特用羊乳腺細(xì)胞克隆了多莉羊；

取434個(gè)綿羊乳腺細(xì)胞的細(xì)胞核與同等數(shù)量的去核卵電激融合277個(gè)融合細(xì)胞（63.8%）移入母羊輸卵管發(fā)育，成功247個(gè)（89.2%）發(fā)育到桑葚胚29個(gè)（11.7%）分別植入13只母羊子宮僅生一只“多莉”（0.23%）145“多莉（Dolly）”的身世1.從芬蘭多塞特母綿羊的乳腺中取出乳腺細(xì)胞，將其放入低濃度的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液中，細(xì)胞逐漸停止了分裂，此細(xì)胞稱之為供體細(xì)胞；2.

從一頭蘇格蘭黑面母綿羊的卵巢中取出未受精的卵細(xì)胞，并立即將其細(xì)胞核除去，留下一個(gè)無核的卵細(xì)胞，此細(xì)胞稱之為受體細(xì)胞；3.

利用電脈沖的方法，使供體細(xì)胞和受體細(xì)胞發(fā)生融合，最后形成了融合細(xì)胞，由于電脈沖還可以產(chǎn)生類似于自然受精過程中的一系列反應(yīng)，使融合細(xì)胞也能象受精卵一樣進(jìn)行細(xì)胞分裂、分化，從而形成胚胎細(xì)胞；進(jìn)行早期胚胎發(fā)育；

4.將早期胚胎轉(zhuǎn)移到蘇格蘭黑面母綿羊的子宮內(nèi)，胚胎細(xì)胞進(jìn)一步分化和發(fā)育，最后形成一只小綿羊。1461471997年2月27日，《Nature》封面，“多莉”(Dolly)克隆羊

148Basicpathwayforcloningmammalian

克隆哺乳動(dòng)物基本途徑取出體細(xì)胞核體外發(fā)育未受精卵去核易核卵早期胚胎

化學(xué)或電激誘導(dǎo)融合

產(chǎn)下幼畜假孕狀態(tài)植入代孕母畜子宮中

1493.哺乳動(dòng)物克隆1998年后，日、美、新西蘭和中國(guó)等用體細(xì)胞核克隆出鼠、牛、豬、猴、羊等哺乳動(dòng)物。2003年5月4日，美國(guó)克隆出一只騾。2003年8月6日意大利科學(xué)家宣布以自體克隆的方式克隆出一只小母馬；小母馬的“媽媽”也是其“姐姐”，也是“自己”。2003年9月，巴西科學(xué)家用意外死亡奶牛的卵泡中的顆粒細(xì)胞克隆出正常奶牛；2003年10月我國(guó)山東萊陽農(nóng)學(xué)院克隆牛“雙雙”經(jīng)人工授精，產(chǎn)下“健健”，證明克隆牛具正常生殖能力；

150自體克隆的小母馬Prometea151

美國(guó)馬薩諸塞州的生物技術(shù)公司AdvancedCellTechnology2001.11.25成功克隆出人類胚胎，在克隆人的技術(shù)上邁出了重要一步，不過該公司表示其目的不是為了克隆人，而是為了獲得能夠用于治療帕金森綜合癥和青少年糖尿病等各種疾病的干細(xì)胞。1522002年內(nèi)蒙古大學(xué)郭繼彤等用成年耳細(xì)胞克隆山羊153我國(guó)首例異種克隆北山羊誕生2004年1月21日在新疆烏魯木齊縣六十戶鄉(xiāng)降生中國(guó)首例異種克隆動(dòng)物———克隆北山羊。將北山羊的體細(xì)胞與山羊的卵母細(xì)胞結(jié)合組成新的胚胎，待胚胎發(fā)育到一定階段移植到發(fā)情的母山羊體內(nèi)?？寺”鄙窖?，雌性，出生重為2.32公斤，體長(zhǎng)42厘米，體高35厘米。在異種克隆研究領(lǐng)域，目前國(guó)際上僅有印度野牛和歐洲盤羊取得成功。154

2004年2月15日，美國(guó)愛達(dá)荷大學(xué)的研究人員在西雅圖的美國(guó)科學(xué)年會(huì)上展示三頭克隆騾子?？茖W(xué)家們從騾子胚胎細(xì)胞核內(nèi)提取細(xì)胞核，然后用移植手段將其與去核的馬卵細(xì)胞結(jié)合形成卵母細(xì)胞?？茖W(xué)家們共進(jìn)行了305次嘗試，結(jié)果只有3個(gè)克隆騾子胚胎存活。

155Heterogeneitycloningofpanda

異種克隆大熊貓中科院陳大元研究員提出如何實(shí)施？目前進(jìn)展156世界首例成年體細(xì)胞克隆水牛2005年3月17日在廣西大學(xué)“８６３計(jì)劃”良種牛南方繁殖中心誕生

這頭克隆水牛的順利出生，是國(guó)家“863計(jì)劃”、“生物反應(yīng)器”重大研究專項(xiàng)的一項(xiàng)標(biāo)志性成果，中國(guó)的水牛體細(xì)胞克隆技術(shù)已經(jīng)初步成熟。

1572005年4月24日韓國(guó)科學(xué)家培育出首只克隆狗“史納比（snuppy）”漢城大學(xué)教授黃禹錫(中)

158這次研究制造的1095個(gè)胚胎只有三個(gè)成功受孕，其中一個(gè)流產(chǎn)，另一只小狗出生22天后因肺炎死亡，只有史納比（snuppy

）仍然生存，成功率只有0.09%

159我國(guó)第一頭體細(xì)胞克隆豬誕生

經(jīng)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)李寧教授領(lǐng)導(dǎo)的課題組一年多的科技攻關(guān)，2005年8月5日，我國(guó)第一頭體細(xì)胞克隆豬終于在河北省三河成功誕生。

160意大利克隆成功14頭仔豬2005年10月29日，意大利克雷莫納繁殖技術(shù)研究中心一次性成功地克隆出了14只小豬仔161國(guó)際首例體細(xì)胞克隆亞洲黃羊臨沂降生

2005年12月8日中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所用山羊克隆的一只亞洲黃羊(左)與普通山羊一起在山東臨沂亮相。

162克隆猛犸象？猛犸象已經(jīng)消失3000多年；沒有被破壞的猛犸象細(xì)胞；猛犸象精液；163

流產(chǎn)率高；難產(chǎn)率高；畸形率高；圍產(chǎn)期死亡率高；幼年死亡率高；Worryaboutmammaliancloning哺乳動(dòng)物克隆的憂慮164PersonalClone克隆人克隆人做得到嗎？人的年齡會(huì)被克隆嗎？人的智力能被克隆嗎？克隆人的社會(huì)倫理問題;世界各國(guó)普遍反對(duì)克隆人;165克隆技術(shù)應(yīng)該應(yīng)用于哪些領(lǐng)域

——新浪網(wǎng)調(diào)查1克隆瀕臨滅絕的動(dòng)物66.32%;2克隆人類部分器官用于醫(yī)療62.11%;3克隆國(guó)家保護(hù)的動(dòng)物27.37%;4創(chuàng)造新的物種17.89%;5克隆可食用的動(dòng)物11.58%;6克隆人類用于生活7.37%;7其它5.26%

166堅(jiān)持克隆人的3位科學(xué)家意大利醫(yī)生安蒂諾里Antinori美國(guó)醫(yī)生扎沃斯Zavos邪教組織“雷利安運(yùn)動(dòng)”的法國(guó)科學(xué)家布瓦瑟利耶BrigitteBoisselier167Cloneofhumanembryo

克隆人類胚胎英國(guó)政府2004年8月向紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)頒發(fā)了世界上第一份克隆人類胚胎的合法執(zhí)照，批準(zhǔn)這所大學(xué)進(jìn)行以醫(yī)療為目的的克隆人類胚胎研究。168Section5ChromosomeTransfer

第五節(jié)染色體轉(zhuǎn)移微細(xì)胞（微核體）介導(dǎo)

微細(xì)胞(minicell)：只含有一至幾條染色體、少量細(xì)胞質(zhì)和完整質(zhì)膜的核質(zhì)體。

優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)化供體；受體細(xì)胞受影響??；染色體很少損壞或不損壞；

169Preparationforminicells

微細(xì)胞制備

秋水仙素0.1μg/mL，8~16h細(xì)胞松弛素B1μg/mL，4~6h供體細(xì)胞培養(yǎng)中期細(xì)胞大小細(xì)胞懸液12000g，10min細(xì)胞松弛素B10μg/mL，0.5~1h39000g,20min含微細(xì)胞上清液微細(xì)胞

無血清培養(yǎng)基懸浮濾膜過濾微細(xì)胞微細(xì)胞沉淀

線性梯度BSA懸浮分別離心微細(xì)胞170Fusionbetweenminicellsandacceptedcells

微細(xì)胞與受體細(xì)胞融合

微細(xì)胞（百萬個(gè)）含植物凝集素P的無血清培養(yǎng)基懸浮液受體細(xì)胞10~15min，37℃凝集吸去植物凝集素P加PEG1540（30~50%）1min

吸去PEG液無血清培養(yǎng)基洗滌3次

16~24h，37℃加完全培養(yǎng)基胰酶消化，收獲離散細(xì)胞分裝培養(yǎng)瓶選擇培養(yǎng)基篩選171DirectlyChromosomeTransfer直接轉(zhuǎn)移染色體細(xì)胞同步化與染色體分離

秋水仙素處理胰酶處理離心供體細(xì)胞

4℃，20min細(xì)胞沉淀緩沖液洗滌破壞有絲分裂器37℃，10min4℃，3000rpm,10min

針筒噴射細(xì)胞破碎液密度梯度離心染色體分離大小染色體流式細(xì)胞儀172ChromosomeTransfer

染色體轉(zhuǎn)移顯微注射法細(xì)胞直接吞噬法染色體-磷酸鈣共沉淀法染色體懸液與CaCl2（2mol/L）按16：1混勻滴入受體細(xì)胞

20min37℃,4h,CO2培育箱

加入完全培養(yǎng)基（20mL)加二甲亞砜（30%）10mL30s

加10mL新培養(yǎng)液吸去培養(yǎng)液胰酶消化收獲細(xì)胞選擇培養(yǎng)基

173Lipidsomepacking脂質(zhì)體包裝法乙醚-氯仿-染色體懸液2mL

37℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)卵磷脂-膽固醇混合液

100000g,30min棄上清染色體懸液，培養(yǎng)液脂質(zhì)體懸液脂質(zhì)體沉淀混懸液

滴加2h

受體細(xì)胞加PEG吸去各液體

24h加新鮮培養(yǎng)液選擇培養(yǎng)基混合174乙醚：氯仿=1：1107條染色體?mL-1乙醚-氯仿染色體懸液配方：175Prescriptionforchromosomesuspension

染色體懸液配方NaCl8.0gKCl0.2gK2HPO41.15gKH2PO4

0.2g無菌水定容1000mL176Section6ResearchonHumanStemCell

第六節(jié)人干細(xì)胞研究

干細(xì)胞是動(dòng)物（包括人）胚胎及某些器官中具有自我復(fù)制和多向分化潛能的原始細(xì)胞，是重建、修復(fù)病損或衰老組織、器官功能的理想種子細(xì)胞。

177EngineeringofStemCell

干細(xì)胞工程上世紀(jì)五十年代，科學(xué)家在畸形胎瘤中首次發(fā)現(xiàn)了胚胎干細(xì)胞（EmbryonicStemCell,ESC），從此開創(chuàng)了干細(xì)胞生物學(xué)研究的歷程。1970年，MartinEvans分離出小鼠胚胎干細(xì)胞并在體外進(jìn)行培養(yǎng)。接著，科學(xué)家直接從病人的身上提取某種特殊的細(xì)胞使之長(zhǎng)成皮膚、骨胳和軟骨，甚至是重要器官的一部分，這類細(xì)胞就是干細(xì)胞。1997年人的胚胎干細(xì)胞被首次培養(yǎng)成功，從而科學(xué)家開始了嘗試“定制”器官救助生命的干細(xì)胞工程，即非繁殖性克隆或治療性克隆研究。178全能性干細(xì)胞（胚胎干細(xì)胞）；多能性干細(xì)胞；專一性干細(xì)胞；

TypesofStemCells

干細(xì)胞的